El análisis transcriptómico revela subgrupos impulsados por mitocondriales en lesiones de dermatitis atópica

Yingyao Yu; Yuanyuan Shang; Xinhong Ge; Lingdi Dong; Kexin Li

doi:10.3791/70240

Research Article

El análisis transcriptómico revela subgrupos impulsados por mitocondriales en lesiones de dermatitis atópica

DOI:

10.3791/70240

⸱

May 26th, 2026

Yingyao Yu¹ , Yuanyuan Shang¹ , Xinhong Ge¹ , Lingdi Dong¹ , Kexin Li¹

¹Department of Dermatology, General Hospital of Ningxia Medical University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La dermatitis atópica (EA) es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel con una heterogeneidad molecular significativa. Este estudio identifica dos subgrupos transcriptómicamente distintos de la EA, impulsados por la expresión diferencial mitocondrial y la infiltración inmunitaria, y revela cuatro genes hub como posibles biomarcadores para la estratificación del paciente.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La dermatitis atópica (EA) es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel común y con prevalencia global. Su heterogeneidad clínica y sus complejos mecanismos moleculares suponen desafíos significativos para el desarrollo de terapias eficaces. Explorar la heterogeneidad molecular de la EA utilizando datos transcriptómicos de la piel lesional, caracterizar sus perfiles biológicos e inmunitarios, e identificar genes clave subyacentes a la diferenciación. Se identificaron genes expresados diferencialmente usando DESeq2, seguidos de análisis de vía y coexpresión mediante GSEA y WGCNA, respectivamente. Genes relacionados con mitocondriales se extrajeron mediante la intersección de DEGs y módulos WGCNA con la base de datos MitoCarta3.0, y su relevancia funcional se evaluó mediante enriquecimiento GO y KEGG. Los genes hub fueron identificados mediante análisis de redes de interacción proteína-proteína, que posteriormente se utilizaron para construir un modelo de clasificación. Se predijeron reguladores transcripcionales usando hTFtarget, mientras que la infiltración de células inmunitarias se cuantificó usando CIBERSORT. Se identificaron dos subgrupos moleculares. El Clúster 1 se enriqueció en vías de señalización celular y adhesión, mientras que el Clúster 2 mostró regulación al alza de la fosforilación oxidativa y procesos relacionados con los proteasomas. Un total de 85 genes asociados a mitocondriales, principalmente implicados en el metabolismo energético, se expresaron de forma diferencial entre grupos. El análisis de redes de IBP identificó cuatro genes hub (BAD, BOLA1, CHCHD5 e ISOC2), que estaban significativamente regulados al alza en el Clúster 1. Un clasificador basado en genes hub demostró un fuerte poder discriminatorio (área bajo la curva > 0,7). Los principales reguladores transcripcionales previstos incluyeron ATF3, BRD2, BRD4 y CEBPA. El perfilado inmunitario reveló una mayor infiltración de células T reguladoras en el Clúster 1 y un aumento de las células T auxiliares foliculares en el Clúster 2. Este estudio revela dos subtipos de EA molecular e inmunológicamente distintos, caracterizados por una función mitocondrial diferencial y firmas de microambientes inmunitarios.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La dermatitis atópica (EA) es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel que afecta hasta el 20% de los niños y el 10% de los^adultos. Se caracteriza por un picor intenso y lesiones eczematosas^recurrentes. Clínicamente, la EA surge de una interacción dinámica entre la susceptibilidad poligénica (por ejemplo, mutaciones de pérdida de función en la GFL), la desregulación inmune y exposiciones ambientales como baja humedad y disbiosis^{microbiana 3}. Aunque la EA comparte algunas características fisiopatológicas con la psoriasis, sus presentaciones clínicas son mutuamente excluyentes, con diferentes efectos genéticos en vías compartidas y alteraciones inmunitarias^{distintas 4}.

La EA es una enfermedad heterogénea, caracterizada por perfiles transcriptómicos diversos en diferentes grupos de pacientes y síntomas de la enfermedad^. Análisis integrados de tejidos cutáneos y células mononucleares de la sangre periférica han demostrado que características clínicas como el eritema y la papulación están asociadas a firmas inmunológicas distintas, reflejando la interacción entre las respuestas inmunitarias locales de la piel^{y sistémicas 6}. Los estudios transcriptómicos a gran escala destacan aún más el papel de las vías de IL-13 en la patogénesis de la EA, mientras que la EA muestra una mayor heterogeneidad molecular que la psoriasis, con variaciones en los patrones de expresión génica vinculadas a la gravedad de la enfermedad, la edad de inicio y el fondo^genético ^5,7. Estas diferencias subrayan la complejidad de la patogénesis de la EA y la necesidad de enfoques personalizados en la investigación y la terapia.

Las proteínas mitocondriales desempeñan un papel importante en la patogénesis de la EA mediante el estrés oxidativo desregulado y las vías metabólicas. Los estudios revelan un aumento de la actividad de los complejos mitocondriales I y II en queratinocitos no lesionales de la EA, lo que provoca una oxidación excesiva de ácidos grasos de cadena larga y una producción elevada de ROS, lo que incrementa la disfunción de la barrera epidérmica ^8,9. Simultáneamente, los análisis proteómicos identifican proteínas reducidas de la vía antioxidante NRF2 y componentes mitocondriales en la epidermis de la EA, reduciendo la resolución de estrés^{oxidativo 10}. El daño al ADN mitocondrial contribuye además a las respuestas inflamatorias, mientras que intervenciones como el uso de antioxidantes dirigidos a mitocondrias demuestran eficacia en la restauración de la homeostasis epidérmica al mitigar^{ROS 11,12}. Estos hallazgos subrayan las proteínas mitocondriales como tanto motores de la patología del EA como posibles objetivos terapéuticos.

Los análisis recientes de transcriptomas de la EA han avanzado significativamente la comprensión de su arquitectura genética y heterogeneidad molecular. El primer perfilado de secuenciación de ARN de la EA reveló el aumento de la expresión en la vía TREM-1 y en la citocina^{IL-36 13}. El análisis ponderado de la red de coexpresiones génicas basado en el perfil de expresión génica ha revelado además módulos moleculares distintos y genes centrales, como HSPA4, LCE3E y LCE3D, que orquestan respuestas inflamatorias y queratinización, destacando posibles objetivos^{terapéuticos 14}. Estos estudios subrayan el valor de la transcriptómica multitisular y la modelización poligénica del riesgo para refinar la predicción de enfermedades y descubrir los complejos fundamentos de la EA. Sin embargo, los estudios existentes se han centrado predominantemente en la transcriptómica global de la EA sin resolver específicamente el papel de los genes mitocondriales en la definición de subgrupos moleculares. El presente estudio avanza más allá de los análisis transcriptómicos previos al integrar múltiples conjuntos de datos GEO para identificar subgrupos de AD basados en agrupaciones por consenso y intersectar sistemáticamente genes expresados de forma diferencial, módulos WGCNA y un catálogo de genes mitocondriales seleccionados para localizar genes mitocondriales núcleo que definen la identidad de subgrupos y que pueden servir como biomarcadores novedosos.

Con la hipótesis de que la piel lesional de la EA alberga subgrupos transcriptómicos molecularmente distintos caracterizados por expresión diferencial de genes mitocondriales, que podrían fundamentar la heterogeneidad clínica del EA. Para comprobar esto, este estudio integró datos de secuenciación de ARN de estudios publicados y recogió datos de expresión génica de muestras de piel de lesiones de 266 pacientes con EA. Se identificaron subgrupos moleculares basándose en agrupaciones consensuadas de la expresión génica, y la expresión génica se comparó entre los dos subgrupos moleculares. Los genes que impulsan esta diferencia muestran un enriquecimiento funcional en la señalización celular y la fosforilación oxidativa. Además, se examinaron genes mitocondriales que diferencian los dos grupos moleculares y se identificaron los genes clave dentro de una red de interacción proteína-proteína. Estos hallazgos ponen de manifiesto la heterogeneidad genética de la enfermedad por EA y amplían el conocimiento sobre el papel de las proteínas mitocondriales en la patología de la EA.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio utilizó conjuntos de datos de expresión génica disponibles públicamente de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO). No se accedió a datos identificables por los pacientes ni se recogieron nuevas muestras de pacientes. Por lo tanto, no se requirió la aprobación ni el consentimiento del paciente por parte del comité de revisión institucional (IRB) para este análisis secundario de datos públicos disponibles. El software y las bases de datos utilizadas se enumeran en la Tabla de Materiales.

1 Datos y recursos

Los datos transcriptomáticos de pacientes con dermatitis atópica (EA) se obtuvieron de la base de datos GEO, incluyendo cuatro estudios: GSE121212 (N = 55)⁵, GSE157194 (N = 57)¹⁵, GSE193309 (N = 111)¹⁶ y GSE277961 (N = 43)¹⁷. Todos los conjuntos de datos contenían datos en bruto o prenormalizados de biopsias cutáneas lesionales. Se descargaron e integraron matrices de recuento en bruto entre estudios. Los efectos de lotes de estudios cruzados se corrigieron utilizando el método ComBat-seq (paquete sva R, v3.44.0) para armonizar los perfiles de expresión entre los cuatro conjuntos de datos GEO antes del análisis posterior. Los cuatro conjuntos de datos se basan en RNA-seq realizado en muestras de biopsia de piel humana y se alinearon con el genoma de referencia humano GRCh38 utilizando pipelines específicos de estudio. La cuantificación de la expresión a nivel génico se realizó utilizando la anotación génica Ensembl (v105).

2 Agrupamiento por consenso

Se realizó un agrupamiento consensuado no supervisado utilizando el paquete Consensus ClusterPlus R (v1.64.0)¹⁸ para estratificar 266 muestras de piel lesional de pacientes con EA basándose en perfiles transcriptómicos. Antes del agrupamiento, los datos brutos de conteo de todos los estudios se fusionaron y los efectos de lotes de estudios cruzados se corrigieron usando la función removeBatchEffect del paquete limma. Los datos de expresión génica se transformaron entonces mediante estabilización de varianzas (VST) usando DESeq2 y se filtraron para conservar los 5.000 genes más variables principales. El agrupamiento se realizó mediante agrupamiento jerárquico con correlación de Pearson y enlace promedio en 1.000 iteraciones, submuestreando el 80% de las muestras por iteración. El mejor número de conglomerados (k varía de 2 a 10) se determinó evaluando la función de distribución acumulada por consenso (CDF), los gráficos de área delta y las puntuaciones de consenso por concierto. Los grupos resultantes fueron validados mediante mapas de calor consensuados y PCA, y se emplearon en análisis biológicos y clínicos posteriores.

3 Análisis diferencial de expresión génica

Los niveles de expresión génica se compararon entre subgrupos moleculares utilizando el paquete DESeq2 R (v1.46.0)¹⁹. Se introdujeron datos en bruto para estimar la dispersión génica y ajustarse a un modelo binomial negativo. Se identificaron genes (DEGs) expresados diferencialmente mediante la prueba de Wald, y los resultados se filtraron usando un umbral de significación de valor p ajustado < 0,01 y un cambio absoluto de log2 multiplicado > 1.

4 Análisis de enriquecimiento de conjuntos génicos

El análisis de enriquecimiento de conjuntos génicos (GSEA) se realizó utilizando el paquete clusterProfiler R (v4.12.6)²⁰. Todos los genes se ordenaron según su cambio log2 multiplicado por el análisis de expresión diferencial, y la función GSEA se aplicó con parámetros eps = 0, minGSSize = 10 y maxGSSize = 500, mientras que otros ajustes se mantuvieron por defecto. El enriquecimiento se realizó contra los conjuntos genéticos MSigDB Hallmark. Para cada cúmulo molecular (Clúster 1 y Clúster 2), se seleccionaron las tres vías enriquecidas más altas en función del valor p nominal y la puntuación de enriquecimiento normalizado (NES). Los resultados se visualizaron utilizando el paquete GseaVis R (v0.1.0)²¹.

5 Análisis de redes de coexpresión génica ponderada

El WGCNA se realizó en el perfil de expresión génica de pacientes con EA para identificar módulos de co-expresión génica asociados a la identidad de subtipo transcriptómico utilizando el paquete R WGCNA (v1.73)²². Los genes fueron filtrados para conservar el 75% superior con la mayor varianza en todas las muestras. Se construyó una red de coexpresiones con signo utilizando una potencia de umbral suave seleccionada de 1 a 30 para aproximar una topología libre de escala. Los módulos génicos se identificaron mediante agrupamiento jerárquico y corte dinámico de árboles. Se estudiaron las asociaciones módulo-rasgo correlacionando los autogenes de módulo coexpresados con las etiquetas de subtipos moleculares, y se seleccionaron módulos que mostraran correlación significativa (p < 0,05) con subtipos moleculares para análisis posteriores.

6 Proteínas mitocondriales en subgrupos moleculares de la Alzheimer

Para identificar genes asociados a mitocondrias dentro de los módulos DEG y WGCNA, estos conjuntos de genes se solaparon con la lista seleccionada de proteínas mitocondriales de MitoCarta3.0-23. Los genes que se intersectaban se consideraron proteínas mitocondriales supuestas relevantes para el contexto de la enfermedad de la EA.

7 Ontología génica y análisis de enriquecimiento KEGG

Identificar las principales funciones celulares y procesos biológicos que diferencian los subgrupos moleculares. Se realizaron análisis de enriquecimiento GO y KEGG para genes asociados a mitocondrias utilizando clusterProfiler. El enriquecimiento GO se realizó por separado para las categorías de Proceso Biológico (BP), Componente Celular (CC) y Función Molecular (MF) utilizando la función enrichGO con OrgDb = "org. Hs.eg.db", ont = "TODO" y parámetros por defecto. El enriquecimiento de la vía KEGG se realizó utilizando la función enrichKEGG con el organismo configurado en "has". Se consideraron significativos términos enriquecidos con un valor p ajustado < 0,05.

8 Redes de interacción proteína-proteína

Los 85 DEGs y los genes mitocondriales superpuestos del módulo asociado al EA fueron consultados en la base de datos STRING (https://string-db.org)²⁴ para obtener IBPs conocidos y predichos. El análisis de topología de redes se realizó utilizando siete medidas (Grado, Cercanía, Intermediedad, Vector Propio, PageRank, Hub y Autoridad) para clasificar la importancia del nodo de cada proteína. Se seleccionaron los 30 genes mejor clasificados de cada medida y las intersecciones entre los siete enfoques se visualizaron mediante un gráfico UpSet. Los 4 genes intersectantes de las medidas se utilizaron para construir un modelo de clasificación basado en sus niveles de expresión génica. Se calcularon la precisión, sensibilidad, especificidad y área del modelo bajo la curva ROC (AUC) para evaluar el rendimiento en la clasificación.

9 Análisis de la regulación transcripcional

Se consultó la base de datos hTFtarget (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)²⁵ para recuperar interacciones TF-objetivo soportadas experimentalmente para cuatro genes hub que se intersectan. La red reguladora resultante del gen TF fue construida y visualizada utilizando los encapsulados R igraph²⁶ y ggraph²⁷ .

10 Análisis de infiltración de células inmunitarias de ARN-seq en bulk

El algoritmo CIBERSORT²⁸ (https://cibersort.stanford.edu/) se utilizó para estimar las proporciones relativas de 22 tipos de células inmunitarias en datos de transcriptoma cutáneo lesional. Los datos normalizados de expresión génica se introdujeron en el CIBERSORT (v0.1.0) junto con la matriz de firma LM22. El análisis se realizó con 1.000 permutaciones y la normalización de cuantiles deshabilitada. Se consideraron muestras con valores p de salida CIBERSORT < 0,05 para análisis posteriores. Las fracciones estimadas de células inmunitarias se compararon entre subgrupos moleculares utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon con corrección FDR para comparaciones múltiples entre los 22 tipos de células inmunitarias (p.adjust.method = "FDR"), y los resultados se visualizaron con diagramas de caja usando el paquete ggplot2²⁹ R.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Subgrupos transcripcionales en la dermatitis atópica

Se analizaron datos de ARN-seq de 266 muestras de pacientes con EA para investigar la heterogeneidad transcripcional dentro de la enfermedad. Tras el control de calidad y la corrección para efectos de lotes en múltiples estudios, el agrupamiento consensuado no supervisado reveló dos subgrupos moleculares distintos (Figura 1A). La estabilidad del cúmulo y el número óptimo de conglomerados se evaluaron utilizando el gráfico de función de distribución acumulada (CDF) (Figura 1B), el gráfico del área delta (Figura 1C) y el mapa de calor de la matriz de consenso (Figura 1D). En conjunto, estos resultados apoyan la existencia de dos subtipos transcripcionales robustos en la EA, reflejando la heterogeneidad genética subyacente.

Genes expresados de forma diferencial entre subgrupos de la EA

El gráfico t-SNE basado en la matriz de expresión génica normalizada validó aún más los subgrupos transcripcionales identificados por agrupación por consenso. El gráfico t-SNE reveló dos grupos bien separados, cada uno correspondiente a uno de los subgrupos previamente definidos (Figura 2A), que apoyan la presencia de perfiles moleculares distintos entre los pacientes con EA. La expresión diferencial entre ambos subgrupos se analizó entonces usando DESeq2, con un umbral de p < ajustado de 0,01 y |log₂ de cambio de plegamiento| > 1. El gráfico volcánico resultante (Figura 2B) mostró genes (DEGs) expresados diferencialmente, indicando una fuerte divergencia transcripcional. Los 10 genes más regulados al alza son ABHD2, ADAR, ADCY3, ADCY9, ADD1, ADIPOR2, AFF1, AGFG1, AGRN y AHNAK en el grupo 1 y C2orf68, CTTN, GPR108, HERPUD1, LRPAP1, MAP1LC3B2, NKIRAS2, NR1H2, PDE5D y PMPCA en el grupo 2 (Figura 2C).

Conjunto génico asociado al subgrupo de la EA

El Análisis de Enriquecimiento de Conjuntos Génicos (GSEA) reveló perfiles de enriquecimiento funcional distintos entre los dos clústeres transcriptómicos (Figura 3A). El grupo 1 mostró un enriquecimiento significativo para las vías implicadas en la señalización y adhesión celular, incluyendo la adhesión focal (Figura 3B) y la vía de señalización MAPK (Figura 3C), lo que sugiere un estado activo caracterizado por una mejora en las interacciones y proliferación célula-célula-matriz extracelular. En contraste, el Clúster 2 mostró un fuerte enriquecimiento para la fosforilación oxidativa (Figura 3D) y la función del proteasomo (Figura 3E), lo que sugiere un fenotipo metabólico activo oxidativo y proteolítico.

Genes coexpresados en grupos moleculares de la EA

Para identificar módulos de coexpresión asociados a subtipos transcriptómicos, se realizó WGCNA tras el preprocesamiento de datos. Las muestras atípicas se identificaron y eliminaron primero basándose en agrupaciones jerárquicas de distancias muestrales para asegurar la robustez de la construcción de redes aguas abajo (Figura 4A). A continuación, se seleccionó una potencia de umbral suave usando el criterio de topología libre de escala, eligiendo una potencia de 6 para lograr un R² > 0,85 libre de escala (Figura 4B). Los módulos génicos se identificaron mediante agrupamiento jerárquico y corte dinámico de árboles, seguidos por agrupamiento de autogenes para fusionar módulos estrechamente relacionados (Figura 4C y Figura 4D). La red génica resultante se visualizó utilizando un mapa térmico de solapamiento topológico, confirmando la presencia de patrones de coexpresión génica distintos (Figura 4E). El análisis de la relación módulo-rasgo reveló una correlación fuerte y significativa entre el módulo MEyellow (_gen N = 743) y el subgrupo molecular (Figura 4F).

Enriquecimiento funcional del subgrupo de la EA asociados a genes mitocondriales

Posteriormente se realizó un análisis de enriquecimiento GO y KEGG sobre los genes intersectados (N = 85) entre los DEGs, los genes del módulo MEyellow y una lista de proteínas mitocondriales de MitoCarta3.0 (Figura 5A) para investigar los roles funcionales de los genes asociados a mitocondrias que impulsan las diferencias transcripcionales entre grupos. El análisis de las vías KEGG identificó el enriquecimiento en la fosforilación oxidativa y las vías metabólicas (Figura 5B). El análisis de enriquecimiento GO reveló una sobrerrepresentación significativa de términos asociados a la función mitocondrial, incluyendo la síntesis de ATP mitocondrial impulsada por la fuerza motriz de protones, el complejo de cadenas respiratorias y la actividad deshidrogenasa de NADH (Figura 5C), lo que sugiere que estos genes están principalmente asociados con el metabolismo y la regulación energética mitocondrial.

Genes mitocondriales hub en la diferenciación molecular de la EA

Para identificar los genes clave en los 85 genes asociados al subgrupo del transcriptoma mitocondrial, se construyó una red de IBP (Figura 6A). Basándose en la clasificación en cada una de las siete medidas topológicas (véase métodos), se seleccionaron los 30 genes principales y sus intersecciones se analizaron y visualizaron en un gráfico UpSet (Figura 6B). Este análisis dio lugar a cuatro genes hub identificados consistentemente como nodos centrales basados en todos los criterios de clasificación (BAD, BOLA1, CHCHD5, ISOC2). Sus perfiles de expresión se examinaron en los dos grupos transcriptómicos y se encontró que los cuatro genes hub estaban significativamente regulados al alza en el Clúster 1 en comparación con el Clúster 2 (Figura 6C). El análisis de correlación de expresión génica por pares mostró correlaciones positivas entre los cuatro genes, indicando regulación coordinada, siendo CHCHD5 e ISOC2 las que mostraron la correlación más fuerte (Figura 6D). Además, un modelo de clasificación que construimos utilizando la expresión de estos cuatro genes demostró un poder discriminatorio robusto entre los dos grupos, con la curva ROC mostrando un área bajo la curva (AUC) > 0,7 (Figura 6E). Además, se realizó un análisis de redes reguladoras por factores de transcripción (TF) para estudiar los mecanismos reguladores que rigen la expresión de los cuatro genes hub identificados. Todos los factores de transcripción conocidos y predichos que potencialmente regulan estos genes hub fueron consultados desde hTFtarget, y los resultados se integraron y visualizaron como una red reguladora transcripcional (Figura 7). En la red reguladora de genes núcleo de TF, BAD tenía el mayor número de TFs, y ATF3, BRD2, BRD4 y CEBPA interactuaban con los cuatro genes hub, lo que sugiere un mecanismo regulador compartido.

Comparación de la infiltración de células inmunitarias entre subgrupos de la EA

Para investigar el panorama inmunológico asociado a los subgrupos transcriptómicos, se realizó un análisis de infiltración de células inmunitarias utilizando CIBERSORT, que estima las proporciones relativas de 22 tipos de células inmunitarias basándose en datos de transcriptoma global (Figura 8). Entre los subconjuntos inmunitarios, se encontró que las células T reguladoras (Tregs) eran significativamente más abundantes en el Clúster 1, lo que sugiere un microambiente inmunosupresor potencialmente asociado con actividad mitocondrial y vías de señalización reguladas al alza en este grupo. En cambio, las células T auxiliares foliculares estaban significativamente enriquecidas en el Clúster 2, lo que indica una posible respuesta inmune adaptativa más activa en este subgrupo.

DISPONIBILIDAD DE DATOS:

Los datos transcriptómicos analizados en este estudio están disponibles públicamente en el repositorio Gene Expression Omnibus (GEO) bajo los números de acceso GSE121212, GSE157194, GSE193309 y GSE277961 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

figure-results-1
Figura 1: Agrupación consensuada de muestras de lesión de dermatitis atópica basada en perfiles transcriptómicos. (A) Mapa de calor y agrupamiento jerárquico de la matriz de consenso entre muestras de dermatitis atópica (DA). (B) Gráfico de función de distribución acumulativa (CDF) por consenso utilizado para determinar el número óptimo de conglomerados (k = 2–10). (C) Gráfico del área delta que muestra el cambio relativo en el área bajo la curva CDF para cada k. (D) Asignación consensuada del conglomerado para k = 2. Cada columna representa una muestra individual, y los colores indican la pertenencia al grupo (Clúster 1, rojo; Racimo 2, verde azulado). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Expresión diferencial de genes de subtipos moleculares de dermatitis atópica. (A) gráfico de incrustación de vecinos estocásticos t-distribuidos (t-SNE) de muestras de AD. Cada punto representa una muestra proyectada en dos dimensiones y se colorea según la asignación de clústeres. (B) Gráfico volcánico de genes (DEGs) diferencialmente expresados entre el Clúster 1 y el Clúster 2. Cada punto representa un gen, representado por el cambio de pliegue log2 (eje x) y el valor p ajustado de −log10 (eje y). Los puntos rojos y azules indican genes significativamente alzados en el Clúster 1 y el Clúster 2, respectivamente, mientras que los puntos grises indican genes no significativos. (C) Mapa de calor de los 10 genes más expresados en el Clúster 1 y el Clúster 2. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Análisis de enriquecimiento de conjuntos génicos de subtipos moleculares de dermatitis atópica. (A) Gráfico de barras bilaterales que muestra los resultados GSEA entre el Clúster 1 y el Clúster 2, con las vías superiores significativamente enriquecidas. Las vías enriquecidas en el Grupo 1 se muestran a la derecha, y las enriquecidas en el Grupo 2 a la izquierda. (B–E) Gráficos representativos de enriquecimiento para adhesión focal, vía de señalización MAPK, fosforilación oxidativa y vías de proteasomas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Análisis ponderado de la red de coexpresión génica de muestras de dermatitis atópica. (A) Dendrograma de agrupación de muestras basado en perfiles de expresión génica. (B) Índice de ajuste de topología libre de escala y conectividad media a través de potencias de umbral suave (1–30). (C) Agrupamiento y mapa de calor de los eigengenes de los módulos, con colores que indican correlaciones por pares. (D) Dendrograma de agrupamiento jerárquico que muestra genes agrupados en módulos coexpresados. (E) Mapa de calor de la matriz de solapamiento topológica (TOM), que representa la similitud de coexpresións entre pares de genes. (F) Mapa de calor de las relaciones módulo–rasgo, mostrando correlaciones entre los eigengenes del módulo y los rasgos clínicos. Los coeficientes de correlación se muestran dentro de cada celda, y la intensidad del color indica la intensidad y dirección de la correlación (rojo, positivo; azul, negativo). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-5
Figura 5: Ontología génica y enriquecimiento de genes mitocondriales asociados a subtipos en la vía KEGG. (A) Diagrama de Venn que muestra la superposición entre DEGs, genes módulos asociados a subtipos y genes mitocondriales. (B) Gráfico de burbujas de las 20 principales vías enriquecidas KEGG de genes que se intersectan. (C) Los 10 términos principales de la Ontología Génica Enriquecida (GO) para Proceso Biológico (BP), Componente Celular (CC) y Función Molecular (MF). Todos los análisis de enriquecimiento se realizaron utilizando un valor p ajustado < 0,05 (tasa de descubrimiento falso) como umbral de significación. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-6
Figura 6: Análisis de interacción proteína-proteína e identificación de genes hub. (A) Red de interacción proteína-proteína (PPI) de 85 genes que se intersectan. Los nodos representan proteínas, y los bordes indican interacciones predichas o validadas experimentalmente a partir de la base de datos STRING. (B) Gráfico UpSet que muestra las intersecciones entre los 30 genes más clasificados basándose en siete medidas de centralidad de red. (C) Diagramas de caja que muestran los niveles de expresión de cuatro genes hub en el Clúster 1 y el Clúster 2. (D) Análisis de correlación por pares entre los cuatro genes hub. (E) Curva de característica de funcionamiento del receptor (ROC) que muestra el rendimiento de clasificación, con la sensibilidad graficada en función de la especificidad. El área bajo la curva (AUC) indica precisión general. La significación estadística en el panel (C) se evaluó utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (*p < 0,05). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-7
Figura 7: Red reguladora de genes centrales. Los círculos rojos representan los genes hub y los círculos azules representan factores de transcripción (TFs) asociados. Los bordes indican interacciones regulatorias. El tamaño de cada nodo del gen hub refleja el número de TFs que interactúan. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-8
Figura 8: Comparación de la infiltración de células inmunitarias entre subgrupos de dermatitis atópica. Diagramas de caja que muestran las proporciones estimadas de 22 tipos de células inmunitarias en cada grupo (Clúster 1, rojo; Racimo 2, verde azulado). Los asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significativas entre grupos, evaluadas mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon con corrección de tasa de descubrimiento falso para comparaciones múltiples. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La dermatitis atópica es un trastorno inflamatorio cutáneo prevalente y genéticamente heterogéneo, que plantea importantes desafíos para estrategias de tratamiento personalizadas. Este estudio ofrece información sobre la heterogeneidad molecular de la EA al identificar dos subgrupos transcripcionales distintos en 266 muestras de piel lesional de pacientes con EA. Estos subgrupos presentan diferentes enriquecimientos de función biológica e infiltración de células inmunitarias, con el Clúster 1 caracterizado por vías activas de señalización y adhesión celular y un enriquecimiento de células T reguladoras (Tregs), mientras que el Clúster 2 se define por un aumento en la fosforilación oxidativa y la función del proteasoma, junto con un aumento de células T auxiliares foliculares. Es importante destacar que se identificaron cuatro genes asociados a mitocondrias (BAD, BOLA1, CHCHD5 e ISOC2) que están regulados al alza en el Clúster 1. Son genes central en la red PPI de 85 genes que definen los dos subtipos transcriptómicos y pueden regularse simultáneamente mediante factores de transcripción, incluyendo ATF3, BRD2, BRD4 y CEBPA.

Los dos grupos distintos se identificaron basándose en el patrón de expresión génica, lo que sugiere que la EA presenta una heterogeneidad significativa en la expresión génica. Estudios previos han demostrado que esta heterogeneidad podría estar impulsada por mecanismos genéticos, epigenéticos y mediados por el sistema inmunitario que definen los distintos endotipos^moleculares ^5,30,31. Entre los dos grupos también se observó una infiltración de células inmunitarias diferente, el grupo 1 caracterizado por células T reguladoras y el grupo 2 enriquecido con células T auxiliares foliculares (Tfh), lo que implica heterogeneidad inmunológica subyacente y posibles mecanismos de enfermedad diferentes en la cohorte de la EA. Un grupo dominado por Treg sugiere un entorno inmunitario donde los mecanismos reguladores son prominentes, posiblemente reflejando intentos de controlar la inflamación o una respuesta compensatoria a la activación inmune crónica^32,33. Sin embargo, en la EA, la función del Treg puede verse afectada a pesar del aumento de los números, lo que puede no suprimir eficazmente la inflamación. En cambio, un racimo enriquecido con Tfh apunta a una mejora en la ayuda de las células B, un aumento de la actividad del centro germinal y probablemente una producción elevada de IgE, que son características de respuestas alérgicas y formas más graves o extrínsecas de AD^34,35. Se sabe que las células TFH apoyan la diferenciación de células B y el cambio de clase de anticuerpos, y su expansión se correlaciona con la actividad de la enfermedad y la sensibilización^{alérgica 36}. La presencia de estos grupos distintos puede reflejar diferentes fenotipos clínicos, gravidades de la enfermedad o respuestas a la terapia, y pone de manifiesto la importancia de los enfoques personalizados en la investigación y tratamiento del EA.

Se sabe que la disfunción mitocondrial desempeña un papel significativo en la patogénesis de la EA mediante mecanismos como mantener la barrera epidérmica³⁷, producir especies reactivas de^{oxígeno 38} y regular la respuesta inmunitaria³⁹. Se identificaron cuatro proteínas mitocondriales como nodos centrales de genes asociados a la diferenciación transcriptómica, que pueden predecir el subtipo molecular con alta precisión (AUC>0,7). Aunque ningún estudio previo ha demostrado la relación directa de estos genes con la EA, estos resultados sugieren que son biomarcadores potenciales para estratificar a los pacientes con EA y evaluar la disfunción mitocondrial en pacientes con EA. BAD (agonista asociado a BCL2 de la muerte celular) es un miembro pro-apoptótico de la familia BCL-2 implicado en la señalización apoptótica mitocondrial; su regulación al alza en el Clúster 1 puede reflejar un aumento del cebado apoptótico mitocondrial en este subtipo. BOLA1 es una proteína mitocondrial implicada en la biogénesis de los grupos de hierro y azufre y en la regulación del estrés oxidativo. CHCHD5 (dominio de hélice enrollada en espiral enrollada que contiene 5) es una proteína de membrana interna mitocondrial asociada a la organización de las cristas y a la eficiencia de la cadena de transporte de electrones. ISOC2 (dominio isocorismatasa que contiene 2) se ha relacionado con procesos metabólicos y función mitocondrial. La regulación alzada coordinada de estos cuatro genes en el Clúster 1 sugiere un estado de actividad metabólica mitocondrial elevada y señalización apoptótica en este subgrupo de la EA.

Este estudio tiene varias limitaciones. Aunque este estudio identificó dos subgrupos moleculares con expresión génica distinta en genes mitocondriales e infiltración de células inmunitarias separadas, carecemos de datos clínicos detallados sobre fenotipos que nos permitan correlacionar la estratificación con la gravedad de la enfermedad y las respuestas longitudinales al tratamiento. Para comprender completamente qué significa la alta expresión de estos cuatro genes hub en el Clúster 1, los estudios futuros deberían integrar metadatos clínicos completos y, idealmente, realizar la validación funcional en modelos queratinocitos o murinos. Además, este estudio se basa en datos públicos de ARN-seq a granel; aunque es potente en análisis a gran escala, carece de resolución en tipos celulares específicos. Esta limitación dificulta determinar si la expresión diferencial observada de genes mitocondriales proviene de queratinocitos, células inmunitarias infiltrantes u otras poblaciones celulares residentes en la piel. Con el amplio uso de enfoques transcriptómicos unicelulares y espaciales, la investigación futura se beneficiaría mucho del poder de desconvolutar las señales de expresión y proporcionar una visión más precisa del perfil transcriptómico a nivel celular. Además, todos los datos se obtuvieron de muestras de biopsia por punzón, que muestrean piel de grosor completo. Futuros estudios que incorporen ARN-seq de tira de cinta podrían ofrecer un enfoque complementario no invasivo para perfilar el transcriptoma epidérmico superficial y podrían validar las firmas de subgrupos identificadas en un entorno mínimamente invasivo. La futura integración de datos de ARN-seq unicelular y transcriptómicos espaciales mejoraría aún más la resolución de las firmas mitocondriales específicas de tipo celular en la piel de AD.

En conclusión, este estudio examinó la heterogeneidad transcriptómica de la EA en 266 muestras, identificó genes mitocondriales clave y una infiltración única de células inmunitarias, diferenciando los subgrupos. Estos hallazgos mejoran la comprensión de la heterogeneidad molecular del A y ponen de manifiesto el potencial para desarrollar enfoques de tratamiento de precisión basados en perfiles moleculares específicos.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no haber conflicto de intereses.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
CIBERSORT	Universidad de Stanford	v0.1.0; deconvolución de células inmunitarias; https://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler	Bioconductor	v4.12.6; análisis de enriquecimiento GSEA y GO/KEGG; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
ConsensusClusterPlus	Bioconductor	v1.64.0; agrupación consensuada no supervisada; https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus
DESeq2	Bioconductor	v1.46.0; análisis diferencial de expresión génica; https://bioconductor.org/packages/DESeq2
Omnibus de Expresión Génica (GEO)	NCBI	Repositorio público de datos transcriptómicos; conjuntos de datos GSE121212, GSE157194, GSE193309, GSE277961; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo
ggplot2	CRAN	visualización de datos; https://ggplot2.tidyverse.org
ggraph	CRAN	Visualización de grafos y redes; https://ggraph.data-imaginist.com
GseaVis	GitHub (junjunlab)	v0.1.0; visualización GSEA; https://github.com/junjunlab/GseaVis
hTFtarget	Universidad de Ciencia y Tecnología Huazhong	base de datos objetivo de factores de transcripción humanos; http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget
igraph	CRAN	construcción y visualización de redes; https://igraph.org
limma	Bioconductor	removeBatchEffect función; https://bioconductor.org/packages/limma
MitoCarta3.0	Instituto Broad	base de datos curada de proteínas mitocondriales; https://www.broadinstitute.org/mitocarta
MSigDB (conjuntos de genes Hallmark)	Instituto Broad	base de datos de conjuntos génicos para GSEA; https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb
org. Hs.eg.db	Bioconductor	base de datos de anotación del genoma humano; https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db
R	Equipo Principal R	Entorno de computación estadística; https://www.r-project.org
STRING	EMBL	v12.0; base de datos de interacción proteína-proteína; https://string-db.org
sva (ComBat-seq)	Bioconductor	v3.44.0; corrección de efecto por lotes; https://bioconductor.org/packages/sva
WGCNA	CRAN	v1.73; análisis ponderado de redes de coexpresión génica; https://cran.r-project.org/package=WGCNA

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

El análisis transcriptómico revela subgrupos impulsados por mitocondriales en lesiones de dermatitis atópica

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles