Artículo de método

Una técnica para estabilizar proteínas de membrana en nanodiscos

DOI:

10.3791/70283

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30 de abril de 2026

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1College of Biology, Hunan University, 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology, Guangxi University, 3Jinshan Hospital, Zhongshan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio describe el procedimiento para reconstituir el canal K+ sensible a ácidos relacionado con la proteína de membrana TWIK (Task2) en nanodiscos. El ensamblaje exitoso fue confirmado mediante crio-microscopía electrónica de partícula única, que proporcionó promedios bien definidos de clase bidimensionales.

Resumen

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Muchas proteínas de membrana presentan baja estabilidad, pérdida de actividad y heterogeneidad de la muestra cuando se extraen en entornos basados en detergentes, lo que supone un desafío considerable para el análisis de criomicroscopía electrónica de alta resolución. La tecnología de nanodiscos aborda estas limitaciones empleando proteínas de andamiaje de membrana (MSPs) y fosfolípidos para reconstituir las proteínas objetivo en una bicapa lipídica similar a la nativa. En este estudio, el canal potásico humano Task2 fue expresado, solubilizado y purificado en presencia de detergentes adecuados antes del ensamblaje del nanodisco. El protocolo resultante establece un flujo de trabajo reproducible para la reconstitución de nanodiscos de Task2, como se demuestra en pasos clave de validación: un claro cambio en los perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) que confirma el agrandamiento de partículas, comigración de Task2 y MSP en SDS-PAGE, y promedios bien definidos de clase 2D con características estructurales secundarias visibles. Una reconstrucción inicial en 3D confirma aún más la integridad de la proteína incrustada en nanodiscos. Al mejorar la pureza, homogeneidad y calidad de las partículas, este enfoque proporciona una plataforma sólida para estudios estructurales de alta resolución de Task2 y ofrece un marco metodológico aplicable a otras proteínas de membrana.

Introducción

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Las proteínas de membrana desempeñan un papel crucial en la transducción de señales celulares, el transporte de metabolitos, el mantenimiento de la integridad estructural celular y las respuestas inmunitarias. La desregulación de las proteínas de membrana está implicada en diversas enfermedades, lo que las convierte en objetivos destacados para el desarrollo defármacos 1. La llegada de la criomicroscopía electrónica (crio-EM) ha permitido estudios estructurales de proteínas de membrana grandesy dinámicas 2. Uno de los principales retos para obtener estructuras de alta resolución radica en extraer estas proteínas de sus bicapas lipídicas nativas, preservando al mismo tiempo sus conformaciones y funciones bioquímicas nativas. Además, la conformación altamente dinámica de las proteínas de membrana y la complejidad del cribado de anticuerpos suponen obstáculos adicionales para el descubrimiento dirigido defármacos 3,4. Los métodos tradicionales para la extracción de proteínas de membrana suelen emplear detergentes para imitar las propiedades de la bicapa lipídica hidrofóbica. Sin embargo, este enfoque a menudo altera la estabilidad de las proteínas de membrana, lo que conduce a la agregación o despliegue parcial5. Además, los detergentes pueden eliminar moléculas lipídicas esenciales que son críticas para estabilizar la conformación proteica, lo que puede alterar la conformación proteica o incluso perjudicar la función, limitando así su aplicación en el cribado de anticuerpos y otras aplicacionesposteriores 6.

La tecnología de nanodiscos fue introducida por primera vez por Sligar y suscolegas 7. Esta estructura autoensamblante se forma típicamente por derivados de apolipoproteína A1 (ApoA1), concretamente MSPs, junto con lípidos sintéticos o naturales, proporcionando un entorno estable para las proteínas de membrana 7,8,9. El MSP forma una estructura en forma de disco rodeando los bordes hidrofóbicos de la bicapa lipídica. Esta estructura tiene una superficie hidrofóbica que interactúa con las colas de lípidos acilídicos, estabilizando la proteína de membrana, y una superficie hidrofílica orientada hacia fuera, permitiendo que la proteína de membrana permanezca soluble en solucionesacuosas 10. Los nanodiscos sirven como una plataforma versátil para el estudio de proteínas de membrana. Al preservar proteínas de membrana purificadas en un entorno lipídico casi nativo, superan las limitaciones de los métodos tradicionales basados en detergentes y mantienen la conformación y función biológica de las proteínas in vitro. En consecuencia, este método se ha convertido en una herramienta poderosa para el estudio estructural de proteínas de membrana. En comparación con los entornos tradicionales de detergente, la bicapa lipídica en los nanodiscos proporciona soporte estructural a las proteínas de membrana, estabilizando su conformación nativa, una característica crucial para proteínas propensas a la inactivación, como los receptores acoplados a proteínas G y los canalesiónicos 11. Además, la naturaleza altamente uniforme de las partículas de nanodisco tras su ensamblaje ofrece un soporte más sólido para obtener datos criogénicos de alta calidad y datos cinéticos fiables de resonancia plasmónica/bio-capa12.

En la última década, la tecnología de nanodiscos se ha convertido en una herramienta poderosa para estudiar proteínas de membrana en ambientes lipídicos naturales. Por ejemplo, Vilela y suscolegas 13 han establecido un marco sistemático para el ensamblaje de nanodiscos optimizando las condiciones de reconstitución y verificando la calidad de los componentes finales. Específicamente, combinaron cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) con indicadores cuantitativos (incluyendo la eficiencia de ensamblaje y la simetría máxima) para evaluar objetivamente la homogeneidad de lasmuestras 13. Actualmente, los nanodiscos se han convertido en una plataforma versátil. Mediante el uso de crio-EM de partícula única para detectar las proteínas ensambladas reconstituidas por nanodiscos, se pueden obtener estructuras de alta resolución de proteínas de membrana, y su aplicabilidad ha quedado firmemente establecida. La característica de densidad de doble anillo de la banda MSP es la evidencia estructural decisiva para la uniónexitosa 10,14,15. Además, los nanodiscos sirven como una herramienta valiosa tanto para el análisis funcional de proteínas de membrana en ambientes de bicapas lipídicas como para su aplicación en estudios de resonancia magnética nuclear ensolución 16,17.

Este protocolo describe un método para ensamblar la proteína de membrana Task2 humana en nanodiscos. Human Task2 es un miembro delimitado por pH de la familia de canales K+ (K2P) de dominio de dosporos 18,19. Como otros canales K2P, Task2 es un homodímero intercambiado por dominio, con cada cadena de protómero que contiene cuatro hélices transmembranas (TM1–TM4), dos hélices de poros reentrantes (PH1 y PH2), dos filtros de selectividad (SF1 y SF2) y dos hélices extracelulares formadoras de capas (CH1 y CH2). La proteína objetivo era una forma truncada de Task2 que carecía de los 166 aminoácidos C-terminales —una región que se predecía que estaría en gran parte no estructurada— y que se encontró que mejoraba la expresión proteica y la estabilidad bioquímica. El peso molecular de la Task2 recombinada es aproximadamente 72 kDa con una etiqueta GFP. Había sido solubilizada y purificada previamente con detergente. Se combinó con lípidos y MSP en una relación estequiométrica calculada con precisión. Tras la eliminación del detergente usando Bio-Beads, la muestra fue purificada posteriormente mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) para obtener una preparación adecuada para crio-EM. A partir de datos crio-EM de partícula única se generaron promedios de clase bidimensionales (2D) para validar la integridad de la muestra.

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Protocolo

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1. Preparación del caldo lipídico

  1. Preparación de lípidos
    1. Preparar mezclas lipídicas utilizando tres fosfolípidos: 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 2-oleoil-1-palmitoilglicero-3-fosfocolina (POPC) y 1-palmitoil-2-oleoilfosfatidilserina (POPS).
    2. Utiliza soluciones de base prepreparadas de estos lípidos en cloroformo, cada una a una concentración de 25 mg/mL.
      NOTA: Se requiere equipo de protección individual al manipular cloroformo, y todos los procedimientos deben realizarse en una campana extractora. Guarda cloroformo en un armario químico dedicado.
    3. Debido a la volatilidad del cloroformo, al medir con una microjeringa, verifica que el volumen de la solución de stock lipídico coincida con el volumen registrado inicialmente antes de cada uso. Si se produce evaporación, repone la solución con cloroformo puro al volumen original y mezcla bien.
      NOTA: Antes de cada medición, enjuaga la microjeringa dos veces con cloroformo.
    4. Preparar una mezcla lipídica de 100 μL con una relación de masas de DOPE:POPC:POPS = 2:1:1. En base a esta proporción, se combinan 50 μL deV DOPE, 25 μL de VPOPC y 25 μL de VPOPS. Mide el volumen correspondiente según el número calculado. Añádelo al tubo de ensayo de cristal y mezcla bien.
    5. Coloca el tubo de ensayo de cristal en un baño maria para reducir la volatilización del cloroformo y mantener estable la temperatura ambiente.
  2. Preparación de la película lipídica
    1. Evapora el cloroformo bajo un suave chorro de gas nitrógeno hasta que se haya eliminado todo el líquido y se forme una película transparente y homogénea similar a un gel en la parte inferior del tubo de ensayo.
      NOTA: Asegúrese de que una película lipídica uniforme y seca sea visible en la parte inferior del tubo de vidrio, sin gotas residuales de líquido. Evita un flujo excesivo de nitrógeno, ya que puede causar burbujeos y evitar el secado completo del cloroformo.)
    2. Añade aproximadamente 2 mL de n-pentano en gota a un tubo de ensayo de vidrio. Luego evapora el disolvente utilizando el método de secado con nitrógeno descrito en 1.2.1 para obtener una película lipídica seca y transparente. El n-Pentano se evapora en un tubo de ensayo de vidrio debido a su inercia química y compatibilidad con disolventes orgánicos. El vidrio evita el riesgo de lixiviación o degradación del plástico asociado a muchos materiales plásticos de laboratorio, preservando así la pureza lipídica durante la formación de la película.
      NOTA: el n-Pentano debe almacenarse en un armario dedicado a los reactivos y, cuando se utilize, manipularse con cuidado en una campana extractora mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado.
    3. Afloja la tapa del tubo de ensayo y colócalo en un desecador de vacío. Evacua el desecador y mantenlo bajo vacío para eliminar cualquier disolvente residual. Coloca gel de sílice autoindicativo en la base del desecador para absorber la humedad.
      NOTA: Evaporar cloroformo residual y n-pentano hasta que estén secos en una campana extractora.
  3. Hidratación de lípidos y preparación de la solución de stock
    1. Retira la película lipídica del desecador al vacío e hidráctala añadiendo 250 μL de tampón bajo en sal (LSB) libre de detergente (Tabla Suplementaria 1). Esto produce una concentración final de lípidos de 10 mg/mL.
      NOTA: Se seleccionó un tampón basado en iones potásicos porque Task2 es un canal de iones potásicos
    2. Tras volver a suspender el lípido, dividir el lípido de forma uniforme en cuatro tubos de vidrio y sonicar las suspensiones hasta que se vuelvan claras y transparentes, indicando la formación exitosa de liposomas (aproximadamente 1,5 h). Realiza la sonicación al 60% de amplitud usando un ciclo de 4 s encendido y 6 segundos apagado.
    3. Agrupa la solución lipídica clarificada y la cuota de 1,5 mL en tubos microcentrífugas individuales. Enjuaga inmediatamente el espacio de cabeza de cada tubo con gas nitrógeno y guárdalo a -80 °C hasta su uso.

2. Sobreexpresión y purificación del MSP

  1. Expresión procariota de MSP
    1. Transformación de plásmidos: Utiliza el plásmido MSP1D1 que lleva una etiqueta 7×His para transformar las células competentes de E. coli BL21 (DE3). Emplatar la mezcla de transformación sobre placas de agar Luria-Bertani (LB) que contengan kanamicina (50 μg/mL) e incubar durante la noche a 37 °C para obtener colonias individuales.
    2. Amplificación en cultivo: Elige un clon individual e inocúlalo en 5 mL de medio que contenga kanamicina e incuba durante la noche a 37 °C con agitación. Inocular el cultivo nocturno en un medio LB líquido con una proporción 1:100, luego crecer a 37 °C con agitación hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD600) alcance 2,0–3,0.
    3. Inducción de expresión proteica: Inducir la expresión de MSP añadiendo isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,5–1 mM. Continúa cultivando las células a 16 °C durante 16–20 horas con agitación.
  2. Disrupción celular
    1. Recogida de pellets: Centrifugar el cultivo bacteriano a 4 °C durante 10 minutos. Descarta el sobrenadante y conserva la pastilla celular.
    2. Lisis bacteriana: Suspender el pellet derivado de 1 L de cultivo en 100–150 mL de tampón de lisis (Tabla suplementaria 1). Homogeneizar a fondo hasta lograr una suspensión uniforme sin grumos visibles. Añade PMSF a la suspensión para inhibir las proteasas y reducir la espuma.
    3. Sonicación: Utiliza un disruptor de celdas ultrasónicas refrigeradas para romper las bacterias. Ajusta la potencia al 35 % y aplica ciclos de pulsos de 3 s seguidos de pausas de 6 s. Para evitar el sobrecalentamiento, permite un intervalo de descanso de 2 minutos después de cada 15 minutos de tiempo acumulado de sonicación. Continúa hasta que el lisado se vuelve claro y de color marrón claro.
    4. Aclaración: centrifuga el lisado a 30.000 g durante 45 minutos a 4 °C y recoge el sobrenadante para los siguientes pasos.
  3. Purificación MSP
    1. Preparación de resina Ni-NTA: Toma 3–5 mL de resina Ni-NTA y empálala en una columna de gravedad (tamaño: 26,4×134,8 mm). Lava la resina con 3 volúmenes columnas (CV) de agua destilada y equilibra con 3 CV de Wash Buffer 1 (Tabla Suplementaria 1).
    2. Unión del MSP a la resina: Tras la centrifugación del lisato celular, mezcla el sobrenadante con la resina Ni-NTA equilibrada. Añade imidazol a una concentración final de 5 mM e incuba la mezcla a 4 °C durante 2 horas con una rotación suave en la oscuridad.
    3. Lavar para eliminar impurezas: Lavar secuencialmente con gradientes de Wash Buffer 1, Wash Buffer 2 (Tabla Suplementaria 1) y Wash Buffer 3 (Tabla Suplementaria 1), utilizando al menos 50 mL de cada buffer. Monitoriza la absorbancia UV a 280 nm (A280) del flujo y continúa lavando hasta que el valor de A280 baje por debajo de 0,01.
    4. Elución: Eluir la proteína objetivo con el Elution Buffer (Tabla Suplementaria 1) y recoger las fracciones eluadas. Continúa el proceso de elución, recogiendo fracciones hasta que el A₂₈₀ del eluato baje por debajo de 0,01.
    5. Monitorización y análisis de procesos: Recoger muestras de las etapas clave de purificación, incluyendo el sobrenadante, precipitado, flujo directo, fracciones de lavado y fracciones de elución. Analízalos mediante SDS-PAGE para evaluar la eficiencia de purificación (Figura suplementaria 1).
    6. Diálisis para el intercambio de tampón: Transfiere el eluato acumulado a un tubo de diálisis y diálisalo contra el tampón de diálisis (Tabla Suplementaria 1) a 4 °C con una suave agitación durante la noche.
    7. Ultrafiltración y concentración: Concentrar la solución diabalizada utilizando un dispositivo de ultrafiltración hasta alcanzar una concentración final de MSP de 2–5 mg/mL. El MSP purificado y concentrado ya está listo para su uso en el ensamblaje de nanodiscos de proteínas de membrana.

3. Activación de bioperlas

  1. Pesaje
    1. Pesa aproximadamente 250 mg de Bio-Beads en un tubo de centrífuga de 50 mL usando una balanza analítica.
  2. Lavados con metanol
    1. Añade 25–30 mL de metanol al tubo. Gira o haz un vórtice de la mezcla a fondo en la oscuridad y luego incuba durante 20 minutos. Desecha cuidadosamente el sobrenadante tras la incubación.
    2. Repite este paso de lavado con metanol tres veces en total.
      NOTA: Debido a la volatilidad del metanol, este procedimiento debe realizarse en una campana extractora con el equipo de protección personal adecuado. Recoge metanol usado y trátalo como líquido de desecho biológico.
  3. Lavados acuosos
    1. Añade 25–30 mL de ddH2O a las cuentas. Sacude o gira el tubo para mezclarlo e incubar durante 20 minutos.
    2. Descarta el sobrenadante. Repite este paso de lavado acuoso tres veces.
  4. Equilibrio con LSB
    1. Añade entre 25 y 30 mL de LSB sin detergente a las cuentas. Agita o gira el tubo sobre una mesa giratoria para mezclarlo e incubarlo durante 20 minutos.
    2. Descarta el sobrenadante. Repite este paso de equilibrio LSB tres veces para acondicionar completamente las cuentas.
  5. Aliteración y almacenamiento
    1. Divide las Bio-Perlas activadas por igual en tres tubos microcentrífugas de 1,5 mL. Asegúrate de que las cuentas permanezcan humedecidas con una pequeña cantidad de LSB.
    2. Envuelve los tubos en papel de aluminio para protegerlos de la luz y guárdalos sobre hielo para su uso inmediato.

4. Ensamblaje del nanodisco

  1. Preparación de lípidos y MSP
    1. Aclaración del stock lipídico: Recupera una alitera del fondo lipídico prepreparado y descongelarlo. Centrifugar inmediatamente el tubo a 7.000 x g durante 5 s a 4 °C para recoger el contenido en el fondo.
    2. Haz ultrasonidos en baño maria y controla la claridad y temperatura cada 5–10 minutos para evitar el sobrecalentamiento. Realiza la sonicación al 60 % de amplitud. Ultrasonica el material lipídico hasta que este quede claro y transparente.
    3. Descongelación MSP: Descongelación de 1 alitera de la solución preparada de MSP en un baño de agua con hielo.
  2. Preparar el tampón según la relación estequiométrica.
    1. Cuantificar la proteína de membrana: Aislar la proteína de membrana purificada (Task2), solubilizada en 0,025% DDM/0,005% CHS, mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Inyectar un volumen de muestra de 500 μL a un caudal de 0,5 mL/min sobre una columna de aumento Superose 6 (Cytiva). Recoge el pico de elución a 14,8 mL y concéntrase (Figura 1). Determina la concentración de proteínas usando un NanoDrop.
    2. Calcular la cantidad molar proteica: Calcular la cantidad molar (n) de la proteína de membrana objetivo usando la fórmula: n = C × V, donde C es la concentración molar y V el volumen.
    3. Determinar el MSP y los volúmenes lipídicos: Calcular los volúmenes requeridos de MSP y soluciones de stock lipídico basándose en una proporción estequiométrica molar de la proteína objetivo : MSP : lípidos = 1 : 5 : 250.
    4. Preparar la mezcla maestra: Basándose en los resultados del cálculo, combina los volúmenes correspondientes de lípidos y MSP para preparar una mezcla maestra de 300 μL.
      NOTA: Asegúrese de incluir detergente en esta mezcla para mantener una concentración coherente con la de la solución proteica, evitando así una agregación prematura.
  3. Eliminación de detergentes y ensamblaje de nanodiscos
    1. Incubación inicial con mezcla de reconstitución: Incuba el tampón preparado (Tabla Suplementaria 1) sobre hielo durante 10 minutos. Luego, añade lentamente 50 μL de la mezcla a la solución proteica concentrada, incorporando suavemente con pipeteo para asegurar la homogeneidad.
    2. Equilibrio de la mezcla proteína-lípidos: Coloque la mezcla combinada sobre hielo durante 1 hora. Invierte suavemente el tubo cada 15 minutos para mezclarlo bien.
    3. Primera incubación con bioperlas: Centrifugar brevemente la mezcla a 7.000 x g durante 5 s a 4 °C para recoger la solución proteica en el fondo del tubo. Toma una aliteracia de las Bio-perlas preactivadas, aspira el LSB residual, añade la solución proteica a las perlas e incuba rotando en la oscuridad durante 1 hora para evitar la degradación inducida por la luz de la proteína objetivo.
    4. Segunda incubación con bioperlas: Centrifugar la mezcla a 7.000 x g durante 5 s a 4 °C y transferir cuidadosamente el sobrenadante a una segunda alitería de bioperlas (de la que también se ha aspirado el LSB) y mezclar bien mediante una suave inversión en la oscuridad durante 4–8 horas o durante toda la noche.
    5. Incubación final con Bio-Beads: Recuperar la solución proteica tras una incubación nocturna, centrifugarla brevemente y transferir el sobrenadante a la tercera y última parte de Bio-Beads preactivadas. Incubar con rotación a 4 °C en la oscuridad durante 1 hora.
    6. Tras una breve centrifugación, transfiere el sobrenadante a un tubo limpio de microcentrífuga y centrifuga a 17.000 g a 4 °C durante 10 minutos para eliminar cualquier agregado.
      NOTA: Eliminar las Bio-Perlas gastadas como residuos biológicos.
    7. Purificación de nanodiscos: Purificar los complejos nanodisco-Task2 mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC): Inyectar un volumen de muestra de 500 μL a un caudal de 0,5 mL/min sobre una columna de aumento Superose 6 y recoger el pico eluído a 15 mL (Figura 2).
    8. Concentración del Producto Final: Agrupar las fracciones pico de la elución SEC y concentrarlas hasta una concentración final de nanodisco-Task2 de 1,2–1,5 mg/mL, adecuada para la preparación de muestras crio-EM.

5. Verificar que el conjunto del nanodisco sea exitoso

  1. Análisis SDS-PAGE: Muestras alicuotas de fracciones purificadas por SEC.
    1. Analizar las muestras utilizando SDS-PAGE al 12% para confirmar la presencia de componentes clave (por ejemplo, MSP y proteína de membrana objetivo), lo que indica el ensamblaje exitoso del nanodisco (Figura 3).
  2. Preparación y análisis de muestras crio-EM.
    1. Concentrar la muestra ensamblada correctamente a una concentración final de 1,2–1,5 mg/mL para la preparación de la muestra crio-EM.
    2. Comienza centrifugando la muestra a 17.000 x g y 4 °C durante 10 minutos. Depositar una gota de 3 μL sobre rejillas de oro Quantifoil R1.2/1.3 recién descargadas con glow (malla 300, carbono con agujeros).
    3. Incuba a 4 °C con un 100% de humedad durante 5 segundos. Seca la rejilla durante 4 s en un Vitrobot Mark IV y haz una inmersión-congelación en etano líquido mantenido a temperatura de nitrógeno líquido.
    4. Recoge pilas de películas de superresolución usando software EPU en un Titan Krios G4 crio-EM que opera a 300 kV y está equipado con un detector directo de electrones Falcon G4i.
    5. Se establece el tiempo de exposición a 2,78 s, correspondiente a un tamaño de píxel de 0,73 Å (165k ×) y una dosis acumulada total de aproximadamente 50 e⁻/Å 2 por pila de películas EER.

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Resultados

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La preparación exitosa del material lipídico se indicó mediante la formación de una solución clara y transparente tras la sonicación. Para el MSP, la cromatografía de afinidad níquel produjo un producto de alta pureza a aproximadamente 3 mg/mL. El ensamblaje de nanodiscos fue confirmado por la SEC, que mostró un perfil característico de elución (Figura 2). En comparación con el perfil SEC Task2 obtenido antes del ensamblaje del nanodisco (Figura 1), el pico ...

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Discusión

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El método se presenta para reconstituir proteínas de membrana solubilizadas en detergente en nanodiscos mediante la eliminación de detergentes, proporcionando así un entorno de bicapa lipídica más nativo. El éxito de este proceso de ensamblaje depende de varios factores clave. La más destacada es la relación estequiométrica precisa entre la proteína de membrana, el MSP y los lípidos. Proporciones estequiométricas incorrectas pueden conducir a la agregación de proteínas o al ensamblaje in...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen al personal del Centro de Crio-EM de la Universidad de Henan, así como al profesor Wei Wang, por su apoyo experto. La financiación fue proporcionada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 32371261 a B.L. y 32301011 a R.Z.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BioperlasBio-rad1523920
Hemisuccinato de colesteriloAnatraceCapítol 210
CloroformoSinoractivoUso en una campana extractora
GENIALAvanti850725P
MetanolSinoractivo
n-Dodecyl-beta-D-maltosideAnatraceD310
N-pentanoAdamasUso en una campana extractora
POPCAvanti850457P
POPSAvanti840034P
SECBio-radSigue el protocolo del fabricante para un uso adecuado
Tubería de diálisis SnakeSkinTermodinámica68011
Superose  6 Aumento10/300 GLCytiva29091596
Columnas de Espín de Ultrafiltración Amicon Ultra-15MilliporeUFC905008

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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