Con el creciente interés en la inmunoterapia intratumoral, es esencial seleccionar modelos tumorales accesibles y prácticos. Los tumores subcutáneos son fáciles de establecer pero difíciles de visualizar y manipular. En este protocolo, describimos métodos para generar tumores intradérricos que proporcionan mejor visibilidad y accesibilidad.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Implantación de tumores intradérmicos como modelo robusto para estudios de inmunoterapia intratumoral del cáncer de murino
En este artículo
Resumen
Resumen
Establecer modelos reproducibles de tumores murinos es esencial para evaluar la biología del cáncer y las estrategias de inmunoterapia. La inmunoterapia intratumoral trata tumores establecidos con reactivos inmunoestimulantes para revertir la inmunosupresión local y estimular la inmunidad antitumoral sistémica. La mayoría de los estudios sobre cáncer en ratones establecen los tumores en el espacio subcutáneo, lo que presenta desafíos inherentes para la inmunoterapia intratumoral experimental debido a la imposibilidad de visualizar las inyecciones intratumorales. La inyección intradérmica de células tumorales proporciona un enfoque fiable para generar tumores visualizables que apoyan la inyección intratumoral precisa y reproducible y el monitoreo de la cinética del crecimiento y las respuestas terapéuticas. Aquí presentamos una metodología reproducible para establecer y tratar tumores intradérmicos utilizando el modelo murino de melanoma B16F10 en ratones C57BL/6 como ejemplo. Las suspensiones de células tumorales se inyectan intradérmicamente y, 7–10 días después de la implantación tumoral, cuando los tumores alcanzan ~60mm 3, se puede aplicar directamente una inyección intratumoral de agentes inmunoestimulantes o un tratamiento físico como electroporación o calefacción. Esto permite la administración precisa de tratamientos y la medición del crecimiento tumoral con calibradores, evitando así el desafío de la variabilidad inherente de múltiples tratamientos de tumores subcutáneos que no pueden visualizarse. Al ofrecer una visión detallada de esta técnica, este artículo pretende apoyar la reproducibilidad y avanzar en la investigación preclínica en inmunoterapia intratumoral.
Introducción
Los modelos de tumores murinos constituyen una herramienta indispensable en la investigación del cáncer. En un modelo murino óptimo, sería posible inducir tumores que imiten estrechamente a los humanos tanto a nivel genético comomorfológico 1. Esto permite la evaluación y eficiencia de nuevos enfoques terapéuticos en diferentes campos, incluida la inmunoterapia intratumoral (ITIT). ITIT es un campo emergente en el tratamiento del cáncer que consiste en administrar directamente agentes inmunoestimulantes en el microambiente tumoral (TME). Esta administración localizada puede potenciar la activación inmunitaria local, revertir el microambiente tumoral inmunosupresor y desencadenar respuestas inmunitarias sistémicas antitumorales, conocidas como efectoabscopal 2. Sin embargo, la eficiencia, precisión y consistencia de la administración intratumoral dependen de la capacidad para visualizar y controlar los parámetros de inyección en diferentes modelos tumorales.
La mayoría de los estudios preclínicos sobre cáncer utilizan la implantación de tumores subcutáneos. Sin embargo, este enfoque tiene limitaciones en las terapias intratumorales porque el tumor no puede visualizarse directamente durante la inyección a menos que se realice una cirugía. Muchas estrategias de inmunoterapia intratumoral requieren la administración precisa de reactivos en pequeños tumores de ratón y a menudo implican realizar esa tarea varias veces. Sin confirmación visual, la precisión de la inyección y la retención de reactivos dentro de los tumores subcutáneos se convierten en variables mal controladas. Esto podría resultar en una mala interpretación o variación de los datosexperimentales 3.
La implantación tumoral intradérmico proporciona una alternativa directa, accesible, visualizable y reproducible para la observación, medición e inyección intratumoral, mejorando así la consistencia. Además, estudios han demostrado que los tumores implantados intradérmica, en lugar de las inyecciones subcutáneas, aumentan la inmunogenicidad y suprimen la tumorigenicidad de las célulastumorales 4. Los tumores inyectados intradérmicamente indujeron un rápido y fuerte tráfico celular dendrítico hacia los ganglios linfáticos, lo que resultó en una activación más temprana y robusta de células T citotóxicasespecíficas del tumor 4. El presente estudio describe un protocolo detallado y reproducible para establecer tumores intradérmicos de melanoma B16F10 en ratones C57BL/6 y realizar tratamientos intratumorales posteriores.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación y en cumplimiento de las directrices del Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) 5. Todos los procedimientos a los animales se realizaron en la Instalación Animal de Dartmouth. Hembras C57BL/6 ratones, de 6 a 8 semanas de edad, fueron alojadas en condiciones estándar en estantes ventilados con comida y agua. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Afeitar ratones
NOTA: Todo el personal debe completar formación institucional en manejo de animales vivos y anestesia antes de realizar estos procedimientos.
- Antes de la inyección intradérmica, afeitar el flanco de cada ratón como se describe a continuación; el flanco derecho se utilizó para las inyecciones y los procedimientos descritos. Afeita a los ratones el día antes de inyectar células tumorales.
- Coloca el ratón sobre una superficie estable. Sujeta al ratón por la piel de la nuca con el pulgar y el índice izquierdos, y mete suavemente el lado izquierdo del cuerpo en la palma para exponer el derecho. Utiliza los dedos anular y/o meñique para sujetar la pierna y la cola izquierdas, asegurando que el flanco derecho quede completamente expuesto.
- Afeita el pelaje desde la pata trasera hasta las costillas inferiores para crear un área libre para la inyección.
- Ambos flancos pueden ser afeitados si se necesita espacio adicional para practicar.
NOTA: Los principiantes pueden anestesiar ratones cuando aprenden a afeitarse y a limpiar correctamente.
2. Practicar inyecciones con colorante
NOTA: La práctica puede realizarse tanto en ratones vivos (anestesiados) como en ratones eutanasiados, y en cualquiera de los sexos. Los ratones machos suelen tener la piel más gruesa y menos maleable en comparación con las hembras, lo que hace que el procedimiento sea más técnicamente complicado. Por esta razón, practicar con hombres es útil para desarrollar la competencia.
- Mezclar colorante alimentario con solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un tubo Eppendorf de 1,5 mL hasta que la solución parezca oscura (en este estudio se utilizó colorante alimentario azul).
- Consigue ratones de práctica y anestesiaos según las directrices institucionales de cuidado animal.
- Coloca al ratón anestesiado bajo un cono nasale e inclina el cuerpo para exponer el flanco derecho. Confirma la anestesia adecuada pellizcando suavemente la almohadilla y observando que no hay respuesta.
- Carga 30 μL de solución de colorante en una jeringuilla de insulina de 0,3 mL con una aguja de 29 G y 1/2". Elimina todas las burbujas de aire.
- Con la mano no dominante, pellizca y estira suavemente la pierna/piel para crear una superficie lisa y tensa (evita levantar la piel hacia arriba). Inserta la aguja con el bisel hacia arriba en la dermis en un ángulo paralelo poco pronunciado respecto a la piel. Mantén la aguja visible bajo la superficie para confirmar la colocación dérmica.
NOTA: Durante la práctica, prueba diferentes posiciones de agarre para mantener una tensión cutánea estable mientras mantienes los dedos fuera del camino de la aguja. Introduce la aguja ~2 mm en la piel. Para reducir el reflujo de líquido, inserta la aguja ~3 mm y luego retírala ligeramente para crear un "bolsillo" antes de la inyección. Esto ayuda a retener el contraste en el lugar de inyección. - Inyecta lentamente los 30 μL de la solución del tinte hasta que se forme una pequeña "burbuja" distinta bajo la superficie de la piel
NOTA: La ausencia de burbujas visibles sugiere que la inyección se administró por vía subcutánea y no intradérmica. Mantener el bisel en posición elevada ayuda a garantizar una colocación dérmica precisa y evita inyecciones demasiado profundas. - Sigue practicando hasta formar burbujas intradérmicas de forma constante. Se pueden realizar entre seis y ocho inyecciones por lado.
- Tras completar las inyecciones de práctica, eutanasiar a los ratones conforme a los protocolos aprobados del Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) 5.
3. Preparación de células tumorales para inyección
NOTA: Realiza todos los pasos relacionados con las células en una capucha estéril. Ten en cuenta que diferentes líneas de tumores murinos crecen de forma distinta.
- Descongelar células tumorales (B16F10 usada en este estudio) varios días antes de las inyecciones intradérmicas.
- Cultivar células hasta una confluencia del 70%–80% manteniendo un medio fresco adecuado
NOTA: Evitar la confluencia al 100%, que detiene la proliferación y dificulta el crecimiento tumoral. - Cosechar y preparar las células a 7 x 106 células/mL en 1x PBS, RPMI sin suero u otro medio utilizado para el crecimiento de las células.
NOTA: El modelo tumoral B16F10 usado en el laboratorio utiliza 2 célulasde 5 x 10 en 30 μL. El volumen de inyección de 30 μL es adecuado, pero el número de células puede ajustarse según sea necesario para establecer el modelo tumoral deseado. Las células se asientan y acumulan en el fondo del tubo, así que para asegurar que la concentración de células sea constante, mezcla periódicamente suavemente las células para mantenerlas suspendidas. - Mantén las células en hielo tras el procesamiento y procede rápidamente a inyectar. El almacenamiento prolongado en hielo reduce la viabilidad celular, lo que puede disminuir el número de células vivas y afectar negativamente al establecimiento deltumulo 6.
NOTA: Las células se extraen y se utilizan inmediatamente en el laboratorio. Las inyecciones se realizan en un plazo de 20–60 minutos tras procesar las células y ponerlas en hielo. Utiliza un compañero cuando trabajes con grandes cohortes para minimizar el tiempo en el hielo.
4. Inyecciones intradérmicas
- Anestesiar ratones experimentales.
NOTA: El laboratorio utiliza anestesia con gas isoflurano, pero también se pueden emplear anestésicos inyectables. - Tras la inducción de la anestesia, coloca al ratón bajo un cono nasal y coloca el cuerpo para exponer completamente el flanco derecho.
- Invierte suavemente la suspensión de la celda para asegurar una mezcla uniforme.
- Extrae 30 μL de suspensión de celda en una jeringuilla de 0,3 mL con una aguja de 29 G, 1/2". Elimina las burbujas de aire.
- Con la mano no dominante, estira suavemente la pierna/piel hacia un lado para que quede lisa y tensa (no la levantes hacia arriba). Inserta la aguja con el bisel hacia arriba en la dermis en un ángulo paralelo poco profundo. La aguja debería mantenerse visible bajo la piel, mostrando que no es demasiado profunda.
NOTA: La profundidad de la aguja debe ser de ~2 mm dentro de la piel. Para evitar el reflujo de las células, introduce la aguja ~3 mm en la piel, tira ligeramente de la aguja hacia atrás para crear un "bolsillo" en el que las células se inyecten. Esto reduce significativamente el reflujo de retorno. - Inyecta muy lentamente los 30 μL de la suspensión celular hasta que se forme una pequeña "burbuja" visible bajo la piel. Espera entre 5 y 10 segundos antes de retirar la aguja.
NOTA: Quitar la aguja demasiado rápido puede hacer que la solución salga de la piel debido a la presión. - Repite para cada ratón. Cambia las jeringuillas después de cada jaula (4–5 ratones) para evitar que la aguja se embote.
- Vigila a todos los ratones hasta que se recuperen completamente de la anestesia.
- Monitoriza los ratones para detectar el establecimiento del tumor.
5. Inyecciones intratumorales
NOTA: Los tumores suelen estar listos para el tratamiento 7–10 días después de la implantación, una vez que alcanzan el tamaño adecuado. El tamaño adecuado utilizado en el laboratorio es ~50mm 3 o superior usando la fórmula: Volumen = (Longitud/2) * (Ancho*Ancho)7,8.
- Prepara todas las soluciones de tratamiento con antelación (por ejemplo, en este estudio se utilizó 1 PBS). Conserva las soluciones sobre hielo o a temperatura ambiente según lo requiera el tratamiento específico.
- Induce anestesia según las directrices institucionales.
- Coloca el ratón bajo un cono nasal para mantener la anestesia y colócalo de modo que el tumor quede expuesto.
- Extrae el volumen necesario (por ejemplo, 30 μL usado aquí) en una jeringuilla de insulina de 0,3 mL con una aguja de 29 G, 1/2". Elimina las burbujas de aire.
NOTA: El volumen variará según el tratamiento elegido y las condiciones optimizadas. - Introduce la aguja horizontalmente en el tumor y avanza hacia el centro de la masa tumoral.
NOTA: Evita insertar desde arriba o en un ángulo pronunciado, ya que esto puede provocar que la inyección se administre demasiado profundo o en el tejido circundante. El tratamiento descrito se administró como una sola inyección. Las dosis y la frecuencia dependen del tratamiento elegido y de las condiciones optimizadas. En tumores pequeños, una sola dosis es suficiente para distribuir el tratamiento, pero en tumores más grandes, pueden ser necesarias múltiples inyecciones para distribuir el tratamiento de forma equitativa a través de la masa tumoral. - Inyecta el tratamiento de forma lenta y constante. Pausa durante 10 segundos antes de retirar lentamente la aguja para minimizar el reflujo o la fuga. Algunos tumores tienen presión interna alta, por lo que se debe tener cuidado para que la inyección no se filtre por el orificio de la aguja.
- Repite el procedimiento para cada ratón. Sustituye las jeringuillas después de cada jaula de 4–5 ratones y al cambiar de grupo de tratamiento para evitar contaminación cruzada.
- Monitoriza a los ratones tras la anestesia hasta que recuperen la movilidad y la respiración normal. Continúa monitorizando diariamente la respuesta al tratamiento y la salud general.
NOTA: Ten en cuenta que diferentes líneas celulares pueden causar ulceraciones en distintos momentos. Cada experimento y cada protocolo IACUC tienen criterios de exclusión y puntos finales claramente definidos. En el laboratorio, los criterios finales para los experimentos con ratones son 1500mm 3 y las úlceras que ocurren se aceptan y no se excluyen del estudio.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Al practicar inyecciones con colorante, se puede comprobar el éxito de la administración intradérmica sin eutanasiar al ratón, observando la formación de una "burbuja" visible en el lugar de la inyección. Una inyección intradérmica correctamente realizada produce una "burbuja" grande, bien definida y elevada (Figura 1A–F). Burbujas pequeñas o planas sugieren que la inyección puede ser parcialmente subcutánea. Si no se forma ninguna "burbuja"...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El éxito de este protocolo (Figura 4) depende de mantener una profundidad inyectable intradérmica constante y una colocación precisa de la aguja para asegurar la entrega en la dermis en lugar de en la capa subcutánea. Si el ángulo de la aguja es demasiado pronunciado o la presión de inyección demasiado alta, el tinte o las células tumorales pueden depositarse a través de la piel hasta el espacio subcutáneo. Después de la inyección, hacer una breve pausa ante...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.
Agradecimientos
AS reconoce la Beca de Formación en Inmunología, T32 AI007363. KSK agradece mucho a la Fundación Schlumberger por apoyarla a través del programa Faculty for the Future.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Natural Centrifuge Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 150 cm2 Cell Culture Flask | Corning | 430825 | |
| Fluriso | Vet One | 13985-528-60 | isoflurano |
| Food Coloring | Durkee | para la práctica | |
| Insulin syringe 0.33 x 12.7 mm | Exel | 26018 | |
| Mini Arco | Wahl | 08787-450A | cortaúñas para afeitar los ratones |
| PBS, 1X w/o calcium & magnesium | Corning | 06325002 | pH 7.4 +/- 0.1 |
| RPMI 1640, 1x | Corning | 12225004 | |
| SomnoFlo Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | máquina de anestesia |
Referencias
- Zhang, W., Moore, L., Ji, P. Mouse models for cancer research. Chin J Cancer. 30 (3), 149-152 (2011).
- Silihe Kamga, K., Fiering, S. Intratumoral immunotherapy prior to cancer surgery a promising therapeutic approach. Front Immunol. 16, 1545000 (2025).
- Carlson, P. M., et al. Depth of tumor implantation affects response to in situ vaccination in a syngeneic murine melanoma model. J Immunother Cancer. 9 (4), e002107 (2021).
- Bonnotte, B., et al. Intradermal injection as opposed to subcutaneous injection enhances immunogenicity and suppresses tumorigenicity of tumor cells. Cancer Res. 63 (9), 2145-2149 (2003).
- Garber, J. C., et al. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 109, 20.1.1-20.1.43 (2015).
- Mao, C., Beiss, V., Ho, G. W., Fields, J., Steinmetz, N. F., et al. In situ. vaccination with cowpea mosaic virus elicits systemic antitumor immunity and potentiates immune checkpoint blockade. J Immunother Cancer. 10 (12), e005834 (2022).
- Ho, G. W., et al. Intratumoral expression of IL-12 and CD40 ligand (CD154) from plasmids generates antitumor responses that eliminate tumoral T regs. Sci Rep. 15 (1), 24439 (2025).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Chen, X. Emerging adjuvants for intradermal vaccination. Int J Pharm. 632, 122559 (2023).
- Hickling, J. K., Jones, K. R., Friede, M., Zehrung, D., Chen, D., et al. Intradermal delivery of vaccines: potential benefits and current challenges. Bull World Health Organ. 89 (3), 221-226 (2011).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
