Un estudio de aleatorización mendeliano de rasgos de células inmunitarias y metabolitos plasmáticos en la tiroiditis de Hashimoto

Resumen

Utilizando análisis de aleatorización y mediación mendeliana de dos muestras, este estudio identifica 32 fenotipos de células inmunitarias y 9 metabolitos plasmáticos causalmente asociados con la tiroiditis de Hashimoto y apoya un eje inmunometabólico parcial CD39+Treg-isovalerilcarnitina (C5)-HT. Los datos preliminares de citometría de flujo y metabolómicos proporcionan plausibilidad biológica inicial consistente con esta vía.

Resumen

La tiroiditis de Hashimoto (TH) es un trastorno autoinmune de la tiroides. Aunque las células inmunitarias están implicadas en su patogénesis, sus funciones específicas aún no se han aclarado completamente. Se realizó un análisis de aleatorización mendeliana (RM) de dos muestras que integró estadísticas resumen del estudio de asociación genómica a nivel genómico (GWAS) de grandes conjuntos de datos públicos sobre rasgos de células inmunitarias (ebi-a-GCST90001391 a ebi-a-GCST90002121), metabolitos plasmáticos (GCST90199621-9020102) y HT (ebi-a-GCST90018855). Los efectos causales se estimaron utilizando métodos ponderados por inversa de varianza (IVW), con análisis de MR-Egger, mediana ponderada y leave-one-out para evaluar la pleiotropía y la robustez. Se aplicaron además análisis de RM bidireccionales y de mediación para evaluar la direccionalidad e identificar posibles vías mediadas por metabolitos. Las células de Treg CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ se cuantificaron en muestras de sangre periférica mediante citometría de flujo. La isovalerilcarnitina (C5) se midió mediante cromatografía líquida mediante espectrometría de masas en tándem. El análisis de IVW identificó 32 fenotipos de células inmunitarias significativamente asociados con el riesgo de TH (P < 0,05 tras la corrección de FDR). El análisis de resonancia magnética inversa demostró que la TH estaba positivamente relacionada causalmente con 2 características inmunes, mientras que 4 características inmunitarias (todas P < 0,05) se asociaban inversamente con la TH. Los análisis de sensibilidad no revelaron pleiotropía horizontal ni heterogeneidad. Además, el método de IVW identificó preliminarmente 9 metabolitos plasmáticos como causalmente relacionados con la TH, incluyendo C5 que aumenta el riesgo (OR = 1,120, IC 95%: 1,032-1,215, P = 0,006) y la ergotionina protectora (OR = 0,958, IC 95%: 0,927-0,990, P = 0,010). La mediación por resonancia magnética en dos pasos identificó el C5 como un mediador candidato que conecta CD3⁺ CD39⁺ Treg con la TH (proporción de mediación 8,89%, IC 95%: 2,34%-15,4%, P = 0,008). La citometría de flujo elevó los niveles de CD39⁺Treg y C5 plasmático en pacientes con TH, con C5 positivamente correlacionado con la proporción de células CD39⁺Treg. Este estudio establece nuevos vínculos causales entre fenotipos de células inmunitarias y la TH, y destaca los metabolitos plasáticos, especialmente el C5, como posibles mediadores en la patogénesis de la HT. Estos hallazgos profundizan la comprensión mecanicista de la enfermedad autoinmune de la tiroides y pueden guiar el descubrimiento futuro de biomarcadores y dianas terapéuticas.

Introducción

La tiroiditis de Hashimoto (TH) es una enfermedad autoinmune común en la que el sistema inmunitario ataca la glándula tiroides, provocando^{hipotiroidismo 1,2}. Estudios recientes han informado de un aumento anual constante en la incidencia de TH. En China, se estima que su prevalencia oscila entre el 0,2% y el 1,3^%. La causa exacta de la TH se desconoce, aunque se cree que su patogénesis incluye una compleja interacción de componentes genéticos, ambientales y del sistema^{inmunitario 4,5}.

El desarrollo de la TH está fuertemente influenciado por el sistema ^{inmunitario 6,7,8}. Las respuestas inmunitarias aberrantes atacan el tejido tiroideo, desencadenando la producción de autoanticuerpos, incluyendo la peroxidasa antitiroidea (anti-TPO) y la anti-tiroglobulina (anti-Tg)⁹. Estos autoanticuerpos interactúan con las células tiroideas, induciendo la muerte celular mediada por el sistema inmunitario y reacciones inflamatorias, lo que resulta en una función tiroidea^{deteriorada 10}. Las vías patógenas específicas, especialmente las señales metabólicas que impulsan la disfunción de las células inmunitarias, siguen sin comprenderse del todo. Las células T reguladoras (Treg), especialmente las que expresan CD39, desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la tolerancia inmunológica al hidrolizar ATP extracelular en adenosina inmunosupresora. Las alteraciones en la función del Treg o en su entorno metabólico pueden provocar una ruptura de la autotolerancia, aunque la relación causal entre subconjuntos específicos de Treg y la TH sigue por^esclarecer 11,12,13,14,15,16.

Los estudios observacionales tradicionales suelen estar limitados por variables de confusión y el potencial de causalidad inversa, lo que complica la capacidad de determinar relaciones causales definitivas entre fenotipos de células inmunitarias y HT¹⁷. Además, dado que la TH es una enfermedad sistémica influenciada por diversos subconjuntos inmunitarios e intermediarios metabólicos, un enfoque limitado en candidatos individuales puede pasar por alto nuevos impulsores^{patógenos 18}. Por ello, es necesario un enfoque de cribado a gran escala para proporcionar un panorama imparcial y completo de los factores inmunometabólicos que contribuyen a la TH. Los avances recientes en estudios de asociación genómica a nivel genómico (GWAS) han proporcionado datos completos sobre fenotipos de células inmunitarias y metabolitos plasmáticos, ofreciendo nuevas vías para explorar los mecanismos subyacentes de HT¹⁹. La aleatorización mendeliana (RM) sigue los principios de asignación aleatoria de gametos mendelianos y combinaciones libres¹⁶ y el aprovechamiento de polimorfismos de nucleótido único (SNPs) como variables instrumentales (IVs) para inferir los posibles efectos causales de las exposiciones sobre los resultados^20,21. Este método ayuda a mitigar la influencia de factores de confusión y la causalidad inversa, que frecuentemente complican los estudios observacionales^{tradicionales 16,22}.

A la luz de estos desarrollos, el objetivo de este estudio es doble. Primero, se realizó un análisis exploratorio generador de hipótesis utilizando un marco de resonancia magnética de dos muestras para cribar sistemáticamente 731 fenotipos de células inmunitarias y 1.400 metabolitos plasmáticos para identificar nuevos factores de riesgo candidatos para la TH. En segundo lugar, se realizó una transición a una investigación basada en hipótesis para evaluar el papel mediador específico de metabolitos identificados, como la isovalerilitina, en la vía que vincula las células T reguladoras con el riesgo de HT. Por tanto, este estudio integra el cribado de RM a gran escala con análisis de mediación y validación clínica preliminar para proporcionar evidencia genéticamente respaldada coherente con un supuesto marco inmunometabólico (Treg–metabolito–HT), al tiempo que enfatiza la naturaleza exploratoria de estos hallazgos. Al identificar estas cadenas causales precisas, se ofrecen nuevas perspectivas sobre la regulación metabólica de la autoinmunidad tiroidea, junto con candidatos sólidos para futuras divisións terapéuticas.

Protocolo

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Mongolia Interior. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y las directrices éticas pertinentes. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de iniciar cualquier procedimiento relacionado con el estudio. Este estudio incluyó dos grupos de participantes: el grupo de tiroiditis de Hashimoto (TH, n = 10) y el grupo control sano (Sano, n = 10). Ambos grupos fueron emparejados por edad y sexo. Todas las muestras de sangre periférica se recogieron de pacientes ambulatorios o de personas sometidas a exámenes médicos rutinarios, y se extrajo sangre por la mañana tras un ayuno nocturno.

Diseño del estudio

En este estudio, se empleó un análisis de resonancia magnética de dos muestras y un análisis de mediación para evaluar la relación causal entre 731 fenotipos de células inmunitarias (7 grupos) y la TH, y exploraron el posible papel modulador de los metabolitos plasmáticos en esta relación. El flujo de trabajo analítico consistió en 5 pasos secuenciales: (1) selección de conjuntos de datos GWAS de exposición para fenotipos inmunitarios; (2) selección del conjunto de datos GWAS de resultados para la HT; (3) identificación y armonización de variables instrumentales; (4) análisis de RM de dos muestras primarias y validación bidireccional; y (5) análisis de resonancia magnética de mediación en dos pasos. Una visión esquemática del diseño del estudio se presenta en la Figura Suplementaria 1. En el análisis de RM, las variantes genéticas actúan como proxies de exposiciones modificables. Para una inferencia causal válida, las variables instrumentales (IV) deben cumplir tres criterios fundamentales: (1) están fuertemente asociadas con la exposición de interés; (2) son independientes de cualquier factor de confusión que pueda influir tanto en la exposición como en el resultado; y (3) afectan al resultado únicamente a través de la exposición, sin vías causales alternativas.

GWAS de la fuente de datos HT

Para garantizar la compatibilidad de conjuntos de datos y minimizar la estratificación poblacional, todas las estadísticas resumen GWAS se derivaron principalmente de individuos de ascendencia europea. La base de datos GWAS (https://gwas.mrcieu.ac.uk/) proporcionó los datos de resultados de HT, y se utilizó el conjunto de datos ebi-a-GCST90018855. El estudio realizó GWAS en 395.640 europeos (_caso N = 15.654,_control N = 379.986); tras control de calidad e interpolación, se analizaron 24.146.037 SNPs. Para confundidores específicos de HT (por ejemplo, género, edad), el GWAS original (ebi-a-GCST90018855) incluía estas covariables en sus modelos, como estándar en las pipelines de GSAS.

Fuentes de datos GWAS para células inmunitarias

Las estadísticas resumen para GWAS relacionadas con los rasgos de las células inmunitarias se obtuvieron del Catálogo GWAS, cubriendo conjuntos de datos con números de acceso desde ebi-a-GCST90001391 hasta ebi-a-GCST90002121 (disponibles en https://www.ebi.ac.uk/gwas/). Se incluyeron un total de 731 fenotipos inmunológicos en el análisis, incluyendo el recuento relativo de células (n = 192), el parámetro morfológico (MP) (n = 389), los coeficientes de activación (AC, n = 118) y la intensidad media de fluorescencia (MFI, n = 389) que representan el grado de antígeno^{superficial 23}. El impacto de casi 22 millones de polimorfismos en 731 fenotipos de células inmunitarias en 3757 sardos fue documentado por el GWAS inicial sobre las células inmunitarias.

Fuentes de datos GWAS para metabolitos plasmáticos

Se extrajeron datos resumen GWAS para un total de 1.400 metabolitos plasmáticos del Catálogo GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020), que comprende 1.091 concentraciones individuales de metabolitos y 309 rasgos de la razón metabolita. Los conjuntos de datos GWAS empleados para el análisis de RM en el presente estudio se derivaron de individuos de ascendencia europea. Las características detalladas del metabolito plasmático utilizados en los datos GWAS se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1.

Los conjuntos de datos GWAS para fenotipos de células inmunitarias (cohorte sarda), HT (FinnGen/EBI-a-GCST90018855) y metabolitos plasmáticos (cohortes europeas) son independientes y no solapan muestras, como confirman las respectivas publicaciones del consorcio. Esto satisface la suposición de independencia para la RM de dos muestras.

Selección de variables instrumentales (IVs)

Se asumió que las IVs estaban fuertemente asociadas a la exposición, manteniendo la independencia de las variables de resultado. Además, solo se hipotetizó que el factor de exposición tenía un efecto directo en el resultado. Para identificar las vías intravenosas adecuadas, se seleccionaron SNPs asociados a factores de exposición con un nivel de significación fijado en 5 × ^10-8. Para tener en cuenta el desequilibrio de ligamiento (LD), los SNPs se agruparon usando un umbral de R² de 0,001 dentro de un tamaño de ventana de 10.000 kilobases (kb). Se excluyeron las variantes que presentaban R² > 0,001 por pares dentro de esta distancia para asegurar la independencia de las variables instrumentales seleccionadas y eliminar posibles correlaciones de LD. Las pruebas de heterogeneidad excluyeron SNPs significativamente heterogéneos con un estadístico F < 10. Finalmente, para controlar el efecto de los factores de confusión sobre las IVs, se tomó P < 1×^10-5 para eliminar SNPs palindrómicos e incompatibles, y se mantuvieron SNPs válidos como variables instrumentales.

Análisis de aleatorización mendeliana de dos muestras

Para evaluar la relación causal bidireccional entre los fenotipos de células inmunitarias y la TH, se realizaron tanto análisis de aleatorización mendeliana (RM) de dos muestras como análisis de RM de mediación. Específicamente, se aplicó la RM de dos muestras para evaluar múltiples rasgos relacionados con células inmunitarias. Para estos análisis se emplearon varios métodos complementarios de RM, incluyendo ponderación inversa de varianza (IVW⁾²⁴, regresión de^{MR-Egger 25}, el estimador mediano ponderado (WME⁾²⁶, estimación simple^{basada en modos 27} y estimación basada en modos ponderados. Entre ellos, la IVW fue designada como el enfoque analítico principal, con significación estadística definida como P < 0,05. El método de la VV fue seleccionado como estimador principal de la RM debido a su equilibrio óptimo entre precisión y la suposición de pleiotropía equilibrada. El método de IVW mejora la precisión al asignar mayor peso a SNPs con varianzas menores, produciendo así estimaciones causales más fiables. La regresión de MR-Egger se utilizó para la evaluación de pleiotropía, un proceso en el que los genes influyen en múltiples fenotipos. Si la interceptación indicó que no hubo pleiotropía horizontal significativa (P > 0,05), este enfoque combinó la evaluación de la interceptación para determinar la pleiotropía. La heterogeneidad se evaluó utilizando la estadística Q de los métodos MR-Egger y IVW, que mide hasta qué punto la variación genética afecta al fenotipo, si P > 0,05 indica que no hay heterogeneidad significativa en los efectos de la variación genética. Se aplicaron umbrales ajustados por Bonferroni para tener en cuenta 731 fenotipos inmunitarios (P < 6,84 × 10⁻⁵) y 1.400 metabolitos (P < 3,57 × 10⁻⁵). Los resultados significativos sobrevivieron a la corrección salvo que se indique lo contrario. Además, se evaluó la causalidad inversa utilizando el mismo método de RM para investigar si las características de las células inmunitarias se veían afectadas por la TH. En el estudio de resonancia magnética inversa, se consideró la TH como factor de exposición y se consideraron diferentes características de las células inmunitarias como resultado.

En este estudio, se realizó un análisis de mediación utilizando un marco de resonancia magnética en dos pasos para explorar si los metabolitos plasmáticos actúan como intermediarios en la vía causal que vincula los fenotipos de las células inmunitarias con la TH. Este enfoque permite que el efecto causal total de los fenotipos de las células inmunitarias sobre la TH se divida en un efecto directo y un efecto indirecto transmitido a través de los intermediarios metabólicos identificados. Se estimó primero el efecto total de las células inmunitarias sobre la TH, seguido por el efecto de las células inmunitarias sobre los metabolitos (β1), el efecto de los metabolitos sobre la TH (β2) y el efecto mediador (β1*β2), calculándose el efecto directo como el efecto total menos el efecto mediador. Efecto total (_{β total}) = Efecto directo (β_directo) + Efecto indirecto (β_indirecto); Efecto indirecto = β1 × β2; La proporción mediada (%) = (β1 × β2)/β total × 100%, donde β1 es el efecto causal del fenotipo de células inmunitarias sobre el metabolito plasmático, y β2 es el efecto causal del metabolito plasmático sobre la TH. Se utilizó el método delta para estimar intervalos de confianza del 95% para el efecto indirecto. Además, se realizó un análisis de RM intermedio inverso para investigar los efectos causales de la TH sobre metabolitos y metabolitos sobre las células inmunitarias, con el fin de complementar los resultados de la RM directa y mejorar la fiabilidad de la inferencia causal. Todos los análisis se realizaron mediante un entorno de computación estadística y paquetes de software relacionados con la RM relevantes, que se enumeran en la Tabla de Materiales.

Detección de Treg 3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺

Se mezclaron cuidadosamente 50 μL de sangre entera anticoagulada en un tubo de ensayo con 10 μL de cada uno dirigidos a los anticuerpos monoclonales CD3, CD4, CD25 y CD39. La mezcla se protegió de la luz y se mantuvo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Posteriormente, se añadieron 2 mL de una solución lisadora FACS diluida 1:10. El tubo se incubó durante 10 minutos más a temperatura ambiente mientras estaba protegido de la luz durante la lisis. El tubo se centrifugó a ~300 x g durante 5 minutos y se retiró el sobrenadante. Tras añadir 2 mL de solución tampón de fosfato (PBS), el tubo se centrifugó de nuevo a ~300 x g durante 5 minutos. Se retiró el sobrenadante y se añadieron 500 μL de PBS para su detección. La detección se realizó utilizando un citómetro de flujo multiláser y se analizó mediante el software de adquisición y análisis correspondiente para obtener la proporción de CD3⁺CD4⁺CD25⁺Tregs y el subconjunto que expresa CD39 (CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺Tregs).

Medición de los niveles de isovalerilcarnitina (C5)

Los datos sobre los niveles de C5 de los pacientes se obtuvieron del Departamento de Laboratorio Clínico del Hospital de la Universidad Médica de Mongolia Interior. Específicamente, el C5 se midió como parte de la cromatografía líquida–espectrometría de masas en tándem rutinaria (LC–MS/MS), siguiendo procedimientos de laboratorio estandarizados y protocolos de control de calidad.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando un entorno de software estadístico. Las variables continuas se compararon utilizando la prueba t de Student para datos normalmente distribuidos o la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para datos no distribuidos de forma normal. Se analizaron variables categóricas mediante la prueba del chi-cuadrado. Se utilizó un análisis de correlación de Pearson para realizar un análisis de correlación. Se consideró estadísticamente significativo un valor p < 0,05.

Resultados

Efectos causales genéticos de los fenotipos de células inmunitarias en la TH

Tras la exclusión de posibles factores de confusión y la ausencia de pleiotropía horizontal (P > 0,05), se realizó un análisis de resonancia magnética de dos muestras para evaluar los efectos causales de los fenotipos de células inmunitarias sobre el riesgo de TH. Para cada fenotipo de célula inmunitaria utilizado como exposición, se calculó la estadística F para evaluar la intensidad de las variables instrumentales. Todos los instrumentos superaron el umbral convencional de F > 10, lo que indica un sesgo mínimo débil del instrumento. Las estadísticas detalladas de los principales rasgos inmunitarios discutidos en el texto principal se proporcionan en la Tabla Suplementaria 2. En total, 32 fenotipos relacionados con el sistema inmunitario demostraron asociaciones significativas con el riesgo de TH (P < 0,05) (Figura 1). La robustez de estos hallazgos fue respaldada por análisis de diagramas de dispersión (Figura suplementaria 2A,B) y análisis de sensibilidad utilizando el enfoque leave-one-out (Figura suplementaria 3A,B).

Entre los hallazgos principales, el fenotipo de Treg mostró la implicación más extensa, con CD3 en CD39+ secretando Treg (OR = 1,063; IC 95%: 1,023–1,105; P = 0,002) y CD39+ activado Treg %activado (OR = 1,081; IC 95%: 1,008–1,161; P = 0,030) emergiendo como características clave asociadas al riesgo que posteriormente se priorizaron para el análisis de mediación. En las etapas de maduración de las células T, CD3 en CM CD8br mostró el mayor tamaño de efecto entre las características asociadas al riesgo (OR = 1,094; IC 95%: 1,040–1,150; P < 0,001), mientras que TD DN (CD4⁻CD8⁻) AC mostró una asociación protectora notable (OR = 0,930; IC 95%: 0,881–0,982; P = 0,009). Entre los fenotipos de células B, los subconjuntos de células mieloides que expresan HLA-DR mostraron consistentemente efectos de elevación del riesgo, con HLA DR en CD33dim HLA DR+ CD11b⁻ alcanzando OR = 1,095 (IC 95%: 1,032–1,162; P = 0,003). Los resultados completos en las seis categorías de células inmunitarias: cDC, Treg, etapas de maduración de células T, TBNK, monocitos, células B y fenotipos de células mieloides se resumen en la Figura 1.

Los análisis de sensibilidad validaron aún más los resultados. No se detectó evidencia significativa de heterogeneidad y pleiotropía horizontal según evaluaciones estadísticas relevantes (Tabla Suplementaria 3 y Tabla Suplementaria 4). Estos resultados fueron corroborados por el análisis de "dejar a uno fuera".

Los efectos causales de la TH en las células inmunitarias

Los resultados revelaron que la TH estaba positivamente asociada causalmente con dos características inmunes: la célula T reguladora secretora CD4 (1.143: 1.023-1.277; P = 0,018) y células supresoras derivadas de mieloides monocíticas (1,373: 1,058-1,782; P = 0,017). En contraste, la TH se asoció causalmente negativamente con 4 características inmunitarias: células T reguladoras CD4 activadas (0,818: 0,679-0,987; P = 0,036), activó la célula T reguladora CD4+ (0,790: 0,676-0,924; P = 0,003), células T reguladoras CD4 activadas y en reposo (0,871: 0,780-0,974; P = 0,015) y CD25++ CD4+ celda T (0,855: 0,747-0,980; P = 0,017) (Figura 2). Estos hallazgos sugieren una relación recíproca entre los estados de activación de HT y Treg, lo que podría reflejar una remodelación inmune impulsada por la enfermedad. Los diagramas de dispersión (Figura suplementaria 4) y el método de "dejar uno fuera" (Figura suplementaria 5) verificaron la estabilidad de los resultados. Los análisis de sensibilidad también validaron los resultados. La fortaleza de estos resultados fue confirmada por evaluaciones de heterogeneidad y multiplicidad horizontal (Tabla Suplementaria 5 y Tabla Suplementaria 6). Estas conclusiones están respaldadas por el análisis de "dejar a uno fuera".

Efectos causales genéticos de los metabolitos plasmáticos en la TH

Tras seleccionar variables instrumentales adecuadas y excluir desequilibrios de cadenas e instrumentos débiles, se identificaron un total de 34.843 SNPs asociados a metabolitos plasmáticos, con la estadística mínima F alcanzando 19,50 (Tabla Suplementaria 7). Utilizando el método de la VIV, se encontró preliminarmente 9 metabolitos plasmáticos asociados causalmente con la TH. Entre estos, 4 metabolitos se asociaron positivamente con un mayor riesgo de TH: Proporción glucosa-maltosa (1,195: 1,082-1,319; P < 0,001), ácido taurocólico (1,190: 1,073-1,321; P = 0,001), 5-hidroximetil-2-furoilcarnitina (1,127: 1,046-1,215; P = 0,002), y C5 (1,120: 1,032-1,215; P = 0,006) (Tabla 1).

Por el contrario, 5 metabolitos pueden estar negativamente asociados con el riesgo de TH, incluyendo la ergotionina (0,958: 0,927-0,990; P = 0,010), proporción de carnitina a propionilcarnitina (C3) (0,895: 0,825-0,970; P = 0,007), relación de adenosina 5'-difosfato (ADP) a N-acetilneuraminato (0,890: 0,823-0,963; P = 0,004), la proporción arginina-glutamato (0,882: 0,802-0,968; P = 0,009), y 1-(1-enil-palmitoil)-2-linoleoil-GPE (p-16:0/18:2) (0,873: 0,798-0,955; P = 0,003).

Los análisis de sensibilidad también validaron los resultados. La solidez de estos resultados fue confirmada por evaluaciones de heterogeneidad y multiplicidad horizontal (Tabla Suplementaria 8 y Tabla Suplementaria 9). Estas conclusiones están respaldadas por el análisis de "dejar a uno fuera".

Mediación del riesgo de células inmunitarias y TH por metabolitos plasmáticos

Basándose en los fenotipos de células inmunitarias y metabolitos plasmáticos previamente identificados, se aplicó una estrategia de RM de dos muestras para estimar los posibles efectos mediadores. En el primer paso, se realizaron análisis de RM utilizando 32 fenotipos de células inmunitarias como exposiciones y 9 metabolitos plasmáticos como resultados, revelando 12 asociaciones causales significativas que involucran 10 fenotipos de células inmunitarias y 8 metabolitos plasmáticos, con estimaciones correspondientes de efecto β1 de células inmunitarias a metabolitos. Entre estos, se identificó la asociación más significativa entre CD3 en células Treg secretoras CD39+ y los niveles de C5 (1,050: 1,016-1,085; P = 0,004). En el segundo paso, el C5 se trataba como la exposición y el HT como resultado. Se realizaron análisis por RM, incluyendo la detección de valores atípicos MR-PRESSO y evaluaciones de heterogeneidad y pleiotropía horizontal. No se detectaron SNPs atípicos ni evidencia de heterogeneidad o pleiotropía (Tabla 2), lo que nos permite estimar el efecto causal desde el metabolito plasmático hasta HT (β2) (Figura suplementaria 6).

En el paso final del análisis de RM, se realizaron análisis de mediación para aclarar si el efecto causal de los fenotipos de las células inmunitarias sobre la TH estaba mediado a través de metabolitos plasmáticos. Los resultados indicaron que niveles elevados de C5 actuaron como mediador en la vía que vincula CD3 en células Treg secretoras CD39+ con un mayor riesgo de desarrollar TH (Figura suplementaria 7 y Figura 3). Las pruebas de detección de valores atípicos MR-PRESSO, heterogeneidad y pleiotropía no revelaron SNPs sesgados ni signos de heterogeneidad o pleiotropía horizontal (Tabla 3, Tabla Suplementaria 10 y Tabla Suplementaria 11). Entre ellos, la proporción mediadora de niveles de C5 fue del 8,89% (2,34% frente al 15,4%) (P = 0,008). Finalmente, se realizaron análisis de RM por mediación inversa para probar rigurosamente las suposiciones de direccionalidad. Para metabolitos de las células inmunitarias, la RM inversa (niveles de C5 a CD3 en Treg secretora CD39+) no mostró efectos causales significativos ( IVW P > 0,05 tras la corrección de Bonferroni), lo que apoya la unidireccionalidad (Tabla 4). Para TH a metabolitos, la resonancia magnética inversa (niveles de TH a C5) no reveló asociaciones causales (IVW P > 0,05 tras la corrección de Bonferroni), lo que respalda la direccionalidad asumida (Tabla 5). Dado el modesto efecto total y la falta de evidencia recíproca en la resonancia magnética bidireccional, estos resultados de mediación deben considerarse exploratorios.

Ensayo de citometría de flujo CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ detección de Treg

Para validar los hallazgos del análisis metabolómico, se realizó validación experimental in vitro para evaluar las características de expresión del CD39⁺ Treg y el plasma C5. Se utilizó citometría de flujo para cuantificar las células Treg (CD3⁺CD4⁺CD25⁺) y sus subconjuntos CD39⁺ (CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺) en sangre periférica de pacientes con TH y controles sanos. Como se muestra en la Figura 4A–C, tanto las células Treg (CD3⁺CD4⁺CD25⁺) como las subconjuntos CD39⁺ Treg estaban significativamente elevadas en pacientes con TH en comparación con individuos sanos (P < 0,001). El perfilado metabolómico plasmático dirigido mediante espectrometría de masas en tándem mostró además que los niveles de C5 eran notablemente más altos en el grupo HT (P < 0,001, Figura 4D). Además, el análisis de correlación de Pearson reveló una asociación positiva entre los niveles plasmáticos de C5 y la frecuencia del subconjunto CD39⁺Treg (Figura 4E), consistente con la vía supuesta CD39⁺Treg-C5-HT identificada por RM. Sin embargo, el diseño transversal y el tamaño reducido de la muestra impiden inferir causalmente solo a partir de estos datos.

DISPONIBILIDAD DE DATOS:

Las estadísticas resumen del estudio de asociación genómica (GWAS) para la tiroiditis de Hashimoto se obtuvieron del Catálogo GWAS (ebi-a-GCST90018855; https://gwas.mrcieu.ac.uk/). Las estadísticas resumen de los rasgos de las células inmunitarias se extrajeron del Catálogo GWAS (ebi-a-GCST90001391 a ebi-a-GCST90002121; https://www.ebi.ac.uk/gwas/). Los datos GWAS de metabolitos plasmáticos se obtuvieron del Catálogo GWAS (GCST90199621-GCST90201020; https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020). Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.

Figura 1: Gráfico forestal que muestra los efectos causales de los rasgos de las células inmunitarias en la tiroiditis de Hashimoto. Gráfico forestal que resume los efectos causales de todos los rasgos de las células inmunitarias evaluados en este estudio sobre la tiroiditis (HT) de Hashimoto. Abreviaturas: nsnp, número de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs); pval, valor P; OR, ratio de probabilidades; IC, intervalo de confianza. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Gráfico forestal que muestra los efectos causales de la tiroiditis de Hashimoto sobre los fenotipos de las células inmunitarias. Gráfico forestal que resume los efectos causales de la TH en varios fenotipos de células inmunitarias. Abreviaturas: nsnp, número de SNPs; pval, valor P; OR, ratio de probabilidades; IC, intervalo de confianza. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Gráfico forestal que muestra el efecto mediador del plasma isovalerilcarnitina (C5) entre CD39+ y tiroiditis de Hashimoto. Gráfico forestal que resume los efectos causales del plasma C5 que median la asociación entre CD39+ y HT. Abreviaturas: OR, odds ratio; IC, intervalo de confianza. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Expresión de células T reguladoras CD39+ y niveles plasmáticos de isovalerilcarnitina (C5) en pacientes con tiroiditis de Hashimoto. (A) Estrategia de filtración de citometría de flujo para la T reguladora (Treg; CD3+CD4+CD25+) y CD39+ celdas Treg. (B) Niveles totales de células Treg. (C) CD39+ niveles de células Treg. (D) Niveles plasmáticos de isovalerilcarnitina (C5) medidos por espectrometría de masas tándem. (E) Análisis de correlación de Pearson entre los niveles plasmáticos de isovalerilcarnitina (C5) y la proporción de células Treg CD39+. Abreviaturas: SSC-A, área de dispersión lateral; FSC-A, área de dispersión hacia adelante; FSC-H, altura de dispersión hacia adelante. P < 0,001 frente a controles sanos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1: Efectos causales de nueve metabolitos plasmáticos significativamente asociados en la tiroiditis de Hashimoto.  Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 2: Efecto causal de los niveles de isovalerilcarnitina (C5) en la tiroiditis de Hashimoto (β₂). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 3: Efecto causal de las células T reguladoras CD3+CD39+ en la tiroiditis de Hashimoto. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 4: Efecto causal de los niveles de isovalerilcarnitina (C5) en células T reguladoras CD3+CD39+. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 5: Efecto causal de la tiroiditis de Hashimoto sobre los niveles de isovalerilcarnitina (C5). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 1: Diseño del estudio y flujo de trabajo analítico. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Diagramas de dispersión que muestran estimaciones causales para las asociaciones entre 32 rasgos de células inmunitarias y la tiroiditis de Hashimoto. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Análisis leave-one-out que evalúan la robustez de los efectos causales de 32 rasgos de las células inmunitarias en la tiroiditis de Hashimoto. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Diagramas de dispersión que muestran los efectos causales de la tiroiditis de Hashimoto sobre seis fenotipos de células inmunitarias. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 5: Análisis leave-one-out que evalúan la robustez de los efectos causales de la tiroiditis de Hashimoto sobre seis fenotipos de células inmunitarias. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 6: Asociación causal entre los niveles de isovalerilcarnitina (C5) y el riesgo de tiroiditis de Hashimoto. (A) Gráfico forestal que muestra el efecto causal de los niveles de isovalerilicarnitina (C5) sobre el riesgo de TH (β₂). (B) Diagrama de dispersión que muestra la estimación del efecto causal para cada SNP sobre el riesgo de HT. (C) Diagrama de embudo que evalúa la heterogeneidad de las estimaciones de aleatorización mendeliana (RM) para el efecto de los niveles de C5 sobre el riesgo de TH. (D) Análisis de dejar uno fuera que demuestra que la estimación global del riesgo no fue sustancialmente influenciada por ningún SNP individual. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 7: Asociación causal entre las células T reguladoras CD3+CD39+ y el riesgo de tiroiditis de Hashimoto. (A) Gráfico forestal que muestra el efecto causal total de las células T reguladoras CD3+CD39+ sobre el riesgo de TH. (B) Diagrama de dispersión que muestra la estimación del efecto causal para cada SNP sobre el riesgo de HT. (C) Gráfico de embudo que evalúa la heterogeneidad de las estimaciones de RM para el efecto de las células T reguladoras CD3+CD39+ sobre el riesgo de HT. (D) Análisis de dejar uno fuera que demuestra que la estimación global del riesgo no fue sustancialmente influenciada por ningún SNP individual. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Características de los conjuntos de datos de estudios de asociación genómica para metabolitos plasmáticos utilizados en el análisis de aleatorización mendeliana.  Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Características de variables instrumentales (SNPs) y estadísticas F para fenotipos clave de células inmunitarias utilizados como exposiciones en el análisis de aleatorización mendeliana. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 3: Evaluación de pleiotropía para análisis de aleatorización mendeliana de fenotipos de células inmunitarias en tiroiditis de Hashimoto. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 4: Evaluación de heterogeneidad para análisis de aleatorización mendelianos de fenotipos de células inmunitarias en tiroiditis de Hashimoto. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 5: Evaluación de pleiotropía para análisis de aleatorización mendelianos de tiroiditis de Hashimoto en fenotipos de células inmunitarias. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 6: Evaluación de heterogeneidad para análisis de aleatorización mendeliana de tiroiditis de Hashimoto en fenotipos de células inmunitarias. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 7: Polimorfismos de un solo nucleótido asociados a metabolitos plasmáticos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 8: Evaluación de pleiotropía para análisis de aleatorización mendeliana de metabolitos plasmáticos en tiroiditis de Hashimoto. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 9: Evaluación de heterogeneidad para análisis de aleatorización mendeliana de metabolitos plasmáticos en tiroiditis de Hashimoto. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 10: Evaluación de pleiotropía para análisis de mediación de asociaciones fenotipo de células inmunitarias y tiroiditis de Hashimoto por metabolitos plasmáticos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 11: Evaluación de heterogeneidad para análisis de mediación de las asociaciones fenotipo de células inmunitarias y tiroiditis de Hashimoto por metabolitos plasmáticos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: Datos que respaldan los hallazgos de este estudio. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este estudio, se aplicó la aleatorización mendeliana para investigar el impacto causal de los fenotipos de células inmunitarias en la tiroiditis de Hashimoto (HT) y para explorar el posible papel mediador de los metabolitos plasmáticos. Se encontraron treinta y dos fenotipos inmunitarios asociados con el riesgo de TH, incluyendo células dendríticas, células T reguladoras, etapas de maduración de células T, células B y células mieloides, con efectos tanto promotores como protectores. Además, 9 metabolitos plasmáticos mostraron vínculos causales con la TH, y observaron además que el C5 puede mediar parcialmente la asociación entre la expresión de CD3 en células Treg secretoras de CD39⁺ y la HT. Estos hallazgos deben interpretarse como evidencia de posibles efectos causales inferidos de instrumentos genéticos, más que como confirmación mecanicista directa.

Entre los fenotipos de cDC, CD62L-plasmacitoide DC %DC y HLA DR en DCA plasmacitoide se asociaron con un mayor riesgo de TH, mientras que CCR2 en CD62L+ mieloide DC, CD39+ activado Treg %activated y CD62L en monocitos. Las asociaciones identificadas entre fenotipos específicos de células inmunitarias y la TH ofrecen nuevas perspectivas sobre la patogénesis de la enfermedad. Por ejemplo, se encontró que el riesgo de TH está correlacionado con características como HLA DR en la DC plasmacitoide y CD62L-plasmacitoide DC, lo que indica que estos tipos celulares pueden ser esenciales para iniciar o mantener reacciones autoinmunes contra la glándula ^{tiroides 28}. Numerosas investigaciones han demostrado que las células epiteliales tiroideas HLA DR+ estimulan activamente las respuestas inmunitarias dentro de la glándula tiroides en pacientes con TH 28,29,30,31. Este estudio reveló una correlación entre HLA DR en plasmacitoide y un riesgo elevado de TH, lo que indica que HLA DR en plasmacitoide podría ser un factor causal en TH. Estudios previos han identificado genes clave con alta precisión diagnóstica para la TH mediante métodos bioinformáticos, y los inmunoensayos han demostrado que la infiltración de monocitos está correlacionada negativamente con la expresión génica clave. Xu et ^al.32 informaron que niveles más altos de expresión de CD62L en monocitos se asociaron con un menor riesgo de TH, coherente con los hallazgos actuales. Específicamente, fenotipos como CCR2 en células dendríticas mieloides CD62L+ y CD62L en monocitos se relacionaron con un efecto protector, indicando posibles roles reguladores o supresores que podrían mitigar la autoinmunidad tiroidea.

Numerosas líneas de evidencia apuntan al papel fundamental que desempeña el equilibrio de células Th17 y Treg en el desarrollo de HT^33,34. Esta investigación identificó un vínculo causal entre la TH y varias características de Treg. Específicamente, el riesgo de desarrollar TH se asoció inversamente con la expresión de CD25 en células T reguladoras CD39+, mientras que se observó que la relación Th17/Treg aumentaba con la progresión de HT³⁵. La compleja función de las células T reguladoras en la preservación de la tolerancia inmunológica y la prevención de trastornos autoinmunes queda de manifiesto por las fuertes correlaciones de diferentes fenotipos de Treg, con un riesgo tanto elevado como reducido de TH. Las células Treg son duales, con algunos subconjuntos que pueden agravar las respuestas autoinmunes mientras que otros las suprimen. Esto subraya la necesidad de más investigaciones para definir con precisión sus roles en la TH.

Además, dentro de las etapas de maduración de células T, los grupos TBNK, monocitos y células B, se observó un patrón consistente en el que algunos fenotipos inmunitarios se vincularon a un mayor riesgo de TH, mientras que otros parecían conferir un efecto protector 32,36,37,38. Esto subraya la implicación compleja de las células inmunitarias en el desarrollo de la HT. También se realizó un análisis inverso de RM para examinar el efecto de la TH en las características de las células inmunitarias. El análisis reveló que la TH estaba asociada con niveles aumentados de ciertos fenotipos de células inmunitarias, como la secretación de células T reguladoras CD4 y MDSC monocíticos, y niveles disminuidos de otros, especialmente células T reguladoras CD4 activadas y células T CD25+ CD4+.

Cabe destacar que el análisis de mediación destaca el papel causal de los niveles de C5 en la progresión desde los fenotipos de las células inmunitarias hasta el desarrollo de la TH. Estudios previos han demostrado que los niveles plasmáticos de C5 contribuyen al desarrollo de la neuropatía periférica^{diabética 39} y están correlacionados tanto con sarcopenia como con un índice muscular esquelético^{reducido 40}. Además, en cuanto al metabolismo lipídico, se han observado concentraciones más bajas de isovalerilcarnitina en individuos con fenotipo de^{fragilidad 41}. La proporción de mediación del 8,89% observada en este estudio sugiere que el C5 podría representar un posible vínculo mecanicista en la vía Treg–HT CD39⁺ , y merece una investigación adicional como candidato a biomarcador y objetivo terapéutico en estudios experimentales y clínicos prospectivos.

Aunque este estudio ofrece información valiosa, algunas limitaciones merecen ser consideradas. En primer lugar, el enfoque de RM se basa en la suposición de que las variables instrumentales utilizadas son válidas y no están influenciadas por factores de confusión ni por pleiotropía 42,43,44. En segundo lugar, los análisis primarios de RM se basaron en datos GWAS de ascendencia europea, y el GWAS de células inmunitarias se derivó de una población fundadora sarda cuya estructura de desequilibrio de ligamiento distinta puede limitar la generalizabilidad; se necesitan estudios futuros en cohortes diversas y no europeas para confirmar la aplicabilidad específica de población. En tercer lugar, el análisis de mediación identificó C5 como un factor que podría representar un vínculo exploratorio. Son necesarios futuros estudios que incorporen cohortes más diversas para confirmar estas asociaciones y explorar posibles efectos específicos de la población. Finalmente, los experimentos de citometría de flujo y validación plasmática proporcionaron evidencia de apoyo a los hallazgos de la RM; sin embargo, el tamaño de la muestra era relativamente limitado. Se necesitan estudios experimentales y clínicos de mayor alcance para validar estas interacciones metabólicas inmunitarias y para explorar si dirigirse a las células CD39⁺Treg o a vías metabólicas relacionadas puede ofrecer nuevas oportunidades terapéuticas para la TH.

Conclusión

En conclusión, este estudio aporta nuevas perspectivas sobre las relaciones causales entre los fenotipos de células inmunitarias, en particular los Tregs CD39⁺ , y la HT, identificando el C5 como candidato mediador en esta vía según un análisis de mediación exploratoria. Estos hallazgos revelan un nuevo eje inmunometabólico, que ofrece conocimientos mecanicistas y posibles objetivos para el desarrollo de biomarcadores y la intervención terapéutica en enfermedades autoinmunes de la tiroides. Futuros estudios con cohortes prospectivas más amplias pueden validar aún más estos hallazgos y explorar el valor potencial de aplicación de la inmunomodulación en el tratamiento de la TH.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo monoclonal CD25-PE	BD Biosciences	340938	Anticuerpo para citometría de flujo para la detección de CD25 humano
Anticuerpo monoclonal CD39-PE-Cy7	BD Biosciences	567526	Anticuerpo para citometría de flujo para la detección de CD39 humano
Anticuerpo monoclonal CD4-FITC	BD Biosciences	340133	Anticuerpo para citometría de flujo para la detección de CD4 humano
Anticuerpo monoclonal D3-APC	BD Biosciences	555333	Anticuerpo para citometría de flujo para la detección de CD3 humano
Solución FACS Lysing	BD Biosciences	349202	Búfer de lisis de glóbulos rojos para preparación de muestras para citometría de flujo
Citómetro de flujo	BD Biosciences	FACSCanto II	Instrumento de citometría de flujo multicolor para inmunofenotipagen
Software de análisis de citometría de flujo (FACSDiva)	BD Biosciences	—	Software para adquisición y análisis de datos de citometría de flujo
Paquete gwasglue	Paquete R	—	Armonización de conjuntos de datos GWAS
Paquete ieugwasr	Paquete R	—	Interfaz a la base de datos IEU GWAS
Sistema de cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS)	Thermo Fisher Scientific	—	Utilizado para la cuantificación de isovalerilcarnitina (C5) en plasma
Solución salina de fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	AM9624	PBS estéril, pH 7.4, utilizado para lavado y resuspendención
Software R	Software de código abierto	Versión 4.4.1	Entorno de análisis estadístico
Paquete TwoSampleMR	Paquete R	—	Paquete de análisis de aleatorización mendeliana
Paquete VariantAnnotation	Bioconductor	—	Anotación de datos de variantes