Bex-plex permite la visualización simultánea de marcadores proteicos y transcritos de ácidos ribonucleicos para el perfilado espacial profundo de tejido intacto

Summary

Aquí presentamos un protocolo para combinar la tinción iterativa de proteínas (IBEX) con tecnología de hibridación in situ por ARNoscopio para el fenotipado espacial profundo de tejidos fijos congelados intactos para aplicaciones de perfilado espacial de alta resolución.

Abstract

Aquí presentamos un protocolo para permitir el perfilado espacial simultáneo de marcadores de proteínas y ácidos ribonucleicos (ARN) con resolución unicelular en tejidos intactos. Uno de los problemas centrales que rodean a los cánceres de tumores sólidos es la incapacidad para predecir la respuesta del paciente a la intervención terapéutica. Descifrar estas complejidades requiere una medición cuantitativa de comportamientos celulares, interacciones y fenotipos dentro de tejidos intactos. Específicamente, el proteoma y el transcriptoma proporcionan información solapada pero no redundante que puede ser fundamental para diseñar inmunoterapias racionales. Sin embargo, actualmente no existe una forma sencilla y rentable de perfilar en profundidad tanto el estado transcripcional como el funcional de todas las células en el microambiente tumoral, manteniendo su información crítica de localización espacial. Para ello, hemos combinado con éxito la plataforma IBEX (el blanqueamiento iterativo extiende la multiplexidad) con HiPlex RNAscope para visualizar simultáneamente marcadores proteicos de alto plex y transcritos de ácido ribonucleico (ARN) de alto plex con resolución de célula única. Este enfoque incorpora un paso modificado de recuperación de ARN para preservar la morfología nuclear y permitir un alineamiento preciso de las imágenes a través de los ciclos. "Bex-Plex" nos permite realizar un protocolo IBEX sin modificar sobre tejidos congelados fijos, seguido del protocolo HiPlex RNAscope, en el que utilizamos una recuperación modificada de ARN para asegurar la alineación a nivel nuclear con los ciclos IBEX. Este protocolo está optimizado para tejidos congelados fijos y permite un análisis espacial integrado de estados celulares transcripcionales y funcionales. La capacidad de perfilar a este nivel unicelular no solo proporciona un profundo pozo de información sobre el propio tejido, sino que también puede facilitar predicciones sobre las interacciones celulares matizadas que impulsan la respuesta terapéutica, proporcionando un marco para estudiar la biología espacial en microambientes tumorales y sistemas relacionados.

Introduction

Desde su introducción en 2011, las inmunoterapias contra el cáncer que disminuyen la supresión de células T citotóxicas bloqueando moléculas inhibitorias de puntos de control inmunitarios como PDL-1 y CTLA-4 se han convertido en el estándar de oro para el tratamiento de tumores^{sólidos 1}. Sin embargo, a pesar de su uso a gran escala en pacientes, la eficacia clínica de estos fármacos varía mucho porque muchos cánceres tumorales sólidos presentan o eventualmente generan resistencia a estas^{terapias 2}. En muchos casos, esto se debe a la naturaleza extremadamente heterogénea de los tumores sólidos, incluso entre el mismo tipo^{de cáncer tipo 3}. Una comprensión más profunda de las relaciones celulares que se producen en los tumores sólidos es clave para generar mejores modalidades de tratamiento. Por ello, identificar los mecanismos y las interacciones exactas que fomentan y sostienen esta resistencia está a la vanguardia de la investigación sobre el cáncer. Aquí, pretendemos desarrollar un método que permita un análisis espacial integrado de la expresión de proteínas y ARN dentro de tejidos intactos para caracterizar mejor estas complejas interacciones celulares.

El microambiente tumoral (TME) está compuesto por los componentes celulares y estructurales no cancerosos que moldean el crecimiento tumoral y la respuesta inmune, incluyendo fibroblastos asociados al cáncer, células inmunitarias infiltrantes, componentes vasculares y la matriz^{extracelular 4}. Recientemente, se ha hecho evidente que la composición y organización de la TME influyen fuertemente en si los tumores son permisivos o resistentes a la infiltración inmunitaria, uno de los principales factores que dictan la respuesta a la^{inmunoterapia 5}. En muchos tipos de cáncer, un fenotipo de "desierto inmunitario", caracterizado por un bajo número de células T y la presencia de poblaciones mieloides altamente inmunosupresoras, se correlaciona con una baja respuesta a terapias de bloqueo^{por puntos de control 6,7}. La señalización de quimiocinas rige muchas de estas dinámicas de reclutamiento. Por ejemplo, CXCL1 y CCL2 atraen células mieloides inmunosupresoras, mientras que el eje CXCR3-CXCL9/CXCl10 recluta tanto células T citotóxicas como reguladoras en el tumor⁸. En consecuencia, el entorno de señalización específico de nicho puede influir poderosamente en el fenotipo y la función celular. Por ejemplo, en pacientes con cáncer colorrectal, el eje CCL5-CCR5 controla la función supresora de los macrófagos asociados a tumores (TAMs) y bloquear esta señal sesga la TAM hacia un fenotipo antitumorigénico y se correlaciona con una mejor respuesta^{clínica 9}. Además, las interacciones directas entre células inmunitarias, fibroblastos asociados al cáncer y/o células tumorales mediante ICAM y PDL-1 pueden inducir agotamiento inmunitario y una inmunidad antitumoral^{contundente 10}. En conjunto, estos hallazgos subrayan la importancia de los análisis resueltos espacialmente para entender cómo la TME influye en la eficacia terapéutica.

La imagen inmunofluorescente (IF) sigue siendo un enfoque fundamental para visualizar la expresión de proteínas e interacciones célula-célula en los tejidos. El campo ha evolucionado desde el FI convencional de 3-4 colores hasta flujos de trabajo de imagen de alto contenido que dependen de tinción iterativa e imagen. En estos métodos, se generan grandes conjuntos de datos mediante ciclos repetidos de marcado de anticuerpos, imagen y inactivación o eliminación de fluoróforos para que se puedan teñir y visualizar marcadores adicionales¹¹. Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) se introdujo recientemente como una plataforma de imagen iterativa fácil de usar^{y rentable 12}. Compatible con el uso de anticuerpos comerciales y microscopios convencionales, IBEX utiliza borohidruro de litio (_{LiBH 4}) para apagar la fluorescencia de la mayoría de los colorantes comúnmente usados sin dañar los epítopos tisulares, permitiendo la adquisición de hasta 75 parámetros para un solo^{tejido 13}. Las imágenes obtenidas de esta tinción cíclica se alinean utilizando el software de código abierto SimpleITK para producir conjuntos de datos compuestos adecuados para análisis espaciales de alta dimensión.

Complementarios al fenotipado a nivel de proteína, los métodos transcriptómicos espaciales pueden proporcionar información valiosa sobre el estado transcripcional de las células en su entorno nativo. Cabe destacar que la hibridación in situ (ISH) es una técnica popular para identificar la localización de secuencias de ADN o ARN en un tejido^{específico 11}. El ARNscopio es un enfoque ISH bien establecido que utiliza sondas con una química Z única para amplificar específicamente los transcritos de ARN a resolución de molécula única y es compatible con muchos tipos diferentes^{de muestras.} Como plataforma ampliamente adoptada y comercialmente disponible a través de Advanced Cell Diagnostics (ACD), RNAscope ofrece sondas validadas contra una amplia variedad de objetivos, simplificando el diseño experimental para diversas aplicaciones.

Se puede obtener una visión más completa de la identidad y funciones celulares combinando la detección de proteínas y ARN dentro del mismo tejido. Las proteínas secretadas de corta duración, como citocinas y quimioquinas, tradicionalmente carecen de una tinción fiable por anticuerpos por parte del IHC, pero la información sobre su expresión puede obtenerse cuantificando sus transcritos de ARNm. Intentos previos de co-detectar ARN y proteína, como el IHC cromogénico convencional o el TSA-OPAL, han estado limitados por la amplificación no lineal de señales y por protocolos de recuperación de antígenos que consumen^{mucho tiempo 15}. En comparación con estos enfoques, el método Bex-Plex permite la detección simultánea de proteínas y ARN de alto plex, preservando el contexto espacial y la morfología nuclear para un registro preciso de imágenes.

Aquí presentamos "Bex-Plex", un protocolo que integra las plataformas IBEX y RNAscope para la caracterización simultánea y cuantificable de los estados transcripcional y traslacional de las células dentro de sus tejidos nativos. En Bex-Plex, los tejidos embebidos con OCT fija se someten al protocolo estándar IBEX seguido de un flujo de trabajo RNAscope HiPlex ligeramente modificado, en el que la recuperación del objetivo se realiza a 60°C con un tiempo de incubación de 1 hora, en comparación con la incubación original de 99°C durante 5 minutos. Esto preserva la arquitectura de los núcleos, permitiendo un alineamiento preciso de los marcadores fiduciales al registrar las imágenes separadas de los ciclos IF e ISH en uno solo. Este protocolo es más adecuado para estudios que requieren análisis espacial simultáneo de la expresión de proteínas y ARN en tejidos intactos, especialmente cuando la disponibilidad tisular es limitada o cuando la preservación de la arquitectura espacial es crítica, como en el análisis de microambientes tumorales o en estudios de perfilado inmunitario.

Utilizando reactivos ampliamente disponibles y compatibles con la mayoría de las plataformas de imagen, Bex-Plex puede ser realizado por cualquier investigador técnicamente formado familiarizado con la imagen fluorescente y con acceso a un microscopio convencional. El protocolo presentado aquí está optimizado para muestras congeladas fijas. Actualmente, el protocolo ha sido validado en tejidos congelados fijos, y puede ser necesaria una optimización adicional para su aplicación a otros tipos de muestra como FFPE o muestras clínicas humanas.

Este flujo de trabajo será invaluable en cualquier contexto donde el tejido sea limitado o valioso, como biopsias tisulares o experimentos con animales con un tamaño de muestra limitado, así como para la fenotipización de células que pueden ser difíciles de extraer mediante técnicas disociativas. Bex-Plex proporciona información simultánea y cuantificable sobre los perfiles transcripcionales y traslacionales de células individuales manteniendo su contexto espacial, datos que están especialmente preparados para responder preguntas sobre las relaciones y la interacción entre células en su entorno original.

Protocol

Los procedimientos descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales de la Universidad de California, San Diego (número de protocolo S24049). Se utilizaron ratones machos y hembras de 7 a 12 semanas de edad con un antecedente genético C57BL/6 y alojados bajo condiciones específicas libres de patógenos para estos experimentos.

1. Preparación de tejidos

1. Eutanasiar ratones experimentales mediante medidas primarias y secundarias aprobadas (por ejemplo, eutanasia de CO₂ y dislocación cervical) y extraer tejidos de interés en medios suplementados.
2. Prepara un nuevo stock de fijador tisular diluyendo una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% hasta obtener un 0,5% o 1% de PFA en 1X PBS. Utilice PFA al 0,5% para tejidos de bajo volumen como ganglios linfáticos y PFA al 1% para tejidos de mayor volumen como tumores...
   PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es inflamable y tóxico si se ingiere o ingiere. Manipula con el EPI adecuado y evita el contacto con la piel o los ojos.
3. Transfiere los tejidos a una placa de 24 pozos con 2 mL de fijador por pozo e incuba durante la noche a 4°C.
   Nota: Los tiempos de incubación superiores a 16 horas pueden provocar problemas de sobrefijación.
4. Llena los pozos de una placa nueva de 24 pozos con PBS 1X y transfiere los tejidos desde la placa fijadora.
   Punto de pausa: Si es necesario, los tejidos pueden almacenarse en un PBS 1X a 4°C durante hasta 7 días.
5. Elimina el exceso de grasa o restos de los tejidos uno a uno usando un telescopio de disección y herramientas. Añade un pequeño volumen de 1X PBS directamente al tejido para evitar la deshidratación del tejido durante el recorte.
6. Prepara una solución de sacarosa al 30% en peso y vapor diluyendo el fondo de sacarosa en polvo en 1X PBS.
7. Transfiere los tejidos a una placa de 24 pozos con 2 mL de sacarosa al 30% por pozo e incuba durante la noche a 4°C para deshidratar. Los tejidos están suficientemente deshidratados cuando se hunden en el fondo de los pozos.
8. Llena criomoldes etiquetados con OCT y coloca los pañuelos uno a uno en los moldes. La orientación del tejido dependerá del origen, pero nuestra recomendación estándar sería que la mayor superficie sea paralela al fondo del criomold. Asegúrate de que los tejidos estén completamente sumergidos en el OCT.
9. Colócalo sobre hielo seco durante 10 minutos para congelarlo y guardarlo a -80°C.

2. Sección de tejidos

Nota: Todos los reactivos y materiales de laboratorio utilizados para este protocolo deben estar libres de RNasa. Ten cuidado de evitar la contaminación al manipular los tobogáns.

1. Recubre las láminas de microscopio sin RNasa con 15 μL de adhesivo de alumbre de cromo e incuba durante 1 hora a 60°C en un horno. Las láminas recubiertas de cromo alumbre pueden almacenarse a temperatura ambiente (RT) hasta un mes antes de su uso.
2. Saca los tejidos incrustados en OCT del congelador a -80°C y colócalos en un criostato/criotoma a -20°C para que se equilibren al menos 20 minutos.
3. Seccionar tejidos sobre portaobjetos recubiertos de alumbre cromado con un grosor de 10–15 μm.
4. Guarda las láminas con secciones cortadas a 4°C o, si se teñen el mismo día, deja que las láminas se equilibren con RT. Las láminas seccionadas pueden almacenarse a 4°C hasta 5 días antes de su uso.

3. Tinción de proteínas

1. En un acuario de sumergido, remojad la lámina a teñir en PBS 1X libre de RNasa durante 5 minutos para eliminar el exceso de OCT de los tejidos.
2. Usa un bolígrafo barrera hidrofóbico para dibujar cajas alrededor de los pañuelos en la lámina y deja secar durante 2 minutos.
3. Preparar una solución bloqueante de bloqueo de receptores anti-FC de ratón 10 μg·mL⁻¹ en PBS 1X libre de RNasa. Añadir el tampón de bloqueo a las muestras del portaobjetos, usando suficiente para crear una burbuja que cubra completamente el tejido (100–150 μL·^sección-1).
   Nota: A veces se requiere añadir FBS o BSA (normalmente entre el 1 y el 2%) al buffer de bloqueo para tejidos y/o marcadores difíciles.
4. Incuba las láminas en RT en una caja de tinción húmeda durante 1 hora, luego lávalas sumergiéndolas completamente en un tanque de sumergimiento lleno de PBS 1X sin RNasa durante 5 minutos.
5. Preparar la solución primaria de tinción de anticuerpos en PBS 1X libre de RNasa, planificando entre 100 y 200 μL por sección de tejido. Las diluciones estándar de anticuerpos oscilan entre 1:50 y 1:200, pero se recomienda realizar titulaciones con una sola tinción para identificar el mejor factor de dilución para un anticuerpo y/o tipo de tejido concreto. El vórtice y el pulso hacen girar los anticuerpos antes de pipetear para evitar los agregados fluorescentes.
6. Retira las láminas del lavado y absorbe suavemente el exceso de líquido de las esquinas de las cajas de muestra usando una toallita absorbente para evitar diluir la solución de anticuerpos.
7. Aplica la solución de anticuerpos de la misma manera que la solución bloqueante, formando una burbuja sobre el tejido.
8. Coloca las láminas horizontalmente en un horno a 37°C e incuba durante 1 hora. Alternativamente, incuba las láminas a temperatura respiratoria durante 3–4 horas en una caja húmeda. Se pueden utilizar protocolos estándar de IF ya optimizados para el tejido deseado de interés. Mantener los portaobjetos en un ambiente húmedo durante la incubación para evitar la deshidratación. (por ejemplo, usa una toalla de papel húmeda en el fondo de la bandeja de tinte).
9. Lava las láminas sumergiéndolas en un PBS 1X libre de RNasa durante 2 minutos. Repite dos veces para un total de tres lavados. Si es necesario para tu panel de tinción, prepara una solución secundaria de anticuerpos para la tinción en PBS 1X libre de RNasa durante este tiempo. Las diluciones estándar de anticuerpos varían entre 1:500 y 1:1000, pero se recomienda realizar titulaciones de una sola tinción para identificar el mejor factor de dilución para un anticuerpo y/o tipo de tejido concreto.
10. Elimina cualquier exceso de PBS de las láminas con una limpieza absorbente y añade entre 100 y 200 μL de solución secundaria de tinción de anticuerpos a cada sección de tejido. Coloca las láminas horizontalmente a 37°C en el horno y incuba durante 30 minutos. Alternativamente, los portaobjetos pueden teñirse en RT durante 1–2 horas en una caja húmeda.
11. Lava las láminas sumergiéndolas en PBS 1X sin RNasa durante 2 minutos. Repite dos veces para un total de tres lavados.
12. Diluir el colorante nuclear DAPI hasta una concentración final de 0,2 μg·mL⁻¹ en PBS 1X libre de RNasa y añadir entre 100 y 200 μL a cada sección de tejido.
13. Incuba las láminas durante 10 minutos en RT en una caja húmeda, luego lava una vez sumergiéndote en PBS 1X sin RNasa y sumergiéndolas brevemente arriba y abajo.
14. Elimina el exceso de líquido de las llaves con una pasita absorbente y añade 20–30 μL de medio de montaje antifade de base acuosa a cada sección. Coloca cuidadosamente una cubierta sobre el portaobjetos, asegurándote de minimizar las burbujas, y deja que el medio de montaje cure durante 15–30 minutos.
15. Imagina las diapositivas teñidas. Para una explicación más detallada de consideraciones sobre el diseño de paneles y la adquisición de imágenes para IBEX, véanse los protocolos IBEX^{originalmente publicados 12,13}.
    Punto de pausa: Guarda las láminas montadas en la oscuridad a 4°C durante hasta 3 días, aunque recomendamos proceder de inmediato para asegurar una degradación mínima del ARN.

4. Blanqueamiento con fluoróforo y tinción iterativa de proteínas

1. Sumerge las láminas en PBS 1X libre de RNasa hasta que el deslizamiento de la tapa se deslice fácilmente sin aplicar fuerza. Dependiendo de cuánto tiempo lleve montado el abrigo, esto puede tardar hasta 16 horas.
2. Mientras las láminas están en remojo, prepare una solución de 1 mg·mL^⁻1 de LiBH₄ en DI H₂O libre de RNasa, mezclando suavemente hasta que se disuelva completamente y espere 10 minutos a que se active. La activación se ha producido cuando hay burbujas presentes en la solución y la actividad dura hasta 4 horas.
   Precaución: LiBH₄ es reactivo al agua, evita la exposición excesiva del material en polvo a la humedad y elimina adecuadamente los residuos en consecuencia.
3. Lava las láminas una vez durante 2 minutos en PBS 1X libre de RNasa para eliminar cualquier residuo de medio de montaje, luego pipetea 100–150 μL de la solución_{LiBH 4} sobre cada tejido. Incuba en una caja húmeda durante 15 minutos.
   Nota: Dependiendo de los fluoróforos utilizados para la tinción, este tiempo de incubación puede necesitar alargarse (discutido extensamente en los artículos sobre los métodos IBEX^)12,13.
4. Lava las láminas una vez sumergiéndolas en un PBS 1X sin RNasa y sumergiéndolas brevemente arriba y abajo.
5. Procede a teñir las láminas con marcadores proteicos adicionales siguiendo los pasos 3.5-3.15. No es necesario volver a teñir el tinte nuclear porque no se blanquea con_{LiBH 4}. Repite la tinción de proteínas si es necesario.
   Punto de pausa: Las láminas montadas pueden almacenarse a 4°C durante la noche antes de blanquear el último ciclo de proteínas/IBEX y pasar al ARN.
6. Inmediatamente procede al RNAscope HiPlex tras blanquear los fluoróforos del ciclo final. Aunque se han realizado hasta seis ciclos de IBEX estándar sin pérdida de tejido ni epítopos, no recomendamos superar los tres ciclos de tinción proteica para este protocolo debido al potencial de disminuir la calidad de los transcritos de ARN en periodos prolongados.

5. Preparación de portaobjetos para RNAscopio HiPlex

1. Sumerge completamente las láminas en PBS 1X sin RNasa hasta que la capa de cobertura se deslice fácilmente sin aplicar fuerza. Dependiendo de cuánto tiempo lleve montado el abrigo, esto puede tardar hasta 16 horas. Lávate una vez durante 2 minutos en un PBS 1X libre de RNasa para eliminar cualquier residuo de medio de montaje.
2. Prepara 200 mL de etanol al 50%, 200 mL de etanol al 70% y 400 mL de etanol al 100%.
3. Enciende un horno de hibridación y ponlo a 60°C. Diluye el reactivo de recuperación de objetivos 10X a un material de trabajo 1X en DI_{H 2O}libre de RNasa y precalenta colocándola en el horno hasta el paso 5.8.
   Nota: No calentar previamente el reactivo de recuperación del objetivo a 60°C afectará al registro posterior de imágenes de los ciclos separados. El reactivo de recuperación del objetivo debe permanecer a 60°C durante toda la etapa de recuperación.
4. Sumerge las láminas en etanol al 50%. Incubar durante 5 minutos en tiempo de descanso.
5. Retira las láminas del etanol al 50% y sumergilas en etanol al 70%. Incubar durante 5 minutos en tiempo de descanso.
6. Retira las láminas del etanol al 70% y sumergilas en etanol al 100%. Incuba durante 5 minutos en RT y repite con etanol fresco al 100%.
7. Retira las láminas del etanol al 100% y deja secar en RT durante 5 minutos.
8. Añade entre 100 y 150 μL del reactivo de recuperación de objetivos 1X a 60°C a cada sección de tejido y coloca las láminas en el horno de hibridación. Incuba a 60°C durante 1 hora.
9. Retira las láminas y enjuaga sumergiéndolas en DI H2O libre de RNasa durante 15 segundos. En ese momento, cambia la temperatura establecida en el horno a 40°C.
10. Transfiere las láminas a 100% etanol e incuba durante 5 minutos, luego seca en RT un mínimo de 5 minutos.
11. Aplica Proteasa III a las láminas, 1–2 gotas por sección de tejido. Coloca los portaobjetos en el horno de hibridación e incuba a 40°C durante 30 minutos.
12. Sumerge las láminas en DI H_2Olibre de RNasa y lava sumergiéndolas brevemente arriba y abajo. Repite con agua destilada fresca para un total de 2 lavados.

6. Preparación de reactivos por ARNoscopio e hibridación con sonda

1. Prepara las culatas de la sonda RNAscope HiPlex y el diluyente de la sonda HiPlex calentándolas a 40°C durante 10 minutos en horno o baño marea.
2. Un breve impulso de spin a todas las acciones de la sonda 50X. Prepara una mezcla de sonda funcional diluyendo cada sonda objetivo única a 1X con el diluyente de sonda RNAscope. Planea usar entre 50 y 100 μL de mezcla de sonda por tejido y mezclarla bien mediante vórtices antes de su uso. El protocolo RNAscope HiPlex puede acomodar hasta 3 ciclos de 4 sondas (12 sondas en total denominadas T1-12). Para orientación sobre el diseño de la sonda, consulte el protocolo^{RNAscope 14} publicado originalmente.
3. Coloque los reactivos RNAscop HiPlex Amp 1–3 y HiPlex Fluoro T1-T4 en RT para equilibrarse.
4. Toma las láminas tratadas con Proteasa III y pipetea 50–100 μL de la mezcla de sonda en cada sección de tejido. Colócala horizontalmente en el horno de hibridación y incuba durante 2 horas a 40°C.
5. Lava las láminas sumergiéndolas completamente en un buffer de lavado 1X durante 2 minutos. Repite con un tampón fresco para un total de 2 lavados.
   Punto de pausa: Las láminas pueden almacenarse en un búfer SSC 5X en RT durante la noche, como se describe en el protocolo RNAscope de ACD. Si se utiliza este punto de pausa, ten en cuenta que a la mañana siguiente serán necesarias dos lavados de 2 minutos en buffer de lavado 1X.

7. Amplificación de la sonda

Nota: Asegúrese de que todos los reactivos estén equilibrados a RT antes de aplicarlos a las láminas.

1. Añade 1–2 gotas del reactivo HiPlex Amp1 a las láminas e incuba en el horno de hibridación a 40°C durante 30 minutos. Lava las láminas sumergiéndolas completamente en un buffer de lavado 1X durante 2 minutos. Repite para un total de 2 lavados.
2. Añade 1–2 gotas del reactivo HiPlex Amp2 a las láminas e incuba en el horno de hibridación a 40°C durante 30 minutos. Lava las láminas sumergiéndolas completamente en un buffer de lavado 1X durante 2 minutos. Repite para un total de 2 lavados.
3. Añade 1–2 gotas del reactivo HiPlex Amp3 a las láminas e incuba en el horno de hibridación a 40°C durante 30 minutos. Lava las láminas sumergiéndolas completamente en un buffer de lavado 1X durante 2 minutos. Repite para un total de 2 lavados.
4. Añade 1–2 gotas del reactivo HiPlex Fluoro T1-T4 a las láminas e incuba en el horno de hibridación a 40°C durante 15 minutos. Lava las láminas sumergiéndolas completamente en un buffer de lavado 1X durante 2 minutos. Repite para un total de 2 lavados.
5. Añade 3–4 gotas de reactivo HiPlex DAPI a cada sección de tejido e incuba durante 1 minuto en RT.
6. Retira el DAPI absorbiendo el líquido de los portaobjetos con una toallita absorbente. Añade inmediatamente 100 μL de medio de montaje antifundido con base acuosa (puede ser el mismo que se usa durante los pasos de tinción IBEX) a cada sección. Coloca cuidadosamente una funda de cobertura en el lavabos, asegurándote de minimizar las burbujas, y deja que el medio de montaje seque entre 15 y 30 minutos.
7. Procede a la imagen.
   Punto de pausa: Las portaobjetos montadas pueden almacenarse en la oscuridad a 4°C durante hasta 3 días, aunque recomendamos proceder rápidamente para asegurar una degradación mínima del ARN.

8. División de los fluoróforos e hibridación iterativa de ARN

1. Para quitar los deslizamientos de la cubierta de las correderas, remojas en buffer 4X SSC durante al menos 30 minutos en RT. Lava una vez sumergiendo completamente las correderas en buffer 4X SSC nuevo y sumergiendo brevemente arriba y abajo.
2. Abre una ampolla nueva de solución de corte y haz un 10% de material de trabajo diluyendo con 4X SSC buffer.
3. Coloca las láminas en una caja húmeda y añade 3–4 gotas de la solución de corte al 10%. Incubar en RT durante 15 minutos y luego lavar las láminas sumergiéndolas completamente en PBST al 0,5% durante 2 minutos. Repite con PBST fresco para un total de 2 lavados.
4. Para proceder con el ciclo de imagen 2 del panel de ARNoscopio, equilibrar el reactivo HiPlex Fluoro T5-T8 con RT.
5. Enciende el horno de hibridación y pon la temperatura a 40°C.
6. Añade el reactivo HiPlex Fluoro T5-T8 a las láminas y incuba en el horno de hibridación a 40°C durante 15 minutos. Lava las láminas sumergiéndolas completamente en un buffer de lavado 1X durante 2 minutos. Repite para un total de 2 lavados.
7. Absorbe cuidadosamente el exceso de líquido de las láminas. Inmediatamente añade 100 μL de medio de montaje a cada sección y coloque cuidadosamente un abrigo de cubierta sobre la corredera. Deja secar el medio de montaje entre 15 y 30 minutos y luego procede a la imagen.
8. Repita los pasos 8.1–8.7 con el reactivo HiPlex Fluoro T9-T12 para un total de 3 ciclos de ARNoscopio si es apropiado. Cabe señalar que, aunque con el protocolo RNAscope HiPlex son posibles 3 ciclos, el tiempo adicional necesario para la tinción de proteínas con este protocolo puede afectar a la calidad del ARN. Por lo tanto, 3 ciclos pueden no ser siempre viables dependiendo de los transcripciones específicas que se estén a objetivo.

9. Procesamiento de imágenes

1. Procesa individualmente los archivos raw de cada ronda y realiza el procesamiento de imágenes usando parámetros consistentes, incluyendo ajustes de resta de fondo, filtros de suavizado y tipo de transformación de registro. Los canales deben nombrarse con un carácter separador consistente (por ejemplo, Ciclo 1: CD45 AF532, donde ":" marca la distinción entre ciclo y marcador/fluor).
2. Lanza el software SimpleITK (https://github.com/niaid/sitk-ibex) y haz clic en extensiones Imaris > SimpleITK > registro afín de la pila z usando canal común.
3. Sube un archivo imagen de cada uno de los ciclos multiplex e introduce el carácter separador para todos los canales nombrados (por ejemplo, ":").
4. Selecciona el canal que se usará para el registro de imágenes y la imagen fija a la que se alinearán todas las demás imágenes. Se recomienda usar DAPI como marcador fiducial, aunque se puede usar cualquier canal común con nombre entre todos los ciclos.
5. Haz clic en "Registrar" y luego en "Remuestrear y guardar la imagen combinada".
6. Procede al análisis posterior con el software que prefieras. Para más información sobre el procesamiento y registro de imágenes, consulte el protocolo IBEX^{original 12,13}.

Results

Figura 1: Resumen del flujo de trabajo de Bex-Plex.
Los tejidos congelados fijos seccionados sobre portaobjetos recubiertos de cromo alumbrado pasan por hasta 3 ciclos de IBEX estándar, seguidos de hasta tres ciclos de RNAScope HiPlex, en los que el primer paso de recuperación del objetivo se realiza a 60°C durante 1 hora. Las imágenes de ciclos separados se registran y alinean utilizando un marcador fiducial (por ejemplo, DAPI) para crear un conjunto de datos multiplex para análisis posteriores. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Utilizamos el protocolo descrito anteriormente para perfilar el microambiente tumoral (TME) de un modelo murino de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC ) (Figura 1). Una línea tumoral aislada de Kras^LSL-G12D/+; Trp53^L/+; Pdx1-Cre; Los ratones^{Rosa26 YFP/YFP} (KPCY), que desarrollan espontáneamente cáncer de páncreas y recapitulan muchas de las características clave de la PDAC humana, fueron inyectados subcutáneamente en el flanco de ratones C57BL/6⁷. Los ratones portadores de tumores fueron tratados con inmunoterapia combinada que consistía en ^anti-PD1 (i.p. 200 μg•^ratón-1, RMP1-14) y anti-CTLA-4 (i.p., 200 μg•^ratón-1, 9H10) administrados al día 10 tras la implantación y continuados cada 3 días hasta el final del experimento. Se administró anti-CD40 agonista (p.i., 100 μg•^mouse-1, FGK45) como dosis única al día 13 tras la implantación. Juntos, nos referimos a esto como "FPC", como se publicó anteriormente7,16. Se recogieron tres tumores por grupo experimental a los 16 días de la implantación y se montaron secciones fijas congeladas sobre portaobjetos recubiertos de alumbre cromado para Bex-Plex.

Figura 2: Resultados representativos IBEX + RNAscopio (Bex-Plex).
(A) La tinción combinada de IBEX y ARNoscopio en secciones tumorales de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC ) demuestra la co-detección de blancos de proteínas y ARN y la alineación de canales de fluorescencia. Barra de escala, 10 μm. (B) Cuantificación de los compartimentos inmunitarios de células T (CD3+ CD11b-), macrófagos (CD11b+ CD68+) y mieloides (CD11b+ CD68- Ly6G +/-) basada en la intensidad de los canales de marcadores proteicos. Los gráficos muestran la densidad celular media para cada tipo celular por grupo de tratamiento, n=3 tumores. (C) Cuantificación de células expresoras de transcritos Pdl1 e Il10 en los compartimentos inmunitarios previamente identificados por proteínas. Los gráficos muestran la densidad celular media por grupo de tratamiento, n=3 tumores. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Se realizó un ciclo de tinción proteica en tres tumores tratados con FPC y tres tumores tratados con isotipo para evaluar los efectos sobre las células de línea mieloide entre grupos de tratamiento. Se adquirieron siete parámetros, aunque aquí nos centramos en tres marcadores de interés: CD11b, Ly6G y CD68 (Figura 2A). Tras la adquisición de la imagen, los fluoróforos de la tinción proteica fueron blanqueados y se realizó una ronda de ARNoscopio utilizando sondas contra Il10 y Pdl1 (Figura 2A). Las imágenes separadas se alinearon entonces usando DAPI como fiduciario (Figura 2A). La intensidad media cuantitativa de fluorescencia de CD11b, CD68, Ly6G y CD3 reveló una tendencia hacia menos macrófagos y células mieloides en tumores tratados con FPC en comparación con los controles (Figura 2B). Se realizaron comparaciones cuantitativas en todas las muestras y los datos se presentan en valores medios. Además, el número de células que expresan Pdl1, Il10 o una combinación de ambos transcritos en los compartimentos macrófago y mieloide mostró una tendencia a la baja con el tratamiento con FPC en comparación con los controles (Figura 2C). Estos resultados indican una posible reducción de las poblaciones celulares inmunosupresoras tras el tratamiento, coherente con las respuestas biológicas esperadas.

Figura 3: Optimización de las condiciones de recuperación de objetivos para la preservación nuclear.
(A) Imagen representativa de un tejido tras la extracción de la diana RT que muestra hinchazón nuclear y morfología indistinta. Los ejemplos de tamaños nucleares se indican con contornos amarillos. Barra de escala, 40 μm . (B) Imagen representativa de un tejido tras la recuperación modificada del objetivo que muestra una morfología nuclear mejorada con condiciones de temperatura ajustadas. Ejemplos de tamaño nuclear indicados por contornos amarillos. Barra de escala, 40 μm. (C) Volumen nuclear medio determinado por segmentación basada en DAPI en tejidos que han sido sometidos a recuperación de objetivo RT (no precalentados), recuperación de objetivos precalentados a 60°C, o bajo condiciones estándar de FI sin recuperación de objetivo. Las barras del gráfico indican la media y las barras de error muestran la desviación estándar. P < 0,0001 por ANOVA unidireccional ordinaria (los asteriscos indican umbral de significación estadística); n= 1639 celdas por condición. (D) Mapas de calor que representan las puntuaciones de correlación entre tres imágenes antes y después de la alineación de imágenes. Se muestran puntuaciones de correlación para un registro exitoso y uno que no coincidió debido a diferencias a nivel nuclear.

Es importante destacar que, cuando Bex-Plex se realizó sin la recuperación modificada del objetivo descrita, los núcleos parecían agrandados con bordes poco definidos en comparación con los núcleos de un tejido donde la recuperación modificada del objetivo se realizó correctamente (Figuras 3A y B). El uso de regente de recuperación de objetivos a temperatura ambiente llevó a un aumento del 33% en el volumen nuclear medio basado en la tinción DAPI en comparación con la recuperación de objetivos realizada con reactivo precalentado a 60°C (Figura 3C). Se obtuvieron mediciones de volumen nuclear a partir de campos representativos entre muestras utilizando segmentación basada en DAPI. Además, cuando este paso se realizó a 60°C usando reactivo de recuperación precalentado, el volumen medio nuclear no difería significativamente del volumen nuclear medio tras la tinción estándar de FI (Figura 3C). Como DAPI es el parámetro más eficaz para usar como referencia para el alineamiento de imágenes, esta comparación (Figura 3) destaca la importancia crítica de los parámetros modificados de recuperación para preservar la morfología nuclear. El registro correcto de la imagen se indica mediante una puntuación de correlación de alineamiento cercana a 1, lo que indica similitud entre imágenes de diferentes ciclos (Figura 3D, antes vs éxito).

La implementación exitosa del protocolo se indica por la morfología nuclear preservada, una señal de ARN fuerte y específica, y una alineación precisa de los canales de proteínas y ARN. En cambio, los resultados subóptimos pueden incluir distorsión nuclear, señal de ARN débil o difusa y desalineación entre ciclos de imagen (Figura 3D, antes vs fallido). Como se muestra en la Figura 3C, la morfología nuclear debe mantenerse a lo largo de todo el protocolo y será tanto cualitativa como cuantitativamente aparente. Antes de la implementación de Bex-Plex, los usuarios deben verificar la verdad fundamental de sus tejidos de interés mediante tinción separada de proteínas y ARN. Esto no solo garantiza una tinción optimizada de proteínas y ARN para los tejidos objetivo, sino que proporciona patrones espaciales relevantes que deben mantenerse al combinarse para Bex-Plex. Por ejemplo, CD11b colocaliza tanto CD68 como Ly6G y muestra tinción localizada en membrana celular (Figura 2A). Esto es de esperar, ya que CD11b es un marcador de células panmieloides y CD68 y Ly6G son marcadores de los subconjuntos de macrófagos y mieloides neutrófilos. La detección exitosa de ARN se caracteriza por señales puntuales distintas localizadas en células individuales, mientras que los resultados subóptimos pueden presentarse como tinción débil o difusa. La señal de la sonda de ARN debería mostrar localización en y alrededor del núcleo, dependiendo de la función del transcrito. Marcadores proteicos estructurales como la vimentina podrían incluirse para mejorar la resolución celular de la localización de transcritos al revelar las membranas celulares en tejidos complejos. Se espera que las muestras negativas o de control muestren una tinción de fondo mínima y ninguna señal de sonda inespecífica, confirmando la especificidad tanto de la detección de proteínas como de ARN.

Discussion

El flujo de trabajo Bex-Plex integra la plataforma iterativa de tinción proteica, IBEX, con la hibridación in situ de ARNscope para permitir la detección simultánea de proteínas y transcritos de ARN a resolución unicelular. El objetivo principal de este protocolo es proporcionar un método reproducible para el análisis espacial integrado de la expresión de proteínas y ARN dentro de tejidos intactos. La capacidad de medir tanto la expresión de proteínas como de ARN en el mismo tejido ha presentado previamente desafíos técnicos: altos costes, complejos pasos de recuperación de antígenos, capacidad limitada de multiplexación, limitaciones de resolución (no célula individual), amplificación no lineal de señales y extensas canalizaciones bioinformáticas para procesamiento aguas ^{abajo 17,18,19}. En comparación con enfoques existentes como la inmunofluorescencia multiplex, la tinción OPAL/TSA y las plataformas de transcriptómica espacial, Bex-Plex permite la detección simultánea reproducible, cuantitativa y de alto plex, preservando el contexto espacial y la morfología nuclear para una alineación precisa de la imagen. Además, Bex-Plex puede realizarse en un entorno de laboratorio estándar y genera datos con una resolución de celda única que es fácil de procesar. Aprovechar este protocolo para obtener una comprensión integral de las interacciones célula-célula en diversos contextos tisulares, como en el microambiente tumoral, será esencial para desarrollar inmunoterapias más eficaces y mejorar los resultados en pacientes a través de los estados patológicos.

Nuestro método se realiza en tejidos fijos incrustados en OCT y sigue el flujo de trabajo estándar IBEX sin modificaciones, seguido de un protocolo RNAscope HiPlex ligeramente alterado. Una diferencia clave es el paso de recuperación del objetivo al inicio del flujo de trabajo de hibridación de ARN: en lugar de los 99°C del fabricante durante 5 minutos, la extracción se realiza a 60°C durante 1 hora. Este ajuste preserva la arquitectura nuclear, que es imprescindible para una alineación precisa de imagen entre los ciclos de proteínas y ARN. Los pasos críticos de este protocolo incluyen mantener una temperatura constante de recuperación del objetivo, blanqueamiento eficiente con fluoróforo usando LiBH₄ y minimizar la degradación del ARN mediante un procesamiento rápido y uso de reactivos libres de RNasa. Es fundamental asegurar el uso de reactivos de recuperación de objetivos precalentados a 60°C; No hacerlo puede causar inflamación nuclear incluso con el paso de incubación modificado.

Aunque se ha demostrado que 15 minutos de incubación con_{LiBH 4} son suficientes para inactivar muchos fluoróforos comúnmente utilizados, se recomienda verificar individualmente este proceso para cada ciclo proteico antes de ejecutar todo el protocolo Bex-Plex. En las publicaciones iniciales de IBEX se caracteriza bien que no todos los fluoróforos compatibles con IBEX son igualmente^{blanqueables 12}. Además, nuestro laboratorio ha observado que algunos marcadores estructurales de alta abundancia, como la vimentina, pueden requerir un tiempo de blanqueamiento más largo. Confirmar que las combinaciones de fluoróforo y marcador utilizadas se blanquearán adecuadamente debería evitar el derrame de señales residuales en ciclos posteriores de proteínas y ARN. La página de la Comunidad IBEX tiene excelentes recursos para el diseño de paneles compatibles con IBEX y está específicamente destinada a reducir la carga para los nuevos usuarios indicando la eficacia de los anticuerpos y el blanqueamiento con fluoróforo^{multiplicado por 20}. Además, la tinción iterativa y el blanqueamiento no deberían afectar a la calidad de los transcritos de ARN, aunque es importante completar los ciclos de proteínas lo más rápido posible y utilizar reactivos libres de ARN para minimizar cualquier degradación del ARN que pueda ocurrir con el tiempo. No hacerlo afectará a la hibridación de la sonda y conducirá a una disminución de la señal para cualquier ciclo de ARNoscopio realizado, especialmente para transcritos de baja abundancia. Los problemas comunes encontrados durante el protocolo incluyen una señal de ARN débil, blanqueamiento incompleto de fluoróforos y desalineación entre ciclos de imagen, que pueden mitigarse optimizando las condiciones de tinción y los parámetros de imagen.

Es imprescindible limitar el tiempo entre la tinción de proteínas y la hibridación con sonda de ARN a menos de 5 días. Al realizar Bex-Plex en varias láminas, se recomienda encarecidamente procesar una lámina a la vez para reducir la variabilidad en la degradación del ARN. De manera similar, limita el tiempo entre la hibridación de la sonda y la obtención de imágenes. Aunque hemos conseguido hacer imágenes hasta 3 días después de la amplificación, no se recomienda un almacenamiento más largo. Si hay una señal reducida tras varios ciclos de tinción o hibridación, puede ser necesario aumentar la velocidad a lo largo del protocolo. Idealmente, recomendamos trabajar lo más rápido posible, ya que los retrasos reducen la integridad del ARN y pueden disminuir la amplificación. Otros enfoques incluyen reducir el número de ciclos de proteínas realizados para que encajen más fácilmente en las restricciones temporales del protocolo o cambiar el diseño del panel de sonda de ARN para incluir objetivos de mayor abundancia. Antes de combinar IBEX y RNAscope, valida por separado los paneles de anticuerpos y de sonda para cada ciclo para determinar la calidad de señal esperada para cada ciclo. En caso de hinchazón nuclear tras la recuperación del objetivo, es posible que el reactivo de recuperación del objetivo no se haya precalentado correctamente. Asegúrese de que el reactivo de extracción no se deje enfriar una vez diluido y precalentado a 60^°C y que la temperatura se mantenga constante durante la incubación de 1 hora en el portaobjetos. Por último, si el registro y alineación de la imagen fallan en ausencia de hinchazón nuclear, significa que hubo un desajuste en parámetros de adquisición de imagen como la profundidad de bits, el tamaño del vóxel o la posición Z a lo largo de los ciclos. En caso de tales errores, puede ser necesario repetir el protocolo con ajustes en estos ajustes para que sean consistentes. Estas estrategias de solución de problemas son esenciales para garantizar la reproducibilidad y la consistencia entre experimentos.

Los datos generados por Bex-Plex permiten una visión en profundidad del paisaje espacial de tejidos a un nivel hasta entonces inalcanzable. Sin embargo, una limitación importante de este protocolo es el hecho de que el número total de ciclos iterativos de proteínas posibles es menor que con IBEX solo, debido a la degradación gradual del ARN a lo largo del tiempo. Aunque se han realizado hasta 6 ciclos de IBEX estándar, no recomendamos superar los 3 ciclos de tinción proteica para Bex-Plex. Aun así, el protocolo permite el máximo número de ciclos de ARNscopio y este nivel de profundidad multiplex es suficiente para la mayoría de las aplicaciones.

Otras limitaciones incluyen la variabilidad entre tipos de tejidos y posibles artefactos de autofluorescencia o tinción que pueden afectar a la interpretación de la señal. Tejidos más frágiles pueden soportar menos ciclos y diferentes tipos de tejido pueden tener características únicas que afectan a la tinción. Estas limitaciones pueden evaluarse mediante tinciones de ciclo único de proteínas o ARN y abordarse antes de ejecutar Bex-Plex. Seccionar sobre portaobjetos recubiertos de alumbre de cromo mejorará sustancialmente la adherencia tisular y la integridad estructural, pero la autofluorescencia es una consideración para todas las técnicas basadas en inmunofluorescencia. Además, actualmente el protocolo no ha sido validado en FFPE ni en muestras clínicas humanas y requerirá una optimización adicional para tales aplicaciones. Sin embargo, dado que IBEX y RNAscopio se realizan predominantemente en tejidos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE), es factible que Bex-Plex pueda expandirse a estos tipos de muestras. La implementación exitosa requerirá una mayor optimización de la obtención de antígenos y, potencialmente, pasos de recuperación de objetivos para preservar la calidad del ARN.

En general, Bex-Plex ofrece un método sencillo, económico y ampliamente accesible para análisis espaciales de alto complejo. Este método es especialmente adecuado para aplicaciones como el análisis de microambientes tumorales, el perfilado de células inmunitarias y el mapeo espacial de interacciones de señalización. Esta visión integrada mejora la capacidad de analizar mecanismos de regulación inmunitaria, heterogeneidad tumoral y respuesta terapéutica en una amplia gama de modelos experimentales. Bex-Plex será invaluable en contextos donde sea necesario estudiar la diafonía que ocurre entre células en tejido intacto, como en el microambiente tumoral o en otros tejidos durante la inflamación y la homeostasis. En particular, la capacidad de resolver la dinámica espacial de la señalización de citocinas mediante la búsqueda de transcripciones de moléculas de corta vida junto con marcadores fenotípicos de proteínas proporcionará una comprensión más profunda de las interacciones celulares entre estados patológicos. Las mejoras futuras podrían incluir el aumento de la capacidad de multiplex, la integración con canales automatizados de análisis de imágenes y la adaptación de muestras clínicas de biopsia ampliando el flujo de trabajo para incluir tejidos FFPE.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeablization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
No 1.5 Coverglass	VWR	48393-241
Pipette tips (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (includes detection kit, cleaving stock solution, protease reagents, target retreival reagents, and wash buffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slide staining tray/humidity chamber
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Microscope slides	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molecular Biology grade	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase free water	Fisher Scientific	10977023