Efectos sobre la calidad del ARN de las PBMC bajo diferentes tiempos de criopreservación y métodos de procesamiento en pacientes con cáncer avanzado de pulmón no de células pequeñas

Resumen

Este estudio compara el Reactivo de Triple Aislamiento (TRIzol) y la solución clásica (FBS + DMSO) para criopreservar los PBMCs de pacientes con NSCLC. TRIzol mantiene una integridad satisfactoria del ARN hasta durante 6 meses, lo que lo hace recomendado para la preservación de ARN de alta calidad.

Resumen

Las células mononucleares de sangre periférica criopreservadas (PBMC) se utilizan ampliamente en la secuenciación de ARN (RNA-seq), y la calidad de su ARN influye directamente en los resultados de las pruebas. Sin embargo, la criopreservación puede provocar fácilmente la degradación del ARN en los PBMC, y la cuestión de cómo mejorar la calidad del ARN durante la criopreservación a largo plazo sigue sin resolverse. Se utilizaron PBMCS a partir de muestras de sangre fresca recogidas de pacientes con cáncer de pulmón avanzado no de células pequeñas (NSCLC) como controles. La eficacia de preservación del ARN de las muestras de PBMC se comparó entre la solución clásica de criopreservación celular (suero bovino fetal al 90% + 10% dimetilsulfóxido [DMSO]) y el reactivo común de extracción de ARN (TRIzol) a -80 °C durante 1, 3 y 6 meses. La concentración, pureza e integridad del ARN (medida por el número de integridad del ARN [RIN]) se evaluaron utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen de múltiples muestras y un bioanalizador electroforético microfluídico automatizado para proporcionar una base teórica para la preservación de muestras de ARN de alta calidad. Este estudio demostró que la concentración, pureza e integridad del ARN en los PBMC disminuyen con la duración prolongada de la criopreservación. Aunque ambos métodos de procesamiento no afectaron a la concentración de ARN, sí afectaron la pureza e integridad del ARN. La integridad del ARN de los PBMC criopreservados con TRIzol durante 6 meses se mantuvo satisfactoria. Nuestros resultados indican que TRIzol contribuye a una criopreservación eficaz y mantiene ARN de alta calidad.

Introducción

El ARN-seq de PBMC en pacientes con CPNPC desempeña un papel fundamental en la evaluación de la eficacia de la inmunoterapia. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) es un tumor maligno común en todo el mundo, y alrededor del 70 % de los pacientes son diagnosticados en una fase avanzada con un pronóstico^{negativo 1,2}. La inmunoterapia ha revolucionado el paradigma terapéutico de los NSCLC, proporcionando estrategias terapéuticas^{innovadoras 3,4}. En el tratamiento de inhibidores de puntos de control inmunes (ICI), la secuenciación de ARN (RNA-seq) de células mononucleares periféricas de sangre (PBMC) obtenida de pacientes con CPNM puede monitorizar los cambios dinámicos en los beneficios clínicos de la^{inmunoterapia 5}. Las fuentes de muestra para RNA-seq incluyen tejido tumoral y^{PBMCs 6,7}, siendo los PBMC una muestra biológica vital tanto en ensayos clínicos como en investigación científica^{básica 8}. La criopreservación representa el método principal para el almacenamiento a largo plazo de muestras, manteniendo células y tejidos en estado de reposo mientras se preserva su potencial y características biológicas. En consecuencia, la criopreservación de PBMCs ha surgido como un enfoque factible y ampliamente adoptado. Cryopreserved PBMC facilita el análisis por lotes de muestras, minimiza la variabilidad intralaboratorio e interlaboratorio, y optimiza la utilización de recursos ^8,9. Por ejemplo, estudios han demostrado que el uso de un medio RPMI-1640 congelado suplementado con 40% de suero fetal (FCS) y 20% de dimetil sulfóxido (DMSO) para la criopreservación de PBMC demuestra que las proporciones de células T y B que expresan la combinación de CD39 y CD73 se mantuvieron relativamente estables en seis meses desde el almacenamiento¹⁰. Un estudio comparó tres kits comerciales de criopreservación y dos agentes crioprotectores (90% RPMI-10% DMSO, 90% plasma-10% DMSO), revelando una viabilidad celular similar (81,0%) y tasas de recuperación (73,7%) entre los distintos métodos. Sin embargo, todas las PBMC criopreservadas mostraron una viabilidad significativamente reducida en comparación con las muestras^{frescas 5}. Investigaciones posteriores demostraron que el PBMC resuspendido precipita en el reactivo de TRIzol y los congela inmediatamente a -80 °C. Tras 1–2 días, observaron que el valor de RIN de las PBMC era mayor que el de las muestras de sangre^{entera 11}.

Otra investigación comparó muestras de leucocitos tratadas con TRIzol, RNAlater y otros reactivos, mostrando que todos los métodos alcanzaron valores de número de integridad del ARN (RIN) >7. La integridad del ARN se evaluó utilizando un bioanalizador electroforético microfluídico automatizado, y el RIN se calculó como una medida cuantitativa de la calidad del ARN. Se consideraron adecuadas muestras con RIN ≥7 para el análisis de^{RNA-seq 12}. Cabe destacar que el grupo leucocitos + ARN más tarde mostró un rendimiento de ARN significativamente menor en comparación con el grupo leucocitos^{+ TRIzol 12}. Sin embargo, la investigación actual sobre la criopreservación de PBMC se centra predominantemente en la viabilidad celular y el análisis de fenotipos celulares inmunitarios tras el deshielo; se ha prestado atención limitada a la evaluación sistemática y a largo plazo de la calidad del ARN bajo diferentes condiciones de preservación. Además, los protocolos estandarizados para la criopreservación de muestras de PBMC para preservar la integridad del ARN siguen poco^{desarrollados} 13,14,15. Esta brecha es especialmente relevante para la inmunoterapia con NSCLC, donde el ARN de alta calidad de PBMCs recogidos longitudinalmente es esencial para el descubrimiento fiable de biomarcadores y el seguimiento de la respuesta al tratamiento.

En este estudio, planteamos la hipótesis de que la elección del método de criopreservación influye significativamente en la integridad y calidad a largo plazo del ARN derivado de PBMCs, y que un protocolo optimizado puede mantener la idoneidad del ARN para ensayos sensibles como la secuencia de ARN. Para abordar esto, se utilizaron PBMCs recién aislados de muestras de sangre recogidas de pacientes avanzados con CPNPC como controles. La eficacia de preservación del ARN de las muestras de PBMC se comparó entre dos métodos de tratamiento (90% FBS + 10% DMSO y TRIzol) a -80 °C durante 1, 3 y 6 meses (Figura 1). La concentración, pureza e integridad del ARN (medida por el RIN) se evaluaron utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen de varias muestras y un bioanalizador electroforético microfluídico automatizado. Este estudio tiene como objetivo proporcionar una base teórica para la preservación de muestras de ARN de alta calidad y avanzar en la investigación traslacional y la preservación de muestras en la medicina de precisión tumoral.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucraron muestras de tejido humano y muestras clínicas en este estudio se realizaron en cumplimiento de las directrices institucionales y fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Oncológico de Jilin (Aprobación Ética nº 202507-002-01). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes o de sus tutores legales antes de la recogida de la muestra. Se recogieron muestras de sangre periférica (10 mL por paciente) de 19 pacientes con cáncer de pulmón avanzado no de células pequeñas (NSCLC) en el Hospital de Cáncer de Jilin, arrojando un total de 133 muestras de ARN. Para garantizar la seguridad en el laboratorio, todas las operaciones que involucraban productos químicos peligrosos se realizaban en un gabinete de seguridad biológica.

La información detallada sobre los instrumentos, reactivos y consumibles utilizados en el experimento se proporcionó en la Tabla de Materiales.

Aislamiento de PBMC
Las muestras de sangre periférica se procesaron para aislamiento con PBMC en un plazo de 2 horas tras la recogida. Los PBMC fueron aislados y purificados mediante centrifugación de gradiente de densidad Ficoll-Paque a 400 × g durante 25 minutos a temperatura ambiente con el freno desactivado. Tras la centrifugación, la capa intermedia de linfocitos lechos y blancos (que contenía PBMC) fue cuidadosamente^{aspirada 16}. Es importante destacar que estandarizamos estrictamente la concentración de entrada de PBMC para cada muestra y cada grupo para asegurar un número de células consistente en todas las condiciones experimentales, minimizando así la variación causada por la entrada y procesamiento celular. Esto garantiza que las diferencias observadas reflejen efectos genuinos de distintos métodos de conservación más que la variabilidad técnica. Para cada paciente, las PBMC aisladas se dividieron en 7 tubos: uno se utilizó para la extracción inmediata de ARN y se evaluó la concentración, pureza e integridad. Los seis tubos restantes fueron criopreservados a una tasa de refrigeración de -1 °C/min: tres se trataron con 1 mL de 90% FBS + 10% DMSO, y los otros tres con 1 mL de TRIzol, seguido de almacenamiento a -80 °C. La extracción de ARN y la evaluación de la calidad se realizaron tras 1, 3 y 6 meses de almacenamiento congelado.

Extracción de ARN
Las muestras se extraían del almacenamiento a -80 °C y se descongelaban a 4 °C hasta que se descongelaban^{completamente en 17}. Las muestras conservadas con 90% de FBS + 10% de solución de criopreservación DMSO o TRIzol se lavaron una vez con PBS, centrifugaron a 200 × g durante 5 minutos a 4 °C, y se descartó el sobrenadante para conservar el pellet celular. El ARN total se extrajo usando TRIzol. Específicamente, se añadió reactivo de TRIzol al tubo de microcentrífuga que contiene la muestra procesada, se mezcló por inversión e incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos para asegurar la lisis completa. Posteriormente, se añadieron 200 μL de cloroformo, se mezclaron a fondo agitando y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Tras centrifugación a 2400 × g durante 15 minutos a 4 °C, la fase acuosa superior fue cuidadosamente aspirada y transferida a un nuevo tubo de Eppendorf. Luego se añadió isopropanol (0,5 mL), se mezcló bien e incubó a temperatura ambiente durante 5–10 minutos. Tras centrifugación a 2400 × g durante 10 minutos a 4 °C, el sobrenadante se descartaba, dejando el ARN precipitado en el fondo del tubo.

El precipitado se resuspendió en etanol al 75% (1 mL) con suave agitación, seguido de centrifugación a 1600 × g durante 5 minutos a 4 °C. El sobrenadante se descartaba y el pellet de ARN se dejaba secar al aire a temperatura ambiente durante 5–10 minutos. Finalmente, las muestras de ARN se disolvieron en agua tratada con DEPC de 50 μL e incubaron en un baño maría a 55–60 °C durante 5–10 minutos¹⁸. Detección de la concentración y pureza del ARN. La concentración y pureza de ARN se midieron utilizando el método de absorbancia ultravioleta con un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen de varias muestras (rango de medición: 2,5–3000 ng/μL). La concentración de ARN se determinó en función del valor de absorbancia en 260 nm, mientras que la pureza del ARN se evaluó utilizando la relación A260/A280. Se lanzó el software de medición; Se hizo clic en "Ácido Nucleico" en la interfaz principal. La plataforma de detección se enjuagó dos veces con agua destilada doblemente y luego se pipeteó 1,5 μL de la muestra de ARN sobre ella. Se seleccionó ARN-40 para el tipo de muestra, se pulsó "Medir" y se registraron los valores de concentración y pureza de A260/280. Una proporción A260/A280 entre 1,9 y 2,1 indicó una alta pureza de ARN, mientras que valores inferiores a 1,8 sugerían contaminación proteica y valores superiores a 2,2 indicaban posible degradación del ARN o isotiocianato^{residual 19}.

Detección de integridad de ARN
La integridad del ARN (RIN) se evaluó utilizando un bioanalizador electroforético microfluídico automatizado y un kit de detección. El RIN varía de 1 a 10, siendo 1 que indica ARN altamente degradado y 10 que indica ARN intacto. Para el análisis, se colocaron 1,2 μL de ARN en un tubo de PCR, se desnaturalizó térmicamente a 70 °C durante 2 minutos usando un ciclador térmico, y se colocó inmediatamente sobre hielo. Posteriormente, se añadió 1 μL de ARN desnaturalizado a los pozos de detección del chip para su análisis²⁰. Se lanzó el software, se seleccionó "Assay" y se seleccionó "ARN" del menú desplegable. El programa "Eucariota Total RNA Nano Series II.xsy" fue seleccionado según el reactivo utilizado. Se pulsó "Start" para iniciar la detección. Tras aproximadamente 10 minutos, se comprobó el número y la altura máxima de la escalera para comprobar si estaban normales.

Métodos estadísticos
Se realizaron pruebas de normalidad para todos los datos. Los datos normalmente distribuidos se expresaron como media ± desviación estándar (DS), mientras que los datos no distribuidos normalmente se expresaron como mediana (rango intercuartíli, IQR). Las comparaciones entre dos grupos se analizaron utilizando la prueba t pareada para datos normalmente distribuidos y la prueba no paramétrica de muestras relacionadas para datos no distribuidos normalmente. Para comparaciones entre tres o más grupos, se utilizó análisis de varianza con medidas repetidas para datos distribuidos normalmente, y la prueba no paramétrica de muestras relacionadas para datos no distribuidos normalmente. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS 19.0 y GraphPad Prism 9.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Resultados

Efectos de diferentes tiempos de criopreservación y métodos de procesamiento sobre la concentración de ARN en muestras de PBMC
El efecto de los diferentes tiempos de criopreservación: Las muestras frescas de PBMC de pacientes avanzados con NSCLC sirvieron como grupo de control. Las muestras se trataron con TRIzol o 90% FBS + 10% DMSO y se almacenaron a -80 °C durante 1, 3 y 6 meses; se extrajo ARN total para medir la concentración de ARN. Para las muestras tratadas co...

Discusión

Muchos factores influyen en la calidad del ARN en muestras biológicas, incluyendo variables preanalíticas, condiciones de transporte, duración del procesamiento a temperatura ambiente, necrosis tisular, temperatura y productos de congelación, tamaño y número de alicuotas, así como la duración del almacenamiento, tienen un impacto significativo en la calidad del^{ARN 21}. Para muestras idénticas, las variaciones en el tiempo de criopreservación y en los métodos de pro...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bioanalizador Agilent 2100	Agilent	G2939B	Detección de la integridad del ARN, evaluación de la calidad del ARN generando el Número de Integridad del ARN (RIN)
Nanokit de ARN 6000 de Agilent	Agilent	5067-1511	En conjunto con el bioanalizador Agilent 2100, que proporciona reactivos y chips dedicados para la integridad del ARN
Centrifugadora	Eppendorf y Eppendorf;	5424R	Para extraer ARN
Centrifugadora	Eppendorf y Eppendorf;	5810R	Para extraer PBMC
Cloroformo	Corporación del Grupo Farmacéutico Nacional de China	20191031	Para la extracción de ARN mediante el método Trizol, se utiliza para separar la fase acuosa que contiene ARN de la fase orgánica que contiene impurezas
Dimetilsulfóxido	Beijing Dingguo Changsheng	DH105-2	Como solución de criopreservación para PBMC, permitiendo el almacenamiento a largo plazo de muestras a -80 ºC; C
Tubo	Corning	MCT-150-C	Para almacenamiento de muestras, mezcla de reactivos, centrifugación y otras operaciones experimentales
Etanol	Shandong Lierkang	25071901A	Extracción de ARN IIn mediante el método Trizol, utilizada para lavar precipitados de ARN y eliminar residuos
Suero fetal bovino	Xpbiomed	C04001-500	Como solución de criopreservación para PBMCs, permitiendo el almacenamiento a largo plazo de
Solución de separación de Ficoll	Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology CO., LTD	CC0161	Para aislamiento y purificación de PBMC mediante centrifugación por gradiente de densidad
Ciclador térmico GeneTouch(Plus)	Bioer	TC-EA-48DA	Para la desnaturalización térmica del ARN (70 y grados; C durante 2 minutos), seguido de la detección con el bioanalizador
Isopropanol	Corporación del Grupo Farmacéutico Nacional de China	20210929	En la extracción de ARN mediante el método Trizol, utilizado para la precipitación de ARN
Espectrofotómetro Nanodrop 8000	GeneCompany	ND-8000	Para concentración de ARN (basada en la absorbancia a 260 nm) y pureza (basada en la relación A260/A280) usando el método de absorbancia ultravioleta
Tubos de PCR	Corning	PCR-02-C	Para la desnaturalización térmica del ARN (70 y grados; C durante 2 minutos), seguido de la detección con el bioanalizador
Suero tamponado con fosfato	Sistema Procell	PB180327	Para la lisis directa y preservación de PBMCs, o ARN total posterior
Reactivo de Triple Aislamiento	Adsin	ads60154	Para la lisis directa y preservación de PBMCs, o ARN total posterior