Caracterización de la ataxia inducida por tumores en un modelo de ratón vestibular de Schwannoma

Resumen

Desarrollamos un panel de ensayos conductuales para estudiar la ataxia inducida por tumores y evaluar terapias que preservan la función neurológica en un modelo murino de schwannoma vestibular.

Resumen

La schwannomatosis relacionada con NF2 (NF2-SWN) es un síndrome de predisposición tumoral autosómica dominante causado por mutaciones germinales en el gen supresor tumoral NF2. La enfermedad se caracteriza por el desarrollo de schwannomas vestibulares bilaterales (SV), que se agrandan progresivamente y provocan pérdida auditiva, desequilibrio y síntomas de ataxia que afectan profundamente la calidad de vida de los pacientes. Actualmente no existen tratamientos farmacológicos aprobados por la FDA. Entre los déficits neurológicos, la ataxia sigue siendo una manifestación particularmente debilitante pero poco estudiada, en gran parte debido a la falta de modelos preclínicos sólidos para su evaluación. En este estudio, desarrollamos un conjunto de ensayos conductuales para evaluar sistemáticamente la ataxia inducida por tumores en un modelo murino ortotópico de pérdida auditiva y ataxia asociadas al VS. Estas pruebas permiten medir cuantitativamente los déficits de equilibrio y coordinación motora derivados de la carga tumoral. Esta plataforma experimental permite estudios mecanicistas de la disfunción cerebelosa inducida por tumores y proporciona una herramienta valiosa para la evaluación preclínica de estrategias terapéuticas. Al integrar evaluaciones conductuales con biología tumoral y pruebas auditivas, este enfoque facilita la caracterización tanto de los efectos supresores tumorales como de los tratamientos neuroprotectores. En última instancia, estos ensayos ofrecen un marco versátil que también puede aplicarse a otros trastornos neurológicos caracterizados por ataxia, ampliando su utilidad más allá de NF2-SWN.

Introducción

La schwannomatosis relacionada con NF2 (NF2-SWN) es un síndrome de predisposición tumoral raro y hereditario dominante, causado por mutaciones en el gen supresor tumoral NF2, que codifica la proteína citoesquelética^{merlin 1}. La pérdida de la función de Merlin altera las vías de señalización que regulan la proliferación, adhesión y supervivencia celular, predisponiendo a los individuos afectados al desarrollo de múltiples tumores benignos del sistema nervioso. La característica distintiva de NF2-SWN es la formación de schwannomas vestibulares bilaterales (SVV), tumores no malignos derivados de células de Schwann que surgen a lo largo de los nervios vestibulococleares. Estos tumores se agrandan progresivamente, comprimiendo estructuras neuronales adyacentes y provocando pérdida auditiva neurosensorial, tinnitus y disfunción del nervio^{facial 2}.

Los pacientes con SVs bilaterales sufren frecuentemente daños progresivos en el nervio vestibular y el aparato vestibular del oído interno, lo que resulta en una disfunción vestibular debilitante manifestada como desequilibrio crónico, ataxia e inestabilidad de la marcha, que afectan gravemente la movilidad y la calidad^{de vida 3}. El grado de disfunción vestibular suele correlacionarse con la carga tumoral y la afectación nerviosa. Estos síntomas suelen persistir incluso después de los esfuerzos de control tumoral o preservación auditiva, lo que sugiere mecanismos neurobiológicos complejos más allá de la compresión^{mecánica 4,5}. Aunque se utilizan herramientas clínicas como inventarios de discapacidades por mareo, análisis de la marcha, pruebas de reflejo vestíbulo-ocular (VOR) y posturografía para cuantificar el deterioro vestibular, los mecanismos subyacentes de la ataxia inducida por tumores siguen siendo poco^{comprendidos 3}. A pesar de los avances en la comprensión molecular y la introducción de terapias dirigidas como el bevacizumab, aún no existe un tratamiento aprobado por la FDA que preserve de forma fiable tanto la función auditiva como la función del equilibrio en pacientes con NF2-SWN. El manejo de los síntomas vestibulares sigue siendo en gran medida de apoyo, lo que pone de manifiesto una importante necesidad clínica no cubierta.

Una barrera importante para mejorar el manejo clínico de la ataxia asociada al VS es la falta de modelos preclínicos que reproduzcan fielmente los déficits de coordinación vestibular y motora observados en los pacientes. La mayoría de los modelos animales existentes de SV se centran en el crecimiento tumoral o la pérdida auditiva, sin recapitular los alteraciones características de equilibrio y coordinación. Además, los ensayos conductuales estandarizados para evaluar objetivamente la ataxia y la disfunción vestibular en entornos preclínicos no están bien establecidos. Esta carencia dificulta la investigación mecanicista y limita la evaluación de terapias candidatas destinadas a preservar la función vestibular.

Aquí informamos del desarrollo de un modelo murino VS que exhibe fenotipos medibles de ataxia, junto con un panel de ensayos conductuales diseñados específicamente para cuantificar la ataxia inducida por tumores. Este modelo proporciona una plataforma muy necesaria para investigar los mecanismos subyacentes a la disfunción vestibular asociada al VS y para evaluar la eficacia de intervenciones terapéuticas destinadas a restaurar el equilibrio, la coordinación y la función neurológica general en pacientes con NF2-SWN.

Protocolo

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal del General Brigham de Massachusetts (MGB).

1. Modelo animal

1. Inocular células ^Nf2-/- (células murinas ^Nf2-/- que expresan el gen reportero de luciferasa Gaussia, Gluc) en ratones inmunocompetentes de C57/FVB. Utilizando un dispositivo de inyección estereotáctica (Figura 1A), inyecta a cada ratón 1 μL de 2.500 células tumorales en la región CPA del hemisferio^{derecho 4,6}.
2. Utiliza tanto ratones machos como hembras (proporción 1:1) de entre 8 y 12 semanas de edad para asegurar suficiente potencia estadística y examinar posibles diferencias relacionadas con el sexo. Ratones domésticos en grupos de 4 por jaula bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, con comida y agua disponibles ad libitum.
   NOTA: Dado que los schwannomas se desarrollan en los nervios vestibulares de los pacientes, empleamos el modelo del ángulo cerebelopontino (CPA). El modelo CPA recapitula el microambiente intracraneal de los VS.
3. Grupo simulado: Para evaluar los efectos de la cirugía animal y la implantación de células tumorales sobre la ataxia, incluye un grupo de cirugía simulada, en el que los ratones se someten a cirugía simulada e inyección de solución salina en la región de la CPA.
4. Incluye un grupo de ratones sin tumores como control.
5. Para monitorizar la progresión tumoral, utiliza células ^Nf2-/- que expresan el gen reportero de la Gaussia luciferasa (Gluc) y mide el Gluc plasmático cada 3 días tras la implantación.
6. Brevemente, recoge 13 μL de sangre en los tubos EDTA para evitar la coagulación. Transfiere la muestra de sangre a una placa de 96 pozos y mide la actividad del Gluc como se describió^{anteriormente} 6,7,8,9.

2. Pruebas de ataxia

1. Realizar los cuatro ensayos conductuales en una secuencia fija para minimizar la variabilidad entre animales. Realizar las pruebas en el siguiente orden: (1) prueba de agarre de las extremidades posteriores, (2) prueba de cornisa, (3) evaluación de la marcha y (4) evaluación de la cifosis. Permite un intervalo mínimo de reposo de 2-5 minutos entre pruebas devolviendo al ratón a su jaula de origen. Vigila al animal durante los periodos de descanso y pasa a la siguiente prueba solo cuando el comportamiento exploratorio normal se reanude. Suspenda las pruebas si se observan signos de estrés o fatiga excesiva. Completar el conjunto completo de cuatro ensayos de ataxia para una cohorte de 10 ratones en aproximadamente 45-60 minutos, incluyendo intervalos de descanso entre pruebas.
2. Prueba de pinzado de las extremidades posteriores
   NOTA: La prueba de agarre de las extremidades posteriores evalúa la coordinación neuromuscular, el tono motor y el control postural en ratones. Los ratones con ataxia presentan retracción o agarre de las extremidades posteriores hacia el abdomen, lo que refleja una coordinación motora deteriorada y una regulación del tono^{muscular 5}.
   1. Agarra al ratón suavemente por la base de la cola, asegurando un agarre seguro pero ligero para evitar molestias. Sostiene brevemente al animal en la tapa o mano de la jaula antes de levantarlo para reducir la respuesta de sobresalto.
   2. Levanta el ratón lentamente para que quede suspendido en el aire con su cuerpo completamente extendido y libre de obstáculos. Mantén al ratón al menos a 10 cm por encima de la jaula o la superficie de prueba.
   3. Mantén la posición suspendida durante aproximadamente 10 segundos y observa la posición de las extremidades traseras y la cola sin girar ni balancear el animal.
   4. Evalúa la postura de las extremidades posteriores como se describe a continuación.
      1. Identifica la postura normal cuando ambas extremidades traseras se extienden hacia afuera y alejándose del abdomen.
      2. Identificar una postura anormal cuando una o ambas extremidades se retraen hacia el abdomen o se cruzan unas sobre otras, indicando un agarre de las extremidades posteriores asociado a ataxia o deterioro neurológico.
   5. Graba el comportamiento usando un sistema de puntuación predefinido o graba un vídeo corto para un análisis a ciegas a posteriori.
      NOTA: Limita cada prueba a ≤10 s para minimizar el estrés.
3. Prueba de repisa
   NOTA: La prueba de repisa evalúa el equilibrio, la coordinación y el control motor fino en ratones. Mide la capacidad del animal para caminar por una cornisa estrecha y descender con seguridad a la jaula de la casa sin perder el equilibrio. Los ratones con disfunción cerebelosa o ataxia vestibular suelen mostrar resbalones, caídas o postura inestable durante esta^{tarea 5}.
   1. Coloca la jaula sobre una superficie estable y plana a la altura del banco (~1 m).
   2. Conecta un extremo de la jaula de prueba (Figura 1C) a la caja de alojamiento (Figura 1D), asegurando que no haya un hueco vertical ni un bloqueo entre jaulas para permitir que el ratón descienda suave y de forma natural dentro de su jaula de origen (Figura 1B) sin saltar ni caer.
   3. Coloca una cámara de vídeo en un trípode orientado hacia el saliente en un ángulo de 30°-45° para captar tanto el movimiento lateral como el descenso.
   4. Ajusta la iluminación para minimizar el deslumbramiento y asegurar una visibilidad clara de las extremidades y la cola del ratón.
   5. Levanta suavemente el ratón por la base de la cola y sujeta su cuerpo con la otra mano. Coloca el ratón en el centro de la cornisa de modo que las cuatro patas queden en la superficie. Suelta la cola solo cuando el ratón parezca equilibrado y alerta.
   6. Permite que el ratón camine libremente por el borde sin que nadie le indique nada. Graba al ratón al menos 10 segundos o hasta que descienda dentro de la jaula.
   7. Observa su capacidad para mantener el equilibrio en la cornisa sin resbalar y caminar por la repisa hacia la jaula o la plataforma.
   8. Realiza tres ensayos independientes por ratón, con un intervalo de descanso de ~2 minutos entre ensayos. Limpia la superficie del saliente entre animales usando etanol al 70% para eliminar las señales de olor.
   9. Realiza todas las pruebas en un entorno tranquilo, con iluminación constante y con mínimo ruido de fondo o vibraciones. Evita repetir el examen en exceso el mismo día, ya que la fatiga y los efectos del aprendizaje pueden influir en el rendimiento.
4. Evaluación de la zancada
   NOTA: La prueba de evaluación de la marcha evalúa la coordinación locomotora, el patrón de zancadas y la estabilidad postural en ratones que se desplazan libremente. Los ratones con ataxia suelen mostrar zancadas acortadas, movimientos inestables y colocación irregular de las patas, lo que indica déficits en coordinación y control^{del equilibrio 5}.
   1. Alinear una pista recta y plana con papel blanco (8,5 × 11 pulgadas). Coloca la jaula de la casa al final del papel para animar al ratón a caminar sobre el papel.
   2. Cubre ligeramente las patas delanteras y traseras con dos colores contrastantes (por ejemplo, azul para las patas delanteras, rojo para las traseras) usando una almohadilla de tinta no tóxica (Figura 1E).
   3. Coloca el ratón en el extremo inicial de la pista y deja que camine libremente sobre el papel sin que nadie le toque de nada.
   4. Observa y mide los siguientes parámetros:
      Longitud de zancada: la distancia entre posiciones sucesivas de la misma pata.
      Ancho de base: la distancia lateral entre las huellas traseras izquierda y derecha.
   5. Realiza dos o tres pasadas por ratón, permitiendo descanso entre pruebas.
      NOTA: Utiliza tinta no tóxica y de secado rápido y asegúrate de que solo las almohadillas estén recubiertas. Cambia el papel después de cada prueba para evitar manchas. Aplica la tinta con moderación para evitar que las huellas se difuminen, ya que un exceso de tinta reduce la precisión de las mediciones de zancada.
5. Evaluación de la cifosis
   NOTA: La evaluación de la cifosis evalúa la alineación de la columna y las anomalías posturales durante la locomoción natural. Los ratones con disfunción neurológica o muscular suelen mostrar una curvatura dorsal persistente o encorvamiento de la columna⁵.
   1. Coloca al ratón sobre una superficie y déjalo caminar o explorar libremente durante varios segundos. Evita asustar al animal, ya que los movimientos bruscos pueden alterar temporalmente la postura.
   2. Graba un vídeo corto desde la vista lateral para documentar la curvatura del tronco.
   3. Observa la postura del ratón durante la caminata, centrándote en la alineación de la columna y la curvatura del tronco como se describe a continuación.
      1. Identifica la postura normal cuando el ratón mantiene la espalda recta o ligeramente arqueada con un movimiento corporal suave.
      2. Identificar una postura anormal cuando el ratón muestra cifosis, caracterizada por una columna anormalmente encorvada o curvada, un tronco rígido y una flexibilidad reducida durante la marcha.

3. Análisis de pruebas de ataxia

NOTA: Realizar toda la puntuación conductual por parte de un observador cegado ante la asignación experimental de grupo para minimizar el sesgo del observador.

1. Puntuación en pruebas de repisa
   1. Asigna una puntuación de 3 si el ratón camina suavemente por el saliente, mantiene el equilibrio y desciende a la jaula sin resbalar.
   2. Asigna una puntuación de 2 si el ratón muestra un leve deterioro, como vacilación o un pequeño resbalón de pata, pero se recupera y desciende con seguridad.
   3. Asigna una puntuación de 1 si el ratón muestra un deterioro moderado, incluyendo resbalones frecuentes, postura agachada, uso excesivo de la cola para mantener el equilibrio o un descenso retrasado.
   4. Asigna una puntuación de 0 si el ratón muestra un deterioro severo, no puede mantener el equilibrio, cae del saliente o se niega a moverse.
2. Puntuación en la prueba de abrazamiento de las extremidades posteriores
   1. Asigna una puntuación de 3 si el ratón muestra consistentemente las extremidades traseras abiertas hacia afuera sin señales de agarre.
   2. Asigna una puntuación de 2 si el ratón muestra un deterioro leve, como una retracción intermitente de una extremidad trasera.
   3. Asigna una puntuación de 1 si el ratón presenta un deterioro moderado, caracterizado por una retracción parcial de ambas extremidades posteriores mantenidas cerca del abdomen.
   4. Asignar una puntuación de 0 si el ratón muestra un deterioro severo, con ambas extremidades traseras firmemente sujetas al abdomen durante la mayor parte del periodo de observación.
3. Puntuación de la marcha
   1. Asigna una puntuación de 3 si el ratón camina con un paso constante y coordinado y se mueve en línea recta.
   2. Asigna una puntuación de 2 si el ratón muestra un deterioro leve, como caminar despacio con leve inestabilidad o desviación lateral, cojear hacia un lado o desplazarse en caminos anchos y circulares.
   3. Asigna una puntuación de 1 si el ratón muestra un deterioro moderado, incluyendo una clara alteración de la marcha, caminar solo con dos o tres patas, arrastrar parte del cuerpo o moverse en círculos cerrados.
   4. Asignar una puntuación de 0 si el ratón muestra un deterioro severo, no puede caminar eficazmente, permanece inmóvil o muestra movimientos de rodeo incontrolados hacia un lado.
4. Puntuación por cifosis
   1. Asigna una puntuación de 3 si el ratón permanece plano y recto hacia atrás tanto durante el descanso como al caminar.
   2. Asigna una puntuación de 2 si el ratón muestra un leve deterioro, con una ligera curvatura de la espalda en reposo que se endereza durante el movimiento.
   3. Asigna una puntuación de 1 si el ratón muestra un deterioro moderado, con la espalda moderadamente encorvada en reposo que permanece curvada durante la caminata.
   4. Asigna una puntuación de 0 si el ratón muestra un deterioro severo, con la espalda muy encorvada durante todo el periodo de observación que restringe el movimiento normal.

4. Evaluación de fiabilidad entre evaluadores

1. Entrenar a los observadores usando vídeos de ejemplo representativos antes de la puntuación formal para estandarizar la interpretación de los criterios de puntuación.
2. Para minimizar el sesgo del observador, califique todas las pruebas de comportamiento de forma independiente con dos observadores entrenados que hayan cegado el grupo de tratamiento y el momento experimental.
3. Cuantifique la fiabilidad entre evaluadores para cada ensayo conductual utilizando el coeficiente kappa de Cohen. Interpreta los valores kappa de la siguiente manera: <0,40, mal acuerdo; 0,40-0,60, acuerdo moderado; 0,60-0,80, acuerdo sustancial; y >0,80, un acuerdo casi perfecto.
4. Resolver cualquier discrepancia de puntuación mediante una revisión conjunta de los vídeos grabados y alcanzar una puntuación^{consensuada de 5}.

Resultados

El crecimiento tumoral de CPA causa ataxia en el modelo murino VS

Para evaluar la ataxia inducida por tumores, establecimos dos cohortes experimentales. Primero, para evaluar los efectos de la cirugía animal y la implantación de células tumorales en la ataxia, los ratones se sometieron a una cirugía simulada e inyección de suero fisiológico en la región de CPA. Los síntomas de ataxia en ratones del grupo simulado se compararon con los de ratones control no operados. En la segu...

Discusión

Los ensayos conductuales descritos aquí proporcionan un marco sólido y cuantitativo para evaluar los déficits de ataxia y coordinación motora en modelos murinos de SV y trastornos vestibulares relacionados. Adaptadas a partir de protocolos establecidos para modelos de enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Huntington y las ataxias^{espinocerebelosas 10}, estas pruebas son muy adecuadas para caracterizar la disfunción v...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suero bovino fetal	ThermoFisher	A5670701
Luminómetro de microplacas GloMax 96	Promega	GM3000
Bajo pad de procedimiento azul McKesson	McKesson	75402
Suplemento de crecimiento celular de Schwann	ScienCell	1752