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Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Liyuan, Facultad de Medicina Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología Huazhong [Aprobación nº: 2026IEC(RYJ016)]. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado, y la recogida y uso de muestras clínicas cumplieron con las directrices éticas pertinentes de la Declaración de Helsinki. Los principales materiales y instrumentos experimentales utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
Recogida de muestras clínicas de tejido y detección de la expresión de CDCP1
Se recogieron muestras de tejido quirúrgico de siete pacientes diagnosticados con carcinoma nasofaríngeo en nuestro hospital entre enero de 2019 y diciembre de 2019. Simultáneamente, se recogieron muestras de tejido nasal de seis pacientes con rinitis como controles. Todas las muestras de tejido se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido tras la recogida para su posterior extracción de ARN.
Extracción de ARN y detección cuantitativa por PCR en tiempo real
El ARN total se extrajo de muestras de tejido según las instrucciones del fabricante. Para cada muestra, se procesaron entre 50 y 100 mg de tejido sobre hielo en 1 mL de reactivo de extracción utilizando un homogeneizador de tejido. Se realizó homogeneización durante 30 segundos y se repitió 3 veces para asegurar la completa alteración del tejido. Tras la ruptura tisular, cada lisado recibió 200 μL de cloroformo. Los tubos se agitaban vigorosamente mediante vórtices durante 15 s, se mantenían a temperatura ambiente durante 3 minutos y luego se giraban a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para separar las fases. La capa acuosa transparente se retiró sin alterar la interfase y se transfirió a un nuevo tubo.
El ARN se recuperaba de esta fracción acuosa añadiendo isopropanol en una proporción de volumen de 1:1. Tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C para granular el ARN. El sobrenadante se descartó y la pelota se enjuagó una vez con 1 mL de etanol al 75%. Tras un segundo paso de centrifugación a 7.500 × g . durante 5 minutos a 4 °C, se retiraba el lavado con etanol. El pellet de ARN se secó al aire durante 5–10 minutos a temperatura ambiente y se resuspendió en 20 μL de agua libre de RNasa. La cantidad y pureza del ARN se determinaron espectrofotométricamente.
Para la preparación de ADNc, se utilizó 1 μg de ARN total para la transcripción inversa. La reacción se realizó a 37 °C durante 15 minutos y luego se calentó a 85 °C durante 5 segundos. Posteriormente se realizó PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) con TB Green Premix Ex Taq II en un sistema de PCR en tiempo real. Cada reacción de 20 μL contenía 2 μL de plantilla de ADNc, cebadores directos y inversos a 0,4 μmol/L cada uno, 10 μL de premezcla verde SYBR y agua libre de nucleasa. El protocolo de amplificación comenzó con la desnaturalización a 95 °C durante 30 s. A esto le siguieron 40 ciclos, con cada ciclo compuesto por 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s para recocido/extensión. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1.
Detección inmunohistoquímica de la expresión de proteínas CDCP1
Las muestras de tejido se fijaron primero en paraformaldehído al 4% durante 24 horas, seguidas de deshidratación estándar, incrustación de parafina y preparación de secciones de 4 μm de grosor. Las secciones de parafina se trataron luego con xileno para eliminar la parafina y se rehidrataron secuencialmente mediante soluciones de etanol graduadas. Para el desenmascaramiento de antígenos, las láminas se colocaron en un tampón de citrato (pH 6,0) y se calentaron en una olla a presión durante 3 minutos después de que la solución alcanzara la ebullición. La actividad endógena de la peroxidasa se redujo exponiendo las secciones al 3% de peróxido de hidrógeno durante 10 minutos.
Tras bloquear la actividad enzimática endógena, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C, diluyendo el anticuerpo primario anti-CDCP1 a 1:200. Al día siguiente, las láminas fueron tratadas con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 30 minutos a temperatura ambiente. La visualización de señales se realizó utilizando un kit de sustrato DAB, y posteriormente las secciones se contrateñieron con hematoxilina. Finalmente, las láminas fueron deshidratadas, montadas y examinadas bajo un microscopio óptico.
Cultivo celular y agrupación
Las células de carcinoma nasofaríngeo humano CNE2 y HK1 se mantuvieron en DMEM de alta glucosa, suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% penicilina-estreptomicina. Las células se cultivaron a 37 °C en una incubadora que contenía un 5% de CO₂. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 70%–80%, se transfectaron según los siguientes grupos: Grupo de control (Control): transfectado con vector vacío o SIRNA de control negativo; Grupo de sobreexpresión CDCP1 (CDCP1-OE): transfectado con plásmido de sobreexpresión CDCP1 ; Grupo silenciador CDCP1 (si-CDCP1): transfectado con siRNA CDCP1 ; Grupo experimental de rescate (CDCP1-OE + U0126): tratado con el inhibidor específico de ERK1/2 U0126 (10 μmol/L) durante 48 horas basándose en la sobreexpresión de CDCP1 .
La transfección se realizó según las instrucciones del fabricante. Las células se emplacaron 24 horas antes de la transfección en placas de 6 pozos a 2 × 10 célulasde 5 pozos, con cada pozo conteniendo 2 mL de medio libre de antibióticos. La transfección comenzó cuando los cultivos alcanzaron aproximadamente el 70% de confluencia. Luego se retiraba el medio de cultivo y se reemplazaba por un medio fresco sin suero. Para cada pozo, se preparó 2 μg de ADN plasmídico o 100 pmol de siRNA por separado de 5 μL de reactivo de transfección, diluyendo cada componente en 250 μL de medio reducido que contiene suero. Ambas mezclas se mantuvieron a temperatura ambiente durante 5 minutos. El ácido nucleico diluido y el reactivo de transfección se combinaron y se dejaron reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente para generar los complejos de transfección. Estos complejos se añadieron a las células en forma de caída, se distribuyeron suavemente por el pozo e incubaron con las células durante 6 horas. Una vez completado el periodo de incubación, se retiraba la mezcla de transfección y se suministraba a las células un medio completo que contenía un 10% de FBS.
Ensayo de proliferación celular
A las 48 horas tras la transfección, se recogieron y sembraron las células CNE2 y HK1 de cada grupo en placas de 96 pozos con una densidad de 3 × 103 células por pozo con 100 μL de medio por pozo, con cinco pozos replicados por grupo. Tras cultivar las células durante 24, 48 o 72 horas, se añadieron 10 μL de solución de MTT a 5 mg/mL a cada pozo. Las placas se incubaron de nuevo a 37 °C con un 5% de CO₂ durante otras 4 horas. Tras esta incubación, el sobrenadante del cultivo se descartó cuidadosamente y se añadieron 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada pozo para disolver los cristales de formazan. Las placas se agitaron durante 10 minutos para asegurar la disolución completa. La absorbancia se registró entonces con un lector de microplacas a 570 nm, usando 630 nm como longitud de onda de referencia.
Ensayo de actividad de apoptosis
A las 48 horas tras la transfección, se recogieron células CNE2 de cada grupo y se detectó actividad de Caspasa-3 utilizando un Kit de Ensayo de Actividad Caspasa-3 según las instrucciones del fabricante. Se añadieron un total de 100 μL de tampón de lisis a 1 × 106 celdas, se lisaron sobre hielo durante 15 minutos y luego centrifugaron a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante resultante fue transferido para su posterior análisis. Para el ensayo de Caspasa-3, cada pozo recibió 50 μL de tampón de reacción y 5 μL de sustrato de Caspasa-3 (DEVD-pNA). La placa se mantuvo entonces a 37 °C durante 2 horas, y la absorbancia se midió a 405 nm con un lector de microplacas.
Análisis de Western blot
A las 48 horas de la transfección, se extrajeron células CNE2 y HK1 de cada grupo experimental para la extracción de proteínas. Las células fueron alteradas en un tampón RIPA que contiene inhibidores de proteasas y se mantuvieron en hielo durante 30 minutos. Los lisados resultantes se centrifugaron a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C, tras lo cual se recogieron las fracciones sobrenadantes. La concentración de proteínas se midió con un kit de análisis de proteínas BCA.
Para el análisis western blot, se mezclaron 30 μg de proteína total de cada muestra con 5x cargas de tampón y se calentaron a 100 °C durante 10 minutos para desnaturalizar las proteínas. Las muestras se separaron en geles SDS-PAGE al 10% a 120 V durante 90 minutos, seguido de transferencia a membranas PVDF a una corriente constante de 300 mA durante 90 minutos. Tras la transferencia, las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente.
Las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra CDCP1 (1:1.000), E-cadherina (1:1.000), Vimentina (1:1.000), p-ERK1/2 (1:2.000), ERK1/2 (1:1.000) y GAPDH (1:5.000).
Al día siguiente, las membranas se enjuagaron con TBST 3 veces, con una duración de 10 minutos en cada lavado. Luego se expusieron durante 1 hora a anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante a temperatura ambiente. Tras tres lavados adicionales de TBST, las señales proteicas se visualizaron utilizando un sustrato de quimioluminiscencia ECL. La intensidad de la banda se midió con el software ImageJ y se utilizó GAPDH como control de normalización.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron de forma independiente 3 veces. Los resultados se presentan como la media ± desviación estándar (DS). Las diferencias entre múltiples grupos se evaluaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), y se utilizó el método de Tukey para comparaciones post hoc por pares. Se consideró estadísticamente significativo un valor P de < 0,05.