Un flujo de trabajo para visualizar la dinámica conformacional de proteínas a partir de mapas crio-EM utilizando asparagina sintetasa humana

Summary

Este protocolo describe cómo realizar análisis de variabilidad 3D (3DVA) en CryoSPARC y refinamiento de variabilidad en Phenix para analizar la heterogeneidad conformacional en los datos crio-EM. Usando la asparagina sintetasa humana como ejemplo, describe cómo generar mapas de variabilidad, visualizar componentes principales y refinar modelos atómicos correspondientes.

Abstract

Este artículo presenta un flujo de trabajo completo para analizar la heterogeneidad conformacional en datos de criomicroscopía electrónica de partícula única (crio-EM) utilizando análisis de variabilidad 3D (3DVA) en CryoSPARC y refinamiento de la variabilidad en Phenix. El protocolo describe cómo calcular mapas de variabilidad a lo largo de componentes principales derivados de imágenes de partículas, visualizar modos principales de variación estructural y refinar conjuntos correspondientes de modelos atómicos frente a marcos individuales de variabilidad. Los resultados resultantes incluyen una serie de mapas de variabilidad 3D, estructuras atómicas multimodelo refinadas que representan estados conformacionales discretos y archivos de visualización adecuados para análisis estructural comparativo y generación de películas. Este flujo de trabajo es ampliamente aplicable a reconstrucciones crio-EM en el rango de resolución (típicamente ~2,0-6,0 Å), donde la heterogeneidad conformacional puede interpretarse de forma significativa a nivel de columna y cadena lateral. Es especialmente adecuado para capturar movimientos continuos en dominios, movimientos de flexión de bisagra y reordenamientos locales coordinados que no se resuelven fácilmente solo con una clasificación discreta. El uso combinado de mapas de variabilidad y conjuntos de modelos refinados permite la comparación estructural directa de extremos conformacionales, apoya análisis cuantitativos como los cálculos de fluctuación cuadrática media (RMSF) y proporciona un marco para vincular características estructurales dinámicas con hipótesis bioquímicas o funcionales. La asparagina sintetasa humana (ASNS) se utiliza como ejemplo para demostrar la implementación práctica del flujo de trabajo.

Introduction

Caracterizar la heterogeneidad conformacional en estructuras macromoleculares es un aspecto cada vez más importante del análisis criomicroscopía electrónica de partícula única (crio-EM). El objetivo de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo práctico para extraer, visualizar y refinar los modos dominantes de variabilidad estructural directamente de conjuntos de datos crio-EM utilizando análisis de variabilidad tridimensional (3DVA) en CryoSPARC¹ combinado con refinamiento de variabilidad en^{Phenix 2}. Este artículo tiene como objetivo guiar a los lectores para determinar si este enfoque computacional es apropiado para sus datos y para comprender los tipos de salidas generadas por el flujo de trabajo.

Las técnicas experimentales tradicionales (por ejemplo, intercambio hidrógeno-deuterio, espectroscopía RMN, espectrometría de masas) proporcionan información valiosa sobre los movimientos de^{proteínas 3,4,5}, pero a menudo están limitadas por el tamaño molecular, los requisitos de la muestra o la complejidad experimental. Los avances en crio-EM han permitido la determinación de estructuras de alta resolución para sistemas grandes y heterogéneos, lo que permite el análisis de la variabilidad conformacional dentro de poblaciones de partículas. El análisis de variabilidad 3D (3DVA), implementado en CryoSPARC¹, descompone conjuntos de datos de partículas crio-EM en componentes principales que describen modos dominantes y continuos de variación estructural. Cuando se combina con el refinamiento de variabilidad en^{Phenix 2}, este enfoque produce modelos atómicos correspondientes a posiciones discretas a lo largo de cada componente principal, permitiendo la visualización y comparación de conformaciones alternativas derivadas de datos experimentales.

Este protocolo es más adecuado para conjuntos de datos crio-EM reconstruidos a resolución cercana a la atómica a intermedia (típicamente ~2-6 Å). A resoluciones más altas, el flujo de trabajo puede capturar reestructuraciones de la columna vertebral y variabilidad limitada de la cadena^{lateral 6}, mientras que a resoluciones más bajas es más adecuado para identificar movimientos a nivel de dominio o estructura^{secundaria 2,7}. El método es adecuado para capturar modos dominantes y continuos de movimiento que están ampliamente poblados en el conjunto de datos, como movimientos de bisagra, respiración de dominio o reordenamientos coordinados entre dominios o subunidades. Un número adecuado de partículas y una cobertura angular son esenciales, y la interpretación puede estar limitada en regiones flexibles o con resolución débil donde las posiciones de las cadenas laterales permanecen ambiguas. En comparación con la clasificación^{enfocada 8} o las estrategias de subclasificación extensiva, el flujo de trabajo de refinamiento de variabilidad 3D representa la heterogeneidad conformacional como trayectorias continuas en lugar de clases discretas. Esto hace que el método sea especialmente útil para el análisis exploratorio de enzimas, máquinas moleculares y complejos multidominio que se espera muestreen múltiples conformaciones.

La asparagina sintetasa humana (ASNS) se utiliza como ejemplo ilustrativo para demostrar la implementación del protocolo. ASNS es una amidotransferasa dependiente de la glutamina compuesta por dos dominios funcionales conectados por un túnel intramolecular de^{amoníaco 9,10}. Estudios previos han sugerido que cambios conformacionales que involucran residuos como Arg-142 contribuyen a la modulación de este^{túnel 6}. En este artículo, ASNS sirve únicamente como un sistema representativo para demostrar cómo el refinamiento 3DVA y la variabilidad generan mapas de variabilidad, conjuntos refinados de modelos atómicos y visualizaciones. La interpretación mecanicista detallada se remite a las secciones de Resultados y Discusión. Aunque las simulaciones de dinámica molecular (MD) se utilizan a menudo como un enfoque complementario para explorar paisajes^{conformacionales 11,12}, la MD no es necesaria para este protocolo. Las comparaciones con simulaciones MD pueden realizarse como un análisis posterior opcional, pero el flujo de trabajo descrito aquí (Figura 1) se centra exclusivamente en extraer y visualizar la heterogeneidad conformacional a partir de datos crio-EM.

Figura 1. Resumen del flujo de trabajo. Un mapa criogénico-EM consensuado se reconstruye a partir de datos de partícula única y se somete a un análisis de variabilidad tridimensional (3DVA) para generar mapas de variabilidad a lo largo de componentes principales. El refinamiento de variabilidad (Phenix.varref) utiliza el modelo atómico de consenso para generar modelos atómicos correspondientes para visualización y comparación. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Protocol

1. Preparación de datos

1. Generación de un mapa EM de consenso
   1. Utiliza la criomicroscopía electrónica de partícula única (crio-EM) para determinar la estructura tridimensional consensuada del complejo macromolecular.
   2. Vitrifica muestras en crio-rejillas e imágenes usando un microscopio electrónico de transmisión de alta tensión equipado con un detector directo de electrones.
   3. Procesa las películas recogidas para corregir el movimiento inducido por el haz, estimar parámetros de imagen y seleccionar imágenes de partículas.
   4. Realizar clasificación iterativa y refinamiento de las partículas para generar un mapa EM consensuado.
   5. Realizar el procesamiento de datos usando CryoSPARC (v4 o superior)¹³, ya que se implementará el análisis de variabilidad 3D (3DVA).
2. Generar un modelo de consenso
   1. Construye un modelo atómico y refina su función con el mapa de consenso. Validar la calidad refinada del modelo usando criterios estándar
      NOTA: Para ASNS, la estructura se determinó utilizando una estrategia de selección de partículas basada en plantillas. Se utilizó una plantilla derivada de la estructura de rayos X del ASNS humano modificado con DON (PDB 6GQ3)⁹para seleccionar de forma eficiente partículas de alta calidad en CryoSPARC¹³. Estas partículas sufrieron rondas iterativas de clasificación 2D, reconstrucción Ab initio y refinamiento heterogéneo y no uniforme con simetría C2 impuesta, dando lugar a un mapa de consenso de 3,5 Å. El modelo atómico se generó utilizando la estructura^{cristalina 9} en el mapa EM, seguido de refinamiento en espacio real en Phenix^14,15 y ajuste manual en Coot¹⁶, produciendo la estructura ASNS de consenso final^{descrita 6}.

2. Realizar análisis de variabilidad 3D (3DVA)

1. Usa la pila de partículas y la máscara (no un mapa final refinado) para un refinamiento final
   NOTA: A menudo, los resultados de un trabajo de refinamiento no uniforme se usan para el 3DVA.
2. Crea un trabajo de Variabilidad 3D en CryoSPARC. Entrada de la pila de partículas y la máscara del trabajo de refinamiento no uniforme.
3. Establece el número de modos a resolver: número de componentes principales (PCs) a 5.
   NOTA: Dado que existen estructuras macromoleculares en el espacio tridimensional, generalmente se requieren al menos tres PCs para describir sus principales modos espaciales de movimiento. Para asegurar que no se pasaran por alto variaciones conformacionales adicionales, potencialmente menores pero funcionalmente relevantes, se incluyeron dos PCs más.
4. Establece la resolución del filtro a 4,0 Å y la resolución pasa-alta a 20. Deja todos los demás parámetros como valores predeterminados. Empieza el trabajo.
   NOTA: La "resolución del filtro" de 4,0 Å se configuró para coincidir con la calidad general del conjunto de datos, evitando el sobreajuste a ruido de alta frecuencia. Dado que el mapa de consenso final se determinó a una resolución de 3,5 Å, aplicar una resolución de filtro ligeramente inferior (4,0 Å) aseguró que el análisis de variabilidad se centrara en movimientos estructurales genuinos en lugar de ruido cercano al límite de resolución.
5. Obtener un conjunto de volúmenes de variabilidad como salida (Figura 2A)

3. Realización de la visualización de variabilidad 3D

1. Crea un trabajo de visualización de variabilidad 3D en CryoSPARC para visualizar los cambios conformacionales continuos identificados por el 3DVA.
2. Introduce la pila de partículas y los volúmenes de variabilidad generados por el trabajo 3DVA.
3. Selecciona Simple como modo de salida (ver más abajo).
4. Configura la resolución del filtro en 4.0 y la resolución pasa-alta en 20. Deja todos los demás parámetros en sus valores predeterminados. Empieza el trabajo.
5. Obtén 20 mapas de variabilidad como resultado (fotograma 0 a 19) correspondientes a 5 componentes principales (PC) de 0 a 4 (Figura 2B)
   NOTA: El "modo simple" en el programa 3D Variability Display ofrece una visualización directa de los cambios conformacionales a lo largo de cada componente principal. Este modo genera trayectorias lineales entre los estados extremos identificados por 3DVA, permitiendo una interpretación clara y directa de los movimientos dentro de la población de partículas.

4. Preparación de datos para películas y refinamiento de variables 3D Phenix

1. Descargar mapas de variabilidad 3DVA: Descarga los archivos zip que contienen mapas de variabilidad para PCs 0-4 (cinco zips en total) desde CryoSPARC.
2. Organizar directorios: Crear una carpeta principal (por ejemplo, 3DVA/). En su interior, crea una subcarpeta para cada componente principal (comp0, comp1, comp2, comp3, comp4).
3. Mueve cada zip a su carpeta correspondiente y descomprime el contenido.
4. Confirma que cada carpeta contiene 20 mapas de variabilidad (fotogramas 0-19) y repite para comp1-comp4.
   NOTA: Mantén carpetas separadas para cada componente principal para evitar mezclar fotogramas entre PCs.

5. Preparar películas rápidas en UCSF Chimera (Opcional) ¹⁷

1. Abre la herramienta Serie de Volmenes: Lanza Chimera y luego navega a Herramientas → Datos de Volumen → Serie de Volmenes. Se abrirá una nueva ventana de la Serie de Volúmenes .
2. Carga los mapas: Haz clic en Abrir y selecciona los 20 mapas correspondientes a un componente principal (por ejemplo, comp0).
3. Ajustar los parámetros de visualización: Abrir el Visor de Volumen, establecer el umbral de densidad adecuado y asignar un color al mapa.
   NOTA: En este ejemplo se usó azul cielo (Figura 3).
4. Movimiento de previsualización: En la ventana de la Serie de Volmómenes, configura la dirección de reproducción en Oscilar y luego haz clic en reproducir para mostrar una transición continua del fotograma 0 → 19 → 0.
5. Repite para componentes adicionales: Repite los pasos 5.2-5.4 para otros componentes principales según sea necesario.
6. Generar un archivo de película usando entrada de línea de comandos: Exportar una película abriendo la línea de comandos de Chimera y ejecutando el Archivo de Codificación Suplementaria 1.
   NOTA: La serie mrc de 20 fotogramas por componente (por ejemplo, compX_frame000-019.mrc) son las entradas para el refinamiento de variables 3D Phenix. Mantén las carpetas de componentes separadas (comp0-comp4) para evitar mezclar tramas entre PCs.

6. Generación de modelos mediante refinamiento de variabilidad en phenix

NOTA: Phenix.varref puede ejecutarse desde cualquier directorio siempre que se especifiquen los caminos completos hacia los mapas de entrada y el modelo. Sin embargo, para mayor claridad organizativa, se recomienda realizar el refinamiento en un subdirectorio dedicado para cada PC.

1. Copia el archivo final refinado del modelo de consenso en el subdirectorio correspondiente a cada PC.
2. Desde cada subdirectorio, ejecuta Phenix.varref desde la línea de comandos usando la siguiente sintaxis:
   phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.mrc resolución=4 nproc=20 models_per_map=50
3. Establece la resolución a 4.0 Å para coincidir con la resolución efectiva de los mapas 3DVA
4. Establece nproc al número de procesadores disponibles (20 en este ejemplo, pero esto puede variar según los recursos computacionales disponibles)
5. Configura models_per_map a 50 modelos (por defecto).
   NOTA: Para cada mapa, se generan 50 modelos con restricciones ajustadas a la resolución de los datos 3DVA. El modelo que mejor se ajusta a cada mapa se mantiene automáticamente. El archivo de salida resultante contiene 20 modelos refinados correspondientes a los 20 mapas de variabilidad. La salida consiste en un paquete PDB que contiene 20 modelos refinados, junto con archivos de mapas individuales.
6. No aplique afinado adicional del mapa durante el refinamiento de variabilidad. Utiliza los mapas de variabilidad generados por CryoSPARC (filtrados a 4,0 Å) directamente como entradas para phenix.varref.

7. Visualización

1. Abre el paquete PDB en ChimeraX¹⁸ para cargar los 20 modelos refinados simultáneamente.
2. Utiliza el panel de Modelos para mostrar selectivamente fotogramas individuales o modelos específicos de interés para comparación y análisis (Figura 4). Alternativamente, cada modelo refinado también puede abrirse individualmente en ChimeraX o Chimera.

8. Preparación de datos para el análisis

NOTA: Ejecutar la sintaxis anterior genera un paquete PDB que contiene modelos de 20 variables y cada mapa individual. Para la mayoría de los análisis, solo se requieren dos modelos —correspondientes al fotograma 0 y al fotograma 19—, ya que representan los dos estados conformacionales extremos a lo largo del componente principal (PC) seleccionado.

1. Abre el paquete PDB en ChimeraX, selecciona el modelo 1.1 (trama 0) y el modelo 1.20 (trama 19), y guarda cada modelo como un archivo PDB separado (Figura 4).
2. Edita los archivos PDB resultantes para aislar los residuos de interés. Esto se puede hacer manualmente o usando Phenix.pdb.tools.
3. Compara los dos archivos PDB modificados para identificar cambios conformacionales en la columna vertebral o las cadenas laterales.
4. Para comparar los dos modelos PDB, superpone las estructuras modificadas usando la función MatchMaker en Chimera.
   NOTA: Para una alineación fiable, MatchMaker suele requerir al menos entre 10 y 15 residuos superpuestos. En nuestro caso, solo se analizaron 6 residuos; sin embargo, la superposición exitosa se logró aprovechando la naturaleza homodimérica de ASNS: aunque solo quedaban 6 residuos en la cadena A, la cadena B permanecía intacta y servía como referencia para la alineación.

Results

Esta sección presenta resultados representativos generados por el análisis de variabilidad 3D (3DVA) y el flujo de trabajo de refinamiento de variabilidad, y ofrece orientación sobre su interpretación. La asparagina sintetasa humana (ASNS) se utiliza como conjunto de datos ilustrativo para demostrar resultados exitosos, artefactos comunes y análisis comparativos habilitados por el protocolo. El conjunto completo de mapas de variabilidad derivados de 3DVA y los modelos refinados correspondientes generados a partir de los ...

Discussion

Pasos críticos del protocolo y puntos de decisión
El uso efectivo de este protocolo depende de varios pasos clave en el flujo de trabajo. La calidad de la pila de partículas y la máscara utilizada para el refinamiento criogénico final es crítica, ya que el análisis de variabilidad 3D (3DVA) opera directamente sobre estas entradas en lugar de sobre un mapa postprocesado. La selección del número de componentes principales (PC) debe reflejar el tamaño del conjunto de dat...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC v4.4+	Structura Biotechnology	https://cryosparc.com	Software para procesamiento crio-EM
Phenix v1.24+	Consorcio Phenix	https://phenix-online.org	Software para el refinamiento de variabilidad
UCSF Chimera	Recursos para Biocomputación, Visualización e Informática, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	Software para Visualización Molecular
UCSF ChimeraX	Recursos para Biocomputación, Visualización e Informática, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Software para Visualización Molecular
CPPTRAJ	Suite de software de dinámica molecular AMBER	https://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/	Herramientas de Python para el cálculo de RMSF
Linux Workstation (sistema basado en GPU ensamblado internamente)
Caja de la estación de trabajo	Supermicro	https://www.supermicro.com	Caja de estación de trabajo: Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U Super Chassis
CPU	Intel	https://www.intel.com	CPU: XEON E5-2690V3 x2
Placa base	Supermicro	https://www.supermicro.com	Placa base: Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 Placa base X10DAI-O
Memoria	Crucial	https://www.crucial.com	Memoria: Crucial 64GB Kit (16GBx4) DDR4 2133 (PC4-2133) DR x4 ECC Registrado. Memoria de servidor de 288 pines CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
Disco duro	Western Digital	https://www.westerndigital.com	DISCO DURO: WD RE 4TB Disco Duro Empresarial
CONTROLADOR RAID	Lógica LSI	https://www.broadcom.com	CONTROLADOR RAID: Kit LSI Logic MegaRAID SAS 9271-8i
GPU	NVIDIA	https://www.nvidia.com	Tarjeta gráfica Quadro M6000 con 24 GB de memoria GDDR5