Artículo de método

Mapeando la inmunidad infantil con entrada mínima: perfilado integrativo de células únicas y multiómico

DOI:

10.3791/70279

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3 de abril de 2026

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1Department of Pediatrics, Yale University School of Medicine, 2Department of Biomedical Informatics and Data Science, Yale University School of Medicine, 3Department of Biostatistics, Yale University School of Public Health, 4Center for Systems and Engineering Immunology, Yale University, 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 6Department of Obstetrics, Gynecology, & Reproductive Sciences, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe la recogida y preservación de muestras de sangre de pacientes neonatales y pediátricos, así como la aplicación de scRNA-seq, proteómica y citometría de flujo espectral para caracterizar las poblaciones celulares inmunitarias de estas muestras.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Al nacer, el sistema inmunitario neonatal se enfrenta abruptamente a un entorno radicalmente diferente, rico en estímulos microbianos y ambientales. Cada vez hay más evidencia que sugiere que la inmunidad en la primera infancia no es simplemente inmadura, sino que está adaptada de forma única para satisfacer las demandas específicas de esta ventana de desarrollo. Durante este periodo, el sistema inmunitario es altamente dinámico, experimentando cambios rápidos para adaptarse al paisaje externo cambiante. Comprender este complejo y cambiante panorama inmunitario requiere un estudio directo en neonatos. Sin embargo, una limitación importante en estas investigaciones es el bajo volumen sanguíneo total en neonatos (~100 mL/kg), que limita la cantidad que se puede recoger de forma segura para la investigación, especialmente en bebés extremadamente bajos al nacer (ELBW) o en bebés extremadamente prematuros. En nuestro trabajo reciente, abordamos esta limitación demostrando cómo se puede realizar un perfil inmunitario de alta dimensión utilizando volúmenes diminutos de sangre neonatal. Introducimos un conjunto de protocolos optimizados para el muestreo longitudinal a lo largo de la vida temprana y aplicamos técnicas avanzadas, incluyendo citometría de flujo, proteómica y secuenciación de ARN unicelular, para maximizar la información obtenida con una entrada mínima. En conjunto, estos métodos permiten una visión completa de las firmas transcriptómicas y proteómicas de las células inmunitarias circulantes en neonatos, ofreciendo nuevas perspectivas sobre la trayectoria única de la inmunidad en la vida temprana.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo está optimizado para 100-250 μL de muestras de sangre procesadas en un plazo de 12 horas tras la recogida, ya sea criopreservadas o utilizadas de inmediato. Al nacer, el sistema inmunitario neonatal es lanzado a un entorno radicalmente diferente, enriquecido con estímulos microbianos y ambientales que antes estaban ausentes en el entorno intrauterinoprotegido 1,2. Este cambio requiere que el sistema inmunitario se adapte y responda a una gran variedad de nuevos antígenos, un proceso esencial para la supervivencia pero que también plantea desafíossignificativos 1,2. Cada vez más evidencia sugiere que la inmunidad en la primera edad no es simplemente inmadura ni una versión en miniatura del sistema inmunitario adulto. En cambio, está especialmente adaptado para satisfacer las necesidades específicas de este periodo crítico de desarrollo 3,4. Durante esta ventana neonatal, los componentes celulares del sistema inmunitario, incluidos varios tipos de células T, células B y células mieloides, maduran y desarrollan características y funciones únicas específicas de la vidatemprana 5,6,7,8. A pesar de su importancia, la inmunidad neonatal sigue siendo difícil de estudiar directamente debido a limitaciones éticas y prácticas. Una limitación importante es el bajo volumen sanguíneo en los recién nacidos, que promedia ~100 mL/kg 9,10. Este desafío se hace aún más evidente al recoger sangre de bebés extremadamente prematuros (nacidos antes de las 30 semanas de gestación) y de bebés ELBW, que pueden pesar tan solo 400 g con solo 40 mL de sangre circulante. Esto limita la cantidad de sangre que se puede recoger de forma segura, subrayando la necesidad de enfoques que maximicen el rendimiento de datos a partir de muestras mínimas. Para abordar este desafío, nuestro trabajo demuestra protocolos optimizados para el perfilado inmunitario de alta dimensión utilizando volúmenes sanguíneos minúsculos (100-250 μL), como los obtenidos de bebés ELBW.

Los avances recientes en la recogida y procesamiento de sangre han permitido el estudio de las respuestas inmunitarias en poblaciones donde la adquisición de muestras es tradicionalmente difícil. Dispositivos de microaguja como los sistemas de flebotomía Tasso y Touch Activated se desarrollaron inicialmente para una recogida de sangre cómoda en casa en adultos. Desde entonces se han adaptado para su uso en bebés, permitiendo a los cuidadores principales y equipos clínicos recoger muestras con molestias mínimas. Además, pueden usarse en casa sin el estrés de visitas clínicasrepetidas, facilitando el cumplimiento y la accesibilidad. Debe utilizarse un microtubo de ácido etilendidiaminético tetraacético (EDTA) con el dispositivo y enviarlo durante la noche al laboratorio cumpliendo con los protocolos adecuados de biohazard. A la mañana siguiente, cuando lleguen las muestras, deben procesarse utilizando métodos de lisis de glóbulos rojos (RBC) para capturar células inmunitariascirculantes 6. Cabe destacar que los tubos EDTA permiten aislar las células vivas, pero las consideraciones temporales son importantes. Para ensayos funcionales con estimulación, las muestras deben procesarse en menos de 4 horas y, idealmente, en menos de 2 horas desde la recogida. Para los ensayos fenotípicos no funcionales presentados a continuación, las muestras deben procesarse en un plazo de 12 horas para permitir el envío nocturno y asegurar la recuperación, ya que la viabilidad celular disminuye con eltiempo 12. En comparación con la separación tradicional por gradiente de densidad con Ficoll, la lisis es más rápida, menos laboriosa y produce una mayor recuperación13. Sin embargo, el aislamiento celular mononuclear en sangre periférica por lisis puede dejar granulocitos contaminantes, reduciendo la pureza, pero puede ser ventajoso para estudios interesados en estos tiposcelulares 14. Estos compromisos destacan cómo las adaptaciones metodológicas equilibran viabilidad y precisión al estudiar muestras clínicas raras o sensibles, como las de neonatos. El manejo posterior de células aisladas también se ha beneficiado de mejoras metodológicas. La criopreservación con suero bovino fetal (FBS) y dimetilsulfóxido (DMSO) sigue siendo un enfoque robusto para las células inmunitarias, especialmente en sangre fetal y neonatal, donde la viabilidad y recuperación celular son críticas. Además de optimizar el proceso de recogida de sangre, también hemos adoptado técnicas posteriores que permiten extraer la máxima información de pequeños volúmenes de muestras. Introducimos un conjunto de protocolos optimizados que facilitan el muestreo a lo largo de la vida temprana, permitiendo un examen detallado de la dinámica inmune a lo largo del tiempo. Nuestro enfoque aprovecha técnicas avanzadas como la citometría de flujo espectral, la proteómica y la secuenciación de ARN unicelular, que en conjunto ofrecen una visión sin igual de las firmas proteómicas y transcripcionales de las células inmunitarias circulantes en la vida temprana. Además, la citometría de flujo espectral ofrece oportunidades para obtener conocimiento funcional con una entrada celular mínima.

A lo largo de los años, se han utilizado varias técnicas, como los hemogramas completos (hemogramas), para analizar células inmunitarias derivadas dela sangre 15, mientras que otras han analizado proporciones de células inmunitarias en muestras neonatales de sangre total utilizando la metilación delADN 16,17. Aunque estas técnicas han sido útiles para aprender las proporciones de las células inmunitarias conocidas, todavía existen limitaciones en nuestra capacidad para obtener una visión profunda de las células sin un sistema multiómico. Los hemogramas solo proporcionan medidas generales de los principales tipos de células sanguíneas, lo que los hace útiles para establecer el estado inmunitario general en un entorno clínico, aunque limitados en su capacidad para resolver subtipos o estados funcionales. Más recientemente, los estudios han comenzado a abordar esta limitación empleando cambios transcriptómicos y metabolómicos derivados del plasma en bebés tan pronto como en la primera semana devida 18. La proteómica basada en espectrometría de masas se ha adaptado para estudiar perfiles inmunitarios en muestrasneonatales 19. Este enfoque es eficaz para medir una amplia gama de proteínas de manera imparcial e identificar posibles biomarcadores. Sin embargo, las principales limitaciones incluyen la necesidad de una aportación relativamente grande de proteínas y la falta de información directa sobre la identidad celular, a pesar de capturar tanto proteínas solubles como insolubles. El ensayo multiplex dirigido de proteómica (TMPA) ofrece alternativas para muestras de baja entrada. Estos métodos utilizan detección dirigida basada en anticuerpos, proporcionando un perfil de alta sensibilidad para muestras con material limitado. Uno de ellos, en particular, se ha utilizado para seguir longitudinalmente las trayectorias del desarrollo inmunitario en la vidatemprana 20.

La citometría de flujo permite el análisis cuantitativo de proteínas de células inmunitarias a nivel de célula única mediante el paso de células marcadas fluorescentemente a través de un haz láser enfocado y la medición de la dispersión de luz y las señales de fluorescencia resultantes. En esta técnica, los anticuerpos marcados con fluorescencia se unen a proteínas específicas de superficie o intracelulares. Esto permite la detección y cuantificación simultáneas de múltiples subtipos de células inmunitarias y sus características definitorias basadas en sus perfiles de fluorescencia. La citometría de flujo espectral amplía este enfoque capturando todo el espectro de emisión de cada fluorocromo, permitiendo una desmezcla espectral precisa y la detección simultánea de más de 35 marcadores en un solo ensayo 21,22,23. Esto permite analizar muchos más marcadores que los paneles convencionales de citometría de flujo, que están limitados a ~8-12 marcadores. Complementando estas técnicas citométricas, la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) ha transformado los estudios inmunológicos al permitir un perfil transcriptómico de alta resolución y sesgo a partir de material de entradamínimo 24. A pesar de los mayores costes y la dependencia de la viabilidad celular, el scRNA-seq proporciona conocimientos inigualables sobre la heterogeneidad inmunitaria en la vida temprana en comparación con la secuenciación masiva. En conjunto, estos avances demuestran cómo se están adaptando innovaciones en la recopilación, preservación y análisis para superar los desafíos únicos de estudiar la inmunidad fetal y neonatal.

Este protocolo ha sido optimizado para el análisis de células inmunitarias periféricas criopreservadas aisladas mediante lisis serial de glóbulos rojos. Los investigadores deberían considerar este protocolo si sus estudios requieren un perfil inmunitario de alta resolución a partir de pequeños volúmenes de sangre (100-500 μL), especialmente cuando el análisis longitudinal es crítico. El método es ampliamente aplicable tanto a neonatos a término como prematuros y es compatible con una amplia gama de análisis posteriores, lo que lo hace adecuado para diversas cuestiones de investigación en inmunología neonatal y pediátrica.

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Protocolo

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Se garantizó el consentimiento informado de los padres y el pleno cumplimiento de las normativas éticas nacionales pertinentes de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Yale. Según lo especificado en el protocolo aprobado del IRB, los padres fueron contactados por el equipo de investigación durante la primera semana tras el nacimiento del bebé para obtener el consentimiento previo a la inscripción. No se iniciaron procedimientos de estudio con materiales de origen humano antes de la aprobación ética documentada.

1. Recogida, procesamiento y almacenamiento de muestras (Figura 1)

  1. Recogida de sangre en régimen de hospitalización
    1. Recoger y procesar muestras de bebés tras recibirlas, almacenarlas a 4 °C y procesar en un plazo de 12 horas tras la recogida.
    2. Recoge ~250 μL de sangre entera y guárdala en un tubo de extracción de sangre anticoagulante EDTA. Invierte el tubo de extracción de sangre 8 veces para mezclar el anticoagulante.
    3. Proceda a procesar la sangre entera mediante lisis de sangre roja como se describe en la Sección 1.3 (procesamiento de muestras de sangre total).
    4. Para recoger las manchas de sangre seca, utiliza la lanceta estéril para hacer una perforación en el dedo del pie/talón limpios.
      1. Alternativamente, pipetear ~25-30 μL de sangre del tubo EDTA sobre el papel filtrante. Toca suavemente el filtro con la gota de sangre.
    5. Llena al menos un círculo con sangre que fluye libremente, una gota por círculo. Deja que la mancha de sangre se seque. Mantén el papel de filtro abierto hasta que las manchas de sangre estén completamente secas.
    6. Etiqueta adecuadamente con la hora de recogida, fecha de procesamiento, fecha temporal e identificación del espécimen.
    7. Mete en una bolsa de plástico transparente con cremallera. Guarda las tarjetas de manchas de sangre a −20 °C o −80 °C para una estabilidad prolongada hasta estar lista para análisis proteómico.
  2. Extracción ambulatoria de sangre
    NOTA: Con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Yale, a los padres de los participantes ambulatorios se les dio la opción de recoger muestras de sangre en casa utilizando un dispositivo de auto-recogida con microaguja. Este dispositivo obtiene sangre capilar mediante una lanceta aplicada a la piel. Los padres que eligieron este método recibieron formación en clínica utilizando kits de demostración y posteriormente se les proporcionaron instrucciones escritas detalladas y kits de recogida para uso doméstico.
    1. Lávate las manos y ponte guantes antes de usarlos. Recoge todos los objetos necesarios, incluido un espejo si solo uno de los padres realiza la recogida de sangre.
    2. Saca el dispositivo del kit de herramientas y desconecta la tapa de un tubo compatible.
    3. Presiona el tubo contra el dispositivo hasta que quede bien ajustado con las líneas de relleno hacia fuera.
    4. Quita el pañal del bebé y mantenlo erguido.
    5. Sigue las instrucciones de la bolsa de calor para activarte.
      NOTA: Si no hay un paquete disponible, utiliza algún otro método de calentamiento, como una mano.
    6. Sujeta la bolsa térmica en el sitio (glúteos) durante 2-4 minutos para calentar y aumentar el flujo sanguíneo.
    7. Limpia la zona con una compresa con alcohol y déjala secar.
    8. Quita la tapa transparente del botón rojo. Despega la lengüeta del dispositivo y pégalo firmemente en la parte más completa de los glúteos del bebé manteniéndolos erguidos.
      NOTA: Ajusta su postura según sea necesario para mantener el tubo completamente vertical y así obtener una correcta recogida de sangre.
    9. Pulsa el botón hasta abajo una vez y suelta. Pon el temporizador para 5 minutos. Observa cómo se llena el tubo usando el espejo según sea necesario.
    10. Puede que la sangre no aparezca durante los primeros 1-2 minutos. Retira el dispositivo después de un máximo de 5 minutos en total o antes si la sangre llega a la línea indicadora superior antes de 5 minutos.
    11. Quita el tubo del dispositivo con un ligero giro y tira hacia abajo. Rápidamente engancha la tapa completamente al tubo. Invierte el tubo al menos 10 veces, asegurándote de que la sangre toque la tapa en cada inversión para evitar la coagulación.
    12. Envía las muestras durante la noche tras la recogida.
  3. Procesamiento de muestras de sangre total
    1. Procesa muestras de sangre en un armario de seguridad biológica.
    2. Transfiera cuidadosamente los 250 μL de sangre a un tubo cónico de 50 mL que contiene 10 mL de 1x tampón de lisis para glóbulos rojos. Enjuaga el tubo de extracción de sangre con 10 mL de buffer de lisis para glóbulos rojos hasta que se vacíe. Deja que las células se lisen a temperatura ambiente (RT) durante 15 minutos.
    3. Una vez completada la lisis, añade ~30 mL de PBS en tiempo de descanso para lavar y centrifugar a 430 × g durante 5 minutos a 4 °C. Aspira el sobrenadante usando un vacío, sin alterar el pellet.
    4. Continúa transfiriendo y enjuagando la muestra según lo indicado en el paso 1.3.2 hasta que el pellet celular parezca libre de glóbulos rojos visibles. Centrifuga a 430 × g durante 5 minutos y luego retira cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el perdigón.
    5. Por cada 250 μL de sangre recogida, se resuspende el pellet celular resultante en 2 mL de medio congelante (10% de DMSO en FBS) y se divide en dos crioviales para su conservación.
    6. Comprueba la viabilidad celular contando las células resuspendidas en medios feezantes con un hemocitómetro usando exclusión azul de tripán.
    7. Transfiere 1 mL del paso 1.3.5 a cada criovial. Etiqueta adecuadamente con la hora de la recogida, fecha de procesamiento, momento y la identificación de la muestra.
    8. Guarda el criovial intermedio a -80 °C en un recipiente congelante con isopropanol. Tras 24 horas, transfiere el(los) criovial(es) a nitrógeno líquido hasta que esté listo para el análisis.

2. TMPA a partir de manchas de sangre seca (DBS) (Figura 2)

  1. El día del procesado, lleva el papel filtro a RT. Con una perforadora metálica de 3 mm, perfora 2-3 círculos en el papel de filtro por donde pasó la sangre, lo más central posible en la zona de sangre.
  2. Recoge cada punzón de 3 mm con pinzas y añade a un pozo de una placa de 96 pozos o un tubo PCR de baja unión que contenga 20 μL de tampón de elución (1x PBS, 1x inhibidor de proteasa, 0,05% Tween 20). Asegúrate de que el punzón esté cubierto por un buffer de elución.
  3. Cierra los tubos o cubre la placa con una faldilla de plástico y colócalos sobre un vórtice digital que gire a 600 rpm durante 60 minutos en RT.
  4. Al final de la incubación, transfiere cuidadosamente el eluato a un nuevo tubo de baja unión o a una placa de 96 pozos. Desecha los tubos o la placa con los punzones filtrantes.
  5. Cuantifica el contenido de proteínas usando un ensayo BCA.
    1. Toma 2 μL de cada muestra o estándar de BSA para obtener diluciones en serie de 1:10 y 1:100 en agua. Prepara muestras y estándares en duplicado añadiendo 15 μL de muestras diluidas o estándar a 200 μL de solución de trabajo 1x. Incubar muestras durante 30 minutos a 37 °C.
    2. Lee la señal a 562 millas náuticas en un lector de placas. Calcular la concentración final de proteínas basándose en la pendiente estándar de la BSA y el fondo del tampón de elución.
  6. Haz aalícuotas de 30 μL para muestras de 0,5-1 mg/mL en microtubos de tapa roscada de baja unión y 1,5 mL. Congelar las muestras a -80 °C para su posterior envío y procesarlo mediante el servicio TMPA.

3. Citometría de flujo espectral de sangre lisada por glóbulos rojos (Figura 3)

  1. El día del experimento, descongela rápidamente un vial de células lisadas por glóbulos rojos en un baño maria a 37 °C hasta que quede una pequeña gota de hielo.
  2. Añadir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL que contiene 10 mL de RPMI completo precalentado (37 °C) (preparado con 500 mL de RPMI 1640, 50 mL de FBS, 5,6 mL de penicilina-estreptomicina y 5,6 mL de suplemento de glutamina). Centrifuga a 400 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Retira y descarta cuidadosamente el sobrenadante.
  3. Resuspende suavemente el pellet en 3 mL de RPMI completo y determina el recuento de células usando un método adecuado.
  4. Centrifuga las celdas resuspendidas a 400 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Aspira y desecha el sobrenadante.
  5. Ajusta la concentración de la celda a 1 × 106 células/mL en RPMI completo. Dispensar 100 μL por pozo (0,1 × 10⁶ celdas) en una placa inferior en V de 96 pozos. Centrifuga a 764 × g durante 2 minutos a 4 °C y retira el sobrenadante.
  6. Añadir 100 μL de tinte vivo/muerto en PBS a una dilución 1:2.000 con bloque Fc y bloque de monocitos (dilución 1:100) a todas las muestras, excepto al control sin teñir. Incuba durante 15 minutos a 4 °C.
  7. Lava con 100 μL de PBS y centrifuga a 764 × g durante 2 minutos a 4 °C. Descarta cuidadosamente el sobrenadante.
    NOTA: Es imprescindible usar bloque Fc y bloque de monocitos para evitar cualquier unión inespecífica de los anticuerpos.
  8. Añadir 100 μL del cóctel superficial diluido (dilución 1:200) en un tampón FACS (500 mL de PBS, 2,5 g de albúmina sérica bovina (BSA), 2 mM EDTA, pH 8,5) a todas las muestras, excepto al control sin tintar. Incuba durante 30 minutos a 4 °C.
  9. Lavar con 100 μL de tampón FACS y centrifugar a 764 × g durante 2 minutos a 4 °C. Descarta cuidadosamente el sobrenadante.
  10. Fija las células añadiendo 100 μL de paraformaldehído al 4% a cada muestra. Incubar durante 15 minutos en tiempo de descanso en la oscuridad.
  11. Lavar con 100 μL de tampón FACS, centrifugar a 764 × g durante 2 minutos a 4°C y volver a suspender en 200 μL de tampón FACS.
  12. Prepara cuentas ultra-comp como controles de un solo color. Teñe las perlas de control de un solo color usando el mismo protocolo que las muestras, incluyendo la fijación si las muestras estaban fijas.
  13. Preparar controles fluorescentes menos uno (FMO) usando el mismo procedimiento que para las muestras.
    NOTA: Es importante tratar los controles de color único y los FMO de la misma manera que las muestras. Por ejemplo, si las muestras se fijan tras la tinción, también deberían fijarse los FMO y los controles de color único.
  14. Ejecuta las muestras, controles de color único, controles sin teñir y controles FMO en un citómetro de flujo convencional/espectral. Analiza los datos usando software.
  15. Establece las puertas basadas en los controles apropiados de isotipo y FMO. Primero, las celdas de puerta seleccionan la población de leucocitos usando el gráfico de dispersión directa (FSC) frente a dispersión lateral (SSC), que ayuda a excluir los residuos y seleccionar celdas según su tamaño y granularidad.
  16. Tras la selección de leucocitos, se excluyen las celdas de puerta para excluir dobletes usando un gráfico del área de dispersión directa (FSC-A) frente a la altura de dispersión directa (FSC-H).
    NOTA: Esto garantiza la selección de celdas individuales (singletes), considerando las celdas a lo largo de la diagonal como singletes, mientras que los dobletes y grupos se excluyen.
  17. Células de compuerta para la viabilidad usando un colorante de viabilidad para excluir células muertas, asegurando que el análisis posterior incluya solo células vivas.
  18. Tras estos primeros pasos de gating, se bloquean aún más las células vivas individuales para marcar líneas específicas y subcategorizar diferentes poblaciones de células inmunitarias. Dividir las células vivas en células mieloides CD33+ y linfocitos CD33 basándose en la expresión de CD33.
  19. Dentro de la población de CD33+ , diferenciar los monocitos CD14+ e identificar las células dendríticas (DC) CD11c+ como células que expresan CD11c pero no CD14.
  20. Dentro de la población de linfocitos CD33, se utilizan las células T CD3+ y subcompuertas para identificar subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ .
  21. Además, identificar células natural killer (NK) CD56+ por expresión de CD56, y células B CD19+ de puerta por expresión de CD19.

4. scRNA-seq de sangre lisada por glóbulos rojos (Figura 4)

  1. Descongelar un vial de células lisadas con glóbulos rojos criopreservados en un baño maria a 37 °C. Añade la muestra a 10 mL de medio de células T en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 430 × g durante 5 minutos a 4 °C. Descarta el sobrenadante.
  2. Añade otros 10 mL de 1x PBS a la muestra. Centrifugar a 430 × g durante 5 minutos a 4 °C. Descarta el sobrenadante.
  3. Cuenta las células y evalúa la viabilidad con azul de tripán. Si la viabilidad es inferior al 70%, procede a la eliminación de células muertas con el kit de eliminación de células muertas.
    1. Eliminación de celda muerta
      1. Diluye el Binding Buffer Stock 20x usando agua estéril y doble destilada para obtener una solución funcional 1x.
      2. Suspender el pellet celular en 100 μL de microperlas para eliminar células muertas por cada 1 × 107 células en total. Mezcla bien y incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT).
      3. Inserta la columna de separación magnética en el soporte magnético correspondiente. Enjuaga la columna con 500 μL de 1x Binding Buffer para equilibrar antes de usarla.
      4. Lleva el volumen de la celda a 500 μL con un buffer de unión 1x. Aplica la suspensión de celda a la columna y recoge el flujo en un nuevo tubo microcentrífuga de 1,7 mL.
      5. Lava 2 veces con 500 μL de buffer de atadura. Recoge el flujo en el mismo tubo de microcentrífuga.
      6. Centrifuga el eluato a 300 × g durante 10 minutos. Descarta el sobrenadante.
    2. Cuenta las células y evalúa su viabilidad con azul de tripán.
    3. Resuspender 20.000 células viables en 40 μL de PBS con un 0,04% de BSA en un nuevo tubo microcentrífuga de 1,7 mL.
    4. Envía las células a hielo inmediatamente a una instalación de núcleo genómico para la generación y secuenciación de bibliotecas. Recopila los resultados de secuenciación en formato de salidas de Cell Ranger.

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Resultados

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Recogimos tarjetas DBS de 10 bebés extremadamente prematuros en tres momentos: 1 semana (n = 12), 1 mes (n = 7) y 2 meses (n = 3) para el análisis proteómicode TMPA 6 (Figura 2A). Estas muestras se analizaron junto con sangre de cordón umbilical infantil a término (TCB; n = 4) y sangre adulta sana (AB; n = 5). La expresión proteica normalizada (NPX) de 92 proteínas relacionadas con el sistema inmunitario se cuantificó utilizando la pl...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obtener datos inmunológicos de alta calidad a partir de volúmenes mínimos de sangre neonatal e infantil requiere adaptaciones metodológicas a lo largo de múltiples etapas. En este protocolo, describimos cuatro estrategias complementarias: (i) recogida de sangre optimizada y criopreservación para preservar células viables para uso posterior, (ii) aplicación de citometría de flujo espectral para inmunofenotipado multiparamétrico, (iii) scRNA-seq para resolver la heterogeneidad inmune a alt...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos las siguientes instalaciones centrales en Yale: núcleo de Citometría de Flujo de Yale; Centro Yale de Análisis Genomico. Agradecemos al Centro de Investigación Clínica de Yale, a la Oficina de Desarrollo de Médicos-Científicos y Científicos de Yale, y al Programa de Desarrollo de Científicos Críticos y Trauma Pediátricos/NICHD. Los estudios de respirometría fueron realizados por el Chemical Metabolism Core de la Universidad de Yale. Este trabajo fue financiado mediante subvenciones a: P01 AI179570 (L.K.), R01AI171980 (L.K.), R01DK129552 (L.K.), R01HL163043 (L.K.), Fundación para la Fibrosis Quística (L.K.); K08 AI177743 (N.N.B.), Hartwell award (N.N.B.); K08DK133687 (O.O.), Escuela de Medicina de Yale, Departamento de Pediatría (O.O.); R01AI123204 (C.R.O). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. La Figura 1 fue creada en BioRender. Gawon, K. (2025) https://BioRender.com/7embw10.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific y nbsp;15575-038 
1x Búfer de Lisis de los glóbulos rojos Invitrogen 3177165 
Kit de análisis de proteínas BCA y nbsp;Abcam ab287853 
Microtubo BD Microtainer MAPFisher Scientific & nbsp;22-253-270
Bel-Art Cryo-Safe -1° C Controlador de congelación  Millipore Sigma 41122800 
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-Aldrich & nbsp;A9647-100G 
Brilliant Ultra Violet 496 Anti-Humano CD3 Thermo Fisher Scientific y nbsp;364-0038-42 
Brilliant Ultra Violet 661 anti-humano CD11c BD BioCiencias  612968 
Brilliant Vil750 Anti-Humano CD14 BioLegend 367135 
Brilliant Violet 570 Anti-Human CD8a BioLegend 301038 
Brilliant Violet 711 Anti-Humano CD56 BioLegend 318336 
cOmplete, Mini, cóctel inhibidor de proteasas libre de EDTAMillipore Sigma 11836170001 
Kit para retirar células muertas  Miltenyi Biotec 130-090-101 
Dimetil Sulfóxido (DMSO) Thermo Fisher Scientific y nbsp;BP231-100 
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS), sin calcio, sin magnesio y nbsp;Thermo Fisher Scientific y nbsp;14190144 
Suero fetal bovino (FBS) y nbsp;Gibco y nbsp;A5256801 
Mezclador digital de vórtices Fisherbrand  Thermo Fisher Scientific y nbsp;02215418 
Buffer de Fijación  BioLegend 420801 
Suplemento GlutaMAXGibco y nbsp;35050061 
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 
Columnas de MS Miltenyi Biotec 130-042-201 
NombreCompañíaNúmero de catálogo
Separador OctoMACS Miltenyi Biotec 130-042-109 
Azul Pacífico Anti-Humano CD4 y nbsp;BioLegend 344619 
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific y nbsp;15140-122 
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Referencias

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