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Muestreo ambiental de ADN en buques de avistamiento de ballenas para el monitoreo de cetáceos

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DOI:

10.3791/70334

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10 de abril de 2026

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1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo estandarizado para la recogida de muestras de ADN ambiental (eADN) de cetáceos de embarcaciones de avistamiento de ballenas. Se prioriza la viabilidad para investigadores y científicos ciudadanos formados, mientras que las condiciones ambientales, el tiempo de filtración, la turbidez y la logística a bordo definen los límites prácticos de su aplicación.

Resumen

El ADN ambiental (eADN) ofrece un enfoque no invasivo para el monitoreo de cetáceos, pero su aplicación generalizada desde plataformas operativas requiere flujos de trabajo de muestreo estandarizados y viables. Este estudio describe un protocolo para la recogida de ADN electrónico de cetáceos de embarcaciones de avistamiento de ballenas, diseñado para su implementación por investigadores y científicos ciudadanos formados bajo condiciones ambientales y logísticas definidas. El enfoque integra la recogida de agua de mar dirigida a hukefootprint, filtración a bordo con filtros autopreservantes y análisis moleculares aguas abajo para apoyar la generación operativa de datos en condiciones reales. El protocolo se implementó durante campañas de campo coordinadas realizadas en 2024 en tres regiones del Atlántico Norte y el mar Mediterráneo (Islandia, Portugal e Italia), que abarcan múltiples taxones de cetáceos. El rendimiento del método fue evaluado utilizando un ensayo cuantitativo de PCR específico para especie que apuntaba al ADN mitocondrial de la ballena jorobada (Megaptera novaeangliae), demostrando tasas de detección consistentes bajo condiciones ambientales y logísticas variables. Al proporcionar orientación práctica para la implementación en campo y el control de contaminación, este protocolo apoya la monitorización de cetáceos basados en ADN electrónico reproducible y facilita la comparabilidad interregional en estudios de biodiversidad marina.

Introducción

La gestión eficaz de la conservación de la megafauna marina, incluidos cetáceos y otras especies de amplia distribución, es imprescindible para la protección de la biodiversidad. Como depredadores de élite e ingenieros de ecosistemas, los cetáceos contribuyen a la regulación trófica, el ciclo de nutrientes y la resiliencia ecológica a lo largo de las cuencasoceánicas 1. Sin embargo, generar un conocimiento ecológico integral para estas especies altamente móviles sigue siendo un reto y a menudo depende de programas de monitoreo intensivosen recursos 2. Los enfoques convencionales, como la toma de muestras por biopsia, la identificación fotográfica, la monitorización acústica pasiva, la telemetría satelital y los estudios aéreos, han proporcionado conocimientos críticos sobre la ecología de cetáceos 3,4,5,6,7, sin embargo, estos métodos suelen ser costosos, logísticamente exigentes, espacialmente limitados o invasivos, y están sujetos a una estricta supervisión ética yregulatoria8. Como resultado, la frecuencia de muestreo, la cobertura geográfica y las oportunidades de participación de los interesados suelen ser limitadas, especialmente para el estudio de especies de amplia distribución o raras.

El muestreo de ADN ambiental (eADN, definido como material genético liberado por los organismos en su entorno) ha surgido como una herramienta poderosa y no invasiva para detectar especies acuáticas a partir de muestras deagua 9,10. Los ensayos cuantitativos específicos de la especie (qPCR) dirigidos a fragmentos de ADN mitocondrial permiten una detección altamente sensible y específica de taxones marinos, incluidos loscetáceos 11, 12 y 14. Más allá de la detección de presencia/ausencia, la intensidad relativa de la señal de eDNA y las secuencias de ADN objetivo proporcionan información valiosa relacionada con la proximidad, abundancia relativa y patrones genéticos a nivelpoblacional 15,16,17,18,19. Además, las muestras ambientales recogidas cerca de ballenas contienen ADN de taxones concurrentes, incluyendo especies presas, simbiontes y parásitos, lo que respalda asociaciones ecológicas másamplias 20,21,22. En conjunto, estos avances demuestran el potencial de los enfoques basados en ADN electrónico para complementar los métodos tradicionales y ampliar el alcance de la investigación sobre cetáceos en sistemasmarinos 23,24.

A pesar de estas ventajas, el monitoreo basado en eADN de la megafauna marina enfrenta desafíos persistentes relacionados con el muestreo representativo, la cobertura espacial y la reproducibilidad metodológica, especialmente en sistemas marinos abiertos donde el ADN se diluyerápidamente 25,26 y las especies objetivo tienen rangos extensos y se encuentran a bajas densidades. Abordar estas restricciones requiere marcos de muestreo escalables y operativamente viables que puedan aplicarse a escalas espaciales y temporales amplias. Las iniciativas de ciencia ciudadana han demostrado ser efectivas para ampliar la recopilación de datos ecológicos y promover la participación pública en la conservación marina, convirtiéndolas así en una vía prometedora para el monitoreo a gran escala basado en ADNelectrónico 27,28,29,30. Los buques de avistamiento de ballenas representan una plataforma poco utilizada pero muy adecuada para el muestreo de eDNA, ofreciendo acceso regular a hábitats de cetáceos a lo largo de las estaciones y regiones 31,32,33. La industria global de la observación de ballenas apoya extensas redesoperativas 34, y estudios previos han demostrado la viabilidad de recoger ADN electrónico de cetáceos de otras plataformas oportunistas, como buques comerciales, ferris35, y mediante muestreo dirigido integrado con fotoidentificación y observaciones decomportamiento 36,37. La rápida expansión de la investigación en eADN ha conducido a una innovación metodológica sustancial, pero la variabilidad biológica entre sistemas marinos y el ritmo de los avances tecnológicos complican los esfuerzos para armonizar los protocolos y garantizar la comparabilidad entre estudios. Por tanto, las metodologías de campo estandarizadas pero adaptables son, especialmente para iniciativas multinacionales de monitorizacióna gran escala 38.

La detección de eDNA está influenciada por el volumen de agua filtrada, la estrategia de filtración, el material filtrante y el tamaño de los poros. Filtrar volúmenes mayores generalmente aumenta los rendimientos de ADN electrónico y la probabilidad de detección de blancos vertebrados, incluidoslos cetáceos 39,40,41,42. Sin embargo, en aguas productivas o turbias, la eficiencia de filtración puede verse limitada por un rápido atasco del filtro43,44, lo que requiere compromisos entre volumen alcanzable y viabilidadoperativa 45,46. El muestreo de huellas de aletas — la perturbación superficial creada por el trazo de la cola de ballena — ha demostrado de forma constante mejorar la detectabilidad del eADN de cetáceos, ya que el material biológico recientemente desprendido se concentra cerca de lasuperficie 24,41,42,47,48. El uso de sistemas de filtros cerrados y autopreservativos reduce los pasos de manipulación y los riesgos de contaminación, lo que los hace muy adecuados para aplicaciones de cienciaciudadana 38,42. Además, la inclusión de réplicas biológicas y controles rutinarios de campo minimiza fallos de detección y mejora la fiabilidad de losdatos 49,50,51.

Desarrollo y validación de protocolos
El proyectoeWHALE 52 es una iniciativa transnacional que integra a investigadores, operadores de avistamiento de ballenas y científicos ciudadanos de toda Europa para monitorizar la megafauna marina utilizando ADN electrónico. Los esfuerzos de muestreo han dirigido a múltiples taxones de cetáceos en el Atlántico Norte y el mar Mediterráneo, utilizando un protocolo central con adaptaciones específicas de región para tener en cuenta las condiciones ambientales y logísticas locales.

Aquí presentamos un protocolo estandarizado de principio a fin para la recogida de ADN electrónico de cetáceos de embarcaciones de avistamiento de ballenas, refinado mediante el análisis de 308 muestras de ADN electrónico en agua de mar, incluyendo dos réplicas por muestra y 21 controles de campo, recogidos durante campañas de campo coordinadas en 2024 en la bahía de Skjálfandi (Islandia), las Azores (Portugal) y el mar de Liguria (Italia). El método integra la recogida de agua de mar dirigida a huellas de fluke, filtración a bordo mediante filtros de ADN electrónico autopreservantes y análisis moleculares aguas abajo.

Este protocolo está diseñado para su implementación en condiciones reales de avistamiento de ballenas por investigadores formados y científicos ciudadanos, donde la filtración a bordo puede realizarse en condiciones de mar calmado o moderado sin interrumpir las actividades de avistamiento de ballenas. Su implementación requiere coordinación con las organizaciones participantes (por ejemplo, operadores de avistamiento de ballenas, organizaciones sin ánimo de lucro, instituciones de investigación) para definir estrategias de muestreo y objetivos de investigación. Aunque los parámetros centrales deben permanecer fijos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad entre estudios, pueden ser necesarios ajustes alineados con el protocolo en lugares con alta turbidez, movimiento de la embarcación o limitaciones de tiempo, espacio o personal. Estas adaptaciones incluyen el tipo de filtro, el volumen de agua filtrada alcanzable y equipos auxiliares. Deben aplicarse de forma coherente en cada campaña de muestreo y reportarse de forma transparente. Se proporcionan guías operativas detalladas y consideraciones logísticas en los pasos y la discusión del Protocolo para apoyar la calidad de los datos, la transparencia y la comparabilidad regional.

Diseño del ensayo qPCR
Para evaluar el rendimiento del protocolo, se amplificó el eADN de ballenas jorobadas (Megaptera novaeangliae), una especie migratoria bien estudiada que se encuentra regularmente en la bahía de Skjálfandi (Islandia)53 y está estacionalmente presente en lasAzores 54, a partir de muestras recogidas en el campo. Los flujos de trabajo de lisis, extracción y qPCR de ADN se optimizaron inicialmente mediante una prueba de anillo interlaboratorio que involucró a cuatro laboratorios participantes en el proyecto eWHALE, mejorando así la consistencia y aplicabilidad entrelas 14 instituciones.

Para detectar de forma fiable la presencia de ADN electrónico de ballena jorobada, se diseñó y validó un ensayo qPCR específico para MGB (ligante de ranuras menores) dirigido a la región mitocondrial ND5 siguiendo las directricesestablecidas 55 (Tabla 1). Se generaron cebadores de oligonucleótidos y una sonda utilizando software para la alineación y análisis de secuenciasde ADN 56, con el objetivo de maximizar la especificidad de la especie y la eficiencia de amplificación (Archivo Suplementario 1-Figura Suplementaria S1). La especificidad del ensayo se evaluó in vitro utilizando taxones objetivo y no objetivo (Balaenoptera acutorostrata, Delphinus delphis, Physeter macrocephalus, Homo sapiens). Las concentraciones de ADN utilizadas para generar curvas estándar qPCR se cuantificaron a partir de un estándar de ADN derivado detejido 42,57,58,59,60. Se determinó el límite de detección (LOD) del ensayo, definido como la concentración más baja que produce amplificaciones positivas en el 95% de las replicaciones de la muestra,11,61. Las detecciones de eADN de ballena jorobada se evaluaron para muestras de campo estimando la proporción de reacciones positivas y la intensidad de la señal (es decir, umbral de ciclo, valor de Ct) para cada muestra replicada en mediciones triplicadas de qPCR, para tener en cuenta la variabilidad de la amplificación y mejorar la fiabilidad de la detección 57,60,62. Las detecciones de especies se verificaron después mediante secuenciación bidireccional de Sanger y confirmación mediante análisisBLAST 63.

Los datos de qPCR se presentan como la media ± desviación estándar (SD). La significación estadística entre grupos se evaluó utilizando la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica y la prueba t de dos muestras de Welch. Las diferencias se consideraron significativas en p < 0,05. Todos los análisis se realizaron utilizando el software de análisisestadístico 64.

Protocolo

Ética y cumplimiento normativo
Todos los esfuerzos de observación de cetáceos y la posterior toma de muestras de agua deben realizarse de acuerdo con las normativas nacionales y regionales de vida silvestre. Realizar muestreos exclusivamente de embarcaciones autorizadas que operen bajo permisos válidos de observación o investigación de ballenas. Mantener distancias mínimas de aproximación desde la especie objetivo según la normativa local y evitar cualquier maniobra destinada únicamente a fines de muestreo. Las muestras de tejido de ballena utilizadas para la validación de ensayos se recogieron bajo los respectivos permisos regionales y se compartieron entre los socios del proyecto eWHALE en cumplimiento de las normativas nacionales e institucionales.

NOTA: Revise los siguientes documentos antes de cualquier actividad de muestreo y reúna el equipo necesario: Tabla de Materiales, Kit de muestreo de eDNA (Archivo Suplementario 1-Figura Suplementaria S2), materiales utilizados para recoger muestras de ADN ambiental (Figura 1) y una visión general de los pasos de muestreo y el flujo de trabajo de filtración a bordo (Figura 2).

1. Preparación del muestreo de eDNA

  1. Preparar materiales de documentación de campo, incluyendo hojas de datos de campo y protocolo de campo laminado (Archivo Suplementario 2 y Archivo Suplementario 3).
  2. Prepara guantes de repuesto, filtros de repuesto (un filtro por cada réplica de muestra), un marcador impermeable y un contenedor dedicado a residuos (Figura 1A).
    NOTA: Utilice filtros de eADN autopreservativos cerrados (poro de 1,2 μm) para minimizar los riesgos de manipulación y contaminación65,66.
  3. Preparar uno o más cubos rígidos, adecuados para el tipo de embarcación y la configuración a bordo (Archivo Suplementario 1-Figura Suplementaria S3).
    1. Marca los cubos a 10 L con un rotulador permanente. Prepara varios cubos más pequeños si manejar 10 L no es práctico.
    2. Sujeta una cuerda firmemente al cubo si el alcance por la borda es limitado.
      NOTA: Utiliza cubos con tapa para minimizar el derrame cuando el movimiento del recipiente es excesivo (Figura 1B).
    3. Preparar un contenedor secundario de eDNA para combinar volúmenes más pequeños y una caja de transporte adicional para garantizar el transporte libre de contaminaciones de los cubos si es necesario (Figura 1C).
  4. Preparar una bomba de agua peristáltica o de vacío portátil (Figura 1D). Carga completamente la bomba antes de embarcar y desconéctate de la corriente inmediatamente antes de usarla.
  5. Asignar funciones de muestreo, filtración y registro de datos antes de la salida.
    PRECAUCIÓN: Lleva guantes durante toda la manipulación de equipo y cambia de guantes entre tareas.

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Figura 1: Materiales de trabajo de campo utilizados para recoger muestras de ADN ambiental. (A) Kit de herramientas con filtros de ADN electrónico autopreservativos, contenedor de residuos, botella exprimidora con lejía doméstica diluida (1:10), guantes, hoja técnica de campo y bolígrafo impermeable; (B) ejemplos de tipos de cubos para muestreo de eADN; (C) ejemplos de contenedor adicional de eADN para transportar y filtrar grandes volúmenes y contenedor para transportar cubos a bordo; (D) ejemplos de bombas portátiles para filtración de agua. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Diagrama conceptual de muestreo de ADN ambiental a bordo de barcos de avistamiento de ballenas. La ilustración describe pasos guiados, incluyendo la recogida de muestras de agua y la filtración a bordo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Limpieza de equipos

  1. Ponte guantes desechables antes de limpiar.
  2. Prepara una solución de lejía diluyendo lejía doméstica (hipoclorito de sodio al 5-6%) 1:10 con agua purificada (~50 mL por trago).
  3. Aplica la solución salpicando uniformemente por todas las superficies en todos los cubos, tapas, recipientes y tubos de la bomba. Mantén un tiempo mínimo de contacto con lejía de 2-5 minutos en todas las superficies.
  4. Enjuaga bien con agua del grifo 3 veces (Figura 3).
  5. Seca los materiales al aire en un lugar seguro y guárdalos en un lugar seguro y limpio antes de embarcar.

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Figura 3: Pasos para limpiar el equipo. (A) Aplicar la solución de lejía doméstica diluida (1:10); (B) distribuir uniformemente usando guantes libres de ADN; (C) enjuagar bien tres veces con agua del grifo; y (D) repetir el proceso para materiales adicionales si es aplicable (por ejemplo, contenedores de eADN). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Recogida de muestras de agua

NOTA: Cumple con todas las normativas de seguridad a bordo de cada embarcación o plataforma, incluyendo el uso de chalecos salvavidas o petos de flotación cuando sea necesario.

  1. Lleva todos los materiales a bordo antes de que lleguen los pasajeros y guárdalos en un lugar designado y limpio.
  2. Coordinar el momento de muestreo y la posición de la embarcación con la tripulación.
  3. Observa los patrones de emergencia para anticipar inmersiones de ballenas (Figura 4). Ponte guantes nuevos antes de muestrar.
  4. Recoger 20 L de agua de mar lo antes posible (no más de 10 minutos en un lapso de tiempo) de la hukefootprint tras las inmersiones de la ballena, para generar dos réplicas de muestras de 10 L.
  5. Transporta el agua recogida a una estación de filtración designada a bordo, utilizando tapas o un recipiente esterilizado adicional para evitar derrames (si es necesario).
  6. Registra la identidad de la especie, las coordenadas GPS, la hora y la identificación de la réplica de la muestra en la hoja de datos.
  7. Cambia los guantes inmediatamente después de informar.

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Figura 4: Secuencia de salida a la superficie de ballena jorobada. (A) Soplo de ballena; (B) arquear la espalda y levantar la cola antes de lanzarse en picado; (C) patrón de huellas de tremata en superficie tras la inmersión de la ballena. Atribución de la imagen: Ocean Missions (A,B,C, 2024). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Filtración de ADN electrónico

  1. Abre la bolsa del filtro y maneja el filtro solo por la salida (Archivo Suplementario 1-Figura Suplementaria S4).
  2. Inserta la entrada en el snorkel y conecta el tubo de la bomba a la salida (Figura 5A,B).
  3. Sumergir el snorkel en la muestra de agua sin sumergir la carcasa del filtro (Figura 5C).
  4. Ajusta la bomba (véase la Tabla de materiales para tipos de bombas) a un caudal rápido y constante.
  5. Filtra 10 L de forma continua mientras controlas la estabilidad del flujo (comprueba si hay burbujas de aire, desgarros, desgarros o fallos de sellado).
    NOTA: Terminar la filtración a una duración máxima de 45 minutos.
  6. Invierte el filtro y pon la bomba en marcha durante 30-60 segundos para eliminar el agua residual. Confirma que no queda humedad visible en la carcasa del filtro.
  7. Apaga la bomba y desconecta la tubería.
  8. Descarta el snorkel en el contenedor de residuos, coloca el filtro en su bolsa original y etiquétalo inmediatamente.
  9. Guarda los filtros a bordo en un recipiente rígido cerrado o en una caja de refrigeración (si la temperatura ambiente > 20 °C), alejado de la luz solar directa y de las zonas de pasajeros.
  10. Cambia los guantes y repite la filtración para la segunda réplica.

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Figura 5: Pasos para configurar la instalación de filtración a bordo. (A) acoplar la entrada del filtro (parte blanca) al tubo (snorkel); (B) conectar el tubo de la bomba a la salida del filtro (parte amarilla); y (C) sumergir parte del snorkel en la muestra de agua. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

5. Controles negativos de campo e informes de datos

  1. Filtra un control negativo de campo tras cada cinco muestras de huella de fluke.
  2. Utilice agua libre de ADN objetivo inmediatamente después de regresar a la orilla y antes de limpiar el equipo.
  3. Transfiere todos los datos a la hoja de cálculo digital de muestreo de eDNA después de cada viaje (Archivo Suplementario 4).

6. Almacenamiento y envío por filtros

  1. Guarda filtros de ADN electrónico autoconservantes en un recipiente seguro y seco en una habitación sombreada y a temperatura ambiente—o en un frigorífico si la temperatura ambiente supera los 20 °C—durante no más de 3 meses antes del envío.
  2. Inspecciona visualmente las bolsas de filtro para detectar humedad antes del envío.
  3. Etiqueta y envía los filtros en contenedores aislados con bolsas de hielo al laboratorio designado.

7. Análisis de laboratorio

NOTA: Realizar todos los procedimientos de laboratorio en salas dedicadas esterilizadas con UV, con ventilación adecuada y bancos de trabajo separados para PCR, utilizando guantes y ropa protectorasin ADN 55,67,68.

  1. Lisis del ADN
    1. Etiqueta un tubo de reacción de 2 mL por filtro.
    2. Coloque el filtro en un matraz Erlenmeyer de 200 mL y deseche la tapa de goma (Figura 6A).
    3. Utilizando pinzas libres de ADN, pliega la membrana (Archivo Suplementario 1-Figura Suplementaria S5) en un triángulo y transfiere al tubo de reacción de 2 mL, con la punta orientada hacia abajo (Figura 6B-D).
    4. Añadir 380 μL de tampón TES y 20 μL de Proteinasa K (véase la Tabla de Materiales) a cada tubo de reacción, resultando en 400 μL de tampón de lisis (Figura 6E).
    5. El vórtice se evapora brevemente y se incuba a 56 °C durante ≥3 horas con agitación (Figura 6F).
    6. Centrifugar tubos a 18.626 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
      NOTA: Un lisado claro a ligeramente coloreado indica una digestión exitosa.
      NOTA: El protocolo puede detenerse temporalmente en esta fase si los lisados se almacenan a -20 °C.
  2. Extracción de ADN
    1. Incubar los lisados a 56 °C durante 10 minutos antes de la extracción.
    2. Reactivos de extracción de pipetas en placas de lavado y placas de elución, teniendo en cuenta los controles negativos y errores depipeteo 69 (véase Archivo Suplementario 1-Tabla Suplementaria S1).
    3. Incluye un blank de extracción por placa usando el buffer TES.
    4. Transfiere 300 μL de lisato a cada pozo de la placa de unión. Añadir 300 μL de AL tampón y 300 μL de alcohol isopropílico a cada pozo. Utiliza varias placas de unión si el volumen total de lisado supera los 300 μL de vórtice y añade 30 μL de partículas magnéticas para la unión de ácidos nucleicos por pozo a la primera placa de unión (Tabla de materiales).
    5. Cubre la placa de unión con una tapa para varillas.
    6. Ejecuta el programa preliminar de captación de ADN para dos placas de unión (un total de 400 μL de lisato; véase la Tabla de Materiales y la Figura 7) y el protocolo de extracción automatizado en un robot de laboratorio basado en perlas magnéticas.
    7. Eliminar los productos químicos de extracción en contenedores de residuos designados.
    8. Transfiere el ADN eluído a tubos de reacción marcados de 1,5 mL y almacene a −20 °C.
      NOTA: El protocolo puede detenerse temporalmente en esta fase. En este punto pueden realizarse pasos adicionales para eliminar inhibidores.
  3. qPCR
    1. Preparar y cuantificar los estándares de ADN de especies objetivo utilizando extractos de tejido y un ensayo de dsDNA de alta sensibilidad basado en fluorescencia, según las instrucciones del fabricante (Tabla de Materiales). Genera una curva estándar de ocho puntos por dilución serial (1:10) comenzando en 10 ng/μL11,55. Normas alicuotas anteriores a la qPCR para minimizar los ciclos de congelación y descongelación.
      NOTA: El protocolo puede detenerse temporalmente en esta fase.
    2. Prepara todas las reacciones qPCR en triplicado usando placas de 96 pozos.
    3. Incluye un control sin plantilla (agua de grado molecular) y un blank de extracción por placa qPCR.
    4. Prepara la mezcla maestra según el Archivo Suplementario 1-Tabla Suplementaria S2 y la Figura 8A.
    5. En una campana de carga de ADN, añade los estándares de ADN previamente preparados y 3 μL de extracto de ADN a cada pozo que contenga la mezcla maestra (Figura 8B).
    6. Sella la placa con una película de sellado (Figura 8C).
    7. Centrifugar a 3.500 × g durante 10 s y cargarlo en el termociclador cuantitativo de PCR en tiempo real (Figura 8D,E).
    8. Ejecutar el ensayo en condiciones de ciclo optimizadas, especificadas en la Tabla 2, y registrar los datos usando el software del fabricante (Tabla de Materiales)11.

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Figura 6: Flujo de trabajo para la lisis del ADN. (A) Retirar la tapa de goma del filtro de eADN autopreservante y colócalo en un matraz Erlenmeyer; (B) esterilizar dos pares de pinzas llamando tres veces; (C) pliegar la membrana filtrante; (D) insertarlo en un tubo de 2 mL; (E) añadir tampón de lisis y Proteinasa K, y (F) incubar muestras a 56 °C durante 3 horas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 7: Materiales y equipos utilizados para la extracción de ADN. (A) Unir, lavar y eluir placas, consumibles y reactivos para la preparación de extracción; y (B) el robot de laboratorio basado en perlas magnéticas utilizado para el procesamiento de muestras. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 8: Flujo de trabajo para qPCR. (A) Preparar mezcla maestra en una sala previamente esterilizada por UV (bajo una campana de trabajo dedicada a preparar mezclas maestras); (B) cargar estándares, extractos y controles de ADN en una estación de carga de ADN siguiendo el patrón mostrado; (C) placa de sellado; (D) centrifugadora; (E) carga en el termociclador cuantitativo de PCR en tiempo real. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Resultados

En 2024 se recogieron un total de 154 muestras de hukeprint (308 filtros de eADN) utilizando este protocolo optimizado, incluyendo 96 filtros en la bahía de Skálfandi (Islandia; 9 controles de campo y 76 réplicas de ballena jorobada) obtenidos entre marzo y noviembre, 151 filtros en las Azores (Portugal; 12 controles de campo y 15 réplicas de ballena jorobada) obtenidos en julio y 61 filtros en el mar de Liguria (Italia; 4 controles de campo) obtenidos de mayo a octubre. Todas las muestras implicaron la recogida de hasta 10 L de agua de mar (dos réplicas por muestra de hukeprint) utilizando filtros de ADN electrónico autopreservativos (Tabla 3). Durante el trabajo de campo se recogieron dos tipos de controles negativos: agua purificada filtrada tras limpiar con lejía del equipo, y agua de mar recogida al reentrar en el(los) puerto(s)42. Este último fue filtrado intencionadamente antes de la limpieza con lejía para evaluar la posible contaminación cruzada con ADN electrónico de cetáceos durante la muestreo. Las muestras se enviaban desde cada lugar de muestreo en dos lotes a la Unidad de Investigación en Ecología Animal Aplicada, Departamento de Zoología, Universidad de Innsbruck (Austria) para su procesamiento en laboratorio.

Rendimiento del ensayo y control
Se analizó un subconjunto de 44 filtros (30 réplicas, incluyendo 2 controles de campo de la bahía de Skjálfandi, Islandia, y 14 filtros, incluyendo 1 control de campo de las aguas que rodean la isla de Faial y Pico, Azores, Portugal) para detectar ADN electrónico de ballena jorobada (Figura 9). La señal se midió en triplicadas reacciones qPCR. Una muestra (es decir, un filtro de eADN) se consideraba positiva si una de cada tres qPCR se replicaba amplificada. El límite de detección (LOD) del ensayo en este estudio se calculó como 0,0001 ng/μL (Ct medio de LOD = 35,8). En los 41 filtros analizados, 20 (49%) produjeron amplificaciones, mientras que 24 (58%) no mostraron amplificación. Las no detecciones (sin valor de CT) probablemente reflejan la ausencia o concentraciones extremadamente bajas de ADN objetivo. Las no detecciones comprendieron 5 de los 13 filtros de las Azores (38%) y 19 de los 28 filtros de Islandia (68%). Los fragmentos de extracción se examinaron para ADN de vertebrados marinos utilizando el ensayoMarVer3 70 y no mostraron amplificación detectable, lo que indicó que no hubo contaminación cruzada durante la extracción de ADN. Los controles de campo (NC) y los controles qPCR (NT) no arrojaron amplificaciones, lo que confirmó la ausencia de contaminación durante el trabajo de campo y el cribado qPCR (Tabla 4).

Entre los 20 filtros positivos, nueve (22%) proporcionaron al menos un valor de Ct por debajo del límite de detección (LOD; 0,0001 ng/μL) del ensayo y, por tanto, se clasificaron como detecciones fiables. Estos incluían 4 de 8 filtros de las Azores (50%) y 5 de 12 de Islandia (42%). Otros 11 filtros (27%) produjeron uno o más valores de Ct por encima del LOD, comprendiendo 4 filtros de las Azores (50%) y 7 de Islandia (58%), indicando detecciones plausibles (Figura 10). El análisis comparativo reveló un umbral medio del ciclo (Ct) ligeramente inferior para los filtros de Azores (34,7 ± 3,60; n = 8) en comparación con los filtros de Islandia (36,9 ± 3,60; n = 10). La prueba U de Mann-Whitney demostró que esta diferencia no era estadísticamente significativa (U = 199,0, p = 0,204). Dada la relación inversa entre el valor de Ct y la intensidad de la señal de ADN, los resultados indican concentraciones ligeramente mayores de eADN de ballena jorobada objetivo en los filtros de las Azores (Figura 11).

Restricciones de viabilidad
El número de muestras de huellas de aletas por viaje varió según la duración del viaje y las condiciones meteorológicas. Se recogieron aproximadamente dos o tres muestras (que dieron hasta seis filtros de ADNe) durante las giras de 3 horas en las Azores, de dos a cuatro muestras durante ~8 horas en Italia (con hasta ocho filtros) y de una a dos muestras (con hasta 4 filtros) durante los viajes de 3,2 horas en Islandia. El rendimiento de filtración fue generalmente alto en las Azores e Italia. En las Azores, se filtraron consistentemente 10 L de agua de mar en 10-15 minutos, mientras que en Italia, el mismo volumen se filtró en aproximadamente 10 minutos. En Islandia, los volúmenes filtrados oscilaron entre 4,5 y 10 L (media = 8,5 L), con un tiempo medio de filtración de ~40 min debido a frecuentes obstrucciones del filtro, probablemente por partículas en el agua en la zona de estudio. Específicamente, se filtraron con éxito 10 L para 46 de los 98 filtros (47%), se obtuvieron volúmenes entre 7 L y 10 L para 31 filtros (32%) y volúmenes entre 4 L y 7 L para 21 filtros (21%) (Archivo Suplementario 1-Tabla Suplementaria S3).

El protocolo recomienda la filtración de un control negativo de campo tras cada cinco muestras de huellas de fluke. Sin embargo, en condiciones operativas de avistamiento de ballenas, esto no pudo cumplirse completamente en el estudio de caso descrito debido a limitaciones logísticas, incluyendo la disponibilidad limitada de filtros, limitaciones de tiempo y retrasos en el envío. Esto redujo las proporciones control-muestra alcanzables a 1:10,7 en Islandia (9/96), 1:12,6 en las Azores (12/151) y 1:15,3 en Italia (4/61). A pesar de estas desviaciones, ningún control negativo de campo o laboratorio mostró amplificación.

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Figura 9: Visión general de las ubicaciones de muestras. Los puntos negros en el mapa representan lugares donde se tomaron muestras de una hukemark de ballena jorobada en la bahía de Skjálfandi (Islandia) y en las Azores. El nombre del filtro de eADN se indica cerca de la región de muestreo correspondiente. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 10: Detecciones de un subconjunto de filtros de eADN de las Azores e Islandia. valores medios de qPCR y la intensidad de la señal de ADN para detecciones positivas en Azores e Islandia (al menos una replicada positiva por PCR), con SD y LOD. Las barras están coloreadas por la intensidad de la señal relativa al LOD: azul oscuro = señal fuerte (Ct ≤ 35,8) indica detecciones fiables, azul claro = señal débil (Ct > 35,8) indica detecciones plausibles. Las barras de error SD representan la variabilidad entre réplicas de PCR. La línea discontinua roja indica el LOD (Ct = 35,8). Los valores medios de Ct se muestran por encima de cada barra. Abreviaturas: Ct = umbral de ciclo; DE = desviación estándar; LOD = límite de detección. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-3
Figura 11: Valores medios del umbral del ciclo para la detección de ADN de ballenas jorobadas en las Azores e Islandia. Las líneas negras dentro de los diagramas de caja indican la mediana, y los cuadrados rojos representan los valores medios de Ct (SD), mientras que los bigotes representan los valores mínimos y máximos para las Azores e Islandia. La prueba U de Mann-Whitney demostró que esta diferencia no era estadísticamente significativa (U = 199,0, p = 0,204). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1: Secuencias de cebador y sonda para el ensayo qPCR dirigido a ND5. Estas secuencias incluyen cebadores directos y inversos, secuencias de sonda MGB (5′-3′), temperatura óptima de recocido y límite de detección (LOD) del ensayo. (*) LOD se define como la concentración más baja de ADN (ng/μL) del ADN de la especie objetivo, en la que el ≥95% de la replicación por PCR produjo amplificación positiva. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Condiciones de ciclo optimizadas para el ensayo qPCR de eDNA de ballena jorobada. Estos ajustes optimizados de qPCR son 95°C durante 10 minutos (activación enzimática), luego 40 ciclos a 95°C durante 15 s (desnaturalización) y 60°C durante 90 s (recocido/extensión). Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Resumen de la configuración de muestreo en campo. Visión general de las regiones de muestreo, socios de campo, tipos de embarcaciones, especies objetivo, periodos de muestreo y réplicas de muestras en las Azores, Islandia e Italia. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: resumen de la detección qPCR para muestras y controles ambientales. Se muestran detecciones positivas (resaltadas en amarillo), valores de replicación de qPCR y resultados de detección; Las muestras se clasificaron como positivas cuando al menos una de las réplicas de qPCR mostró amplificación. "No Ct" indica que no hay amplificación, los controles negativos no mostraron amplificación, y la serie de dilución estándar de M. novaeangliae se utiliza para definir el rendimiento del ensayo y el LOD se incluye al final de la tabla. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo suplementario 1: Contiene figuras y tablas suplementarias, que proporcionan información adicional sobre la aplicación del protocolo, incluyendo kit de muestreo de eDNA para diseño de cebadores , tipos de embarcaciones para avistamiento de ballenas, características del filtro de eADN autopreservativo, volúmenes de reactivos para la extracción de ADN y reacciones qPCR, y variaciones en las tasas de filtración entre regiones de muestreo. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Hoja de datos de campo utilizada durante el muestreo de eDNA de cetáceos. Formulario estandarizado para registrar metadatos de cruceros, observaciones de cetáceos e información de muestras y filtros. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: Protocolo de campo paso a paso para la toma de muestras de ADN electrónico de cetáceos a bordo de buques de avistamiento de ballenas, incluyendo limpieza de equipos, recogida de agua de mar y filtración a bordo, reporte de muestras y almacenamiento. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 4: Plantilla de hoja de cálculo de muestreo de ADN electrónico de cetáceos. Formulario estandarizado para registrar información de muestreo tras la recogida y filtración a bordo. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Viabilidad operativa e implementación en el campo
El protocolo presentado aquí contribuye con un flujo de trabajo estandarizado de ADN que equilibra la sensibilidad de detección con restricciones del mundo real. Al integrar muestreo de gran volumen dirigido a huellas flukeprint, filtración a bordo mediante filtros cerrados autopreservantes y medidas estandarizadas de control de contaminación, el protocolo proporciona un marco reproducible que puede aplicarse a través de regiones y campañas de muestreo. Este enfoque se alinea con el creciente reconocimiento del eADN como complemento rentable y escalable frente a las técnicas convencionales de monitorizaciónmarina 9,10,22.

Estudios previos de eADN en cetáceos se han basado en gran medida en muestreos de agua de mar basados en transectos de grandes buques de investigación o en muestreos oportunistas de pequeño volumen cerca de avistamientos de cetáceos. Los enfoques basados en transectos permiten una amplia cobertura espacial, pero a menudo capturan señales de ADN diluidas y desacopladas temporalmente, limitando la detección de especies raras otransitorias 71, incluso cuando el muestreo ocurre cerca de la superficie, y normalmente requiere vasos e infraestructurasespecializadas 25,37,72. Por el contrario, el muestreo en pequeños volúmenes cerca de ballenas en superficie mejora la especificidad del encuentro, pero sigue siendo propenso a falsos negativos debido a volúmenes limitados de agua y prácticas de filtracióninconsistentes 72,73. Al dirigirse explícitamente a las huellas de aletas y filtrar grandes volúmenes a bordo, el flujo de trabajo presentado aquí aumenta la probabilidad de capturar eADN de cetáceos de baja concentración, manteniendo la posibilidad de ser factible bajo las limitaciones de tiempo y espacio típicas de las operaciones de avistamiento de ballenas. El uso de filtros cerrados y autopreservativos minimiza aún más los riesgos de manipulación y contaminación, eliminando la necesidad de amortiguadores de preservación aplicados en el campo y simplificando la logística bajo condiciones restringidas a bordo42,66.

Para garantizar la comparabilidad entre estudios, los siguientes parámetros deben permanecer fijos dentro de una campaña de muestreo: recogida de agua de mar directamente de hukefootprints visibles de cetáceos; dos réplicas biológicas de 10 L por hukeprint; el uso de filtros de ADN electrónico autopreservativos es fundamental para la filtración a bordo durante las medidas estandarizadas de control de contaminación, incluyendo controles negativos regulares en campo a una frecuencia mínima definida; y cribado qPCR específico por especie realizado en triplicado con controles apropiados. Otros parámetros pueden variar sin comprometer el marco metodológico, siempre que se apliquen de forma coherente y transparente y informada, incluyendo el equipo y manipulación de agua, el tamaño del poro del filtro, el tipo de bomba y la configuración de la tubería, la duración de la filtración y el volumen filtrado alcanzable bajo condiciones de obstrucción, la logística de la muestra a bordo y las condiciones de almacenamiento a corto plazo antes del envío. Como muchos pasos de procesamiento en los estudios de eDNA siguen siendo variables, se recomienda encarecidamente un informe riguroso de todos los pasos de muestreo y analíticos.

La viabilidad de este protocolo es mayor en estados de mar calmado a moderado (≤ Beaufort 3), con turbidez baja a moderada, cuando el tiempo y espacio a bordo permiten el procesamiento de dos filtros de ADN electrónico por hukeprint y un volumen de agua filtrado de 10 L por filtro. En la práctica, científicos formados pueden muestrear hasta Beaufort 3, pero los científicos ciudadanos solo deberían trabajar en condiciones tranquilas (Beaufort 1-2), debido al movimiento y turbulencia de las embarcaciones, a pesar de que a veces se realizan excursiones de observación de ballenas en Beaufort 3. La filtración debe comenzar lo antes posible tras la recogida de agua para minimizar la degradación delADN 47,74. Las estrategias de muestreo que minimizan la dilución inducida por la hélice del eADN superficial, como el muestreo desde los lados de sotavento e inferiores de la embarcación, apoyan aún más la precisión del puntado y la detección fiable47. Evitar maniobras inversas y evitar que las cuerdas (sujetas a cubos) entren en contacto con las muestras de agua de mar reduce aún más el riesgo de contaminación, conforme a las mejores prácticas de eADNacuático 38. Dependiendo de la configuración y logística del buque (por ejemplo, altura, movimiento y espacio disponible a bordo), se apoyan dos estrategias de muestreo si se aplican de forma consistente: (i) recogida y filtración independiente de dos réplicas de 10 L usando dos cubos separados, o (ii) recogida de una sola muestra de agua de 20 L transferida a un contenedor estéril sellado para su transporte seguro a bordo y posteriormente dividida en dos réplicas de 10 L para filtración. Un volumen de filtración de 10 L por filtro representa un compromiso práctico entre la probabilidad de detección y el esfuerzo de filtración bajo condiciones de observación de ballenas.

Volúmenes mayores aumentan la probabilidad de capturar eADN raro o de baja concentración, y reducen los falsos negativos comunes en estudios concetáceos 39,40,75, manteniendo la viabilidad operativa cuando se combinan con filtros autopreservativos y poros de grandes tamaños 42. Cargas de partículas elevadas, movimiento del buque, espacio limitado en cubierta o limitaciones de tiempo pueden reducir la eficiencia de filtración y los volúmenes alcanzables, limitando así la aplicabilidad del protocolo. En tales casos, pueden ser necesarias adaptaciones alineadas con protocolos, como la reducción de volúmenes de agua o tamaños alternativos de poros de filtro, que deben aplicarse de forma consistente dentro de campañas de muestreo para mantener la comparabilidad de datos. La duración del viaje, el momento de los encuentros con ballenas y la capacidad de filtración determinan los números de muestra alcanzables. En las excursiones estándar de avistamiento de ballenas de 3 horas, normalmente se pueden completar una o dos muestras de huellas de tremato (ocasionalmente tres) sin interrumpir las operaciones ni la experiencia de ciencia ciudadana. Durante expediciones más largas, la capacidad de muestreo escala con el esfuerzo diario de avistamiento de ballenas (por ejemplo, ~8 h/día en nuestro estudio de caso en Italia). En la práctica, el muestreo de eDNA podría implementarse en los tres lugares durante el pico de actividad turística.

Éxito de la amplificación de eDNA y control de contaminación
Las muestras ambientales, especialmente aquellas recogidas en aguas ricas en nutrientes, pueden contener inhibidores de PCR capaces de suprimir la amplificación y generar falsosnegativos 76. Aunque no se detectó inhibición en análisis previos de muestras islandesas dentro del mismo proyecto42, la inclusión de un paso de eliminación de inhibidores aseguró un éxito consistente en la amplificación (véase Tabla de Materiales) y se alinea con las recomendaciones de mejores prácticas para los flujos de trabajo de eADNacuático 14,55.

El rendimiento consistente de detección de qPCR en diferentes regiones indica que el protocolo captura de forma fiable el ADN electrónico de cetáceos bajo diversas condiciones ambientales. Las variaciones menores de Ct probablemente reflejan diferencias regionales en temperatura, turbidez y productividad, que influyen en la liberación, degradación y dispersión deleADN 75,76. El límite de detección del ensayo (0,0001 ng/μL) se encuentra dentro del rango de sensibilidad reportado para otros ensayos validados sobre cetáceos desarrollados en el proyectoeWHALE 14,11,42. Las tasas de detección fueron consistentes con investigaciones previamente publicadas basadas en huellas de fluke, subrayando la influencia del comportamiento de la especie y la frecuencia de aparición en el éxito de la detección 41,42,47. Se utilizaron estándares de ADN de origen tisular para la cuantificación de qPCR, reflejando una práctica común en la investigación de eADNmarino 57,72,77,78,79. Aunque este enfoque puede introducir varianza en la cuantificaciónabsoluta 11,61,80,81,82,83, especialmente para muestras ambientales de baja concentración yheterogéneas 84,85, refleja la complejidad muestralreal 55,86. El uso de estándares sintéticos puede mejorar la reproducibilidad cuantitativa y la comparabilidad entre estudios, y se recomienda para aplicacionesfuturas 11,87.

Las posibles fuentes de contaminación incluyen la transferencia cruzada de muestras, así como la introducción de ADN ambiental humano o no objetivo durante los pasos de manipulación, lo que puede conducir a detecciones de falsospositivos. Un control estricto de la contaminación es esencial durante todo el procesamiento de campo y laboratorio, especialmente bajo las condiciones restrictivas típicas de las operaciones de ciencia ciudadana. Los cambios rutinarios de guantes, el uso de equipos libres de ADN, sistemas de filtración cerrados, formación estandarizada, la inclusión rutinaria de controles de campo y laboratorio, la documentación de posibles eventos de contaminación y la validación de ensayos siguiendo marcos establecidos son fundamentales para garantizar la fiabilidad de los datos y la detecciónde especies 11,31,49,51,55,89. Aunque el uso de plástico es una limitación inevitable del muestreo molecular basado en campo, el consumo se minimizó cuando fue posible, y se emplearon materiales de filtración parcialmentebiodegradables 66.

Limitaciones, escalabilidad e implicaciones futuras
El atasco del filtro sigue siendo una limitación clave en entornos turbios o productivos como la bahía de Skjálfandi (Islandia), donde la materia orgánica suspendida y la densidad de plancton probablemente redujeron la eficiencia defiltración 43,90. Registrar la duración de la filtración, los indicadores de obstrucción del filtro como la reducción del caudal, burbujas visibles en el filtro o la tensión de la bomba, y limitar el tiempo de filtración a aproximadamente 45 minutos por réplica favorecen la interpretación y comparación aguas abajo. El uso de un dispositivo flotante esterilizado para suspender el filtro o bolsas de filtración alimentadas por gravedad puede reducir potencialmente el tiempo de manipulación durante la filtración, aunque este último puede ser incompatible con filtros de ADN electrónico autopreservativos y grandes volúmenes (≥1 L)91. Filtros de mayor tamaño de poros (≥ 5 μm) pueden mejorar aún más las tasas de filtración, aunque la eficiencia de detección específica de taxones debe evaluarse durante el muestreo piloto para el eDNA decetáceos 45,92.

Las consideraciones clave antes del muestreo a gran escala incluyen: priorizar la filtración a bordo frente al procesamiento retardado, mantener volúmenes de agua y configuración de filtros consistentes, realizar muestreos piloto para optimizar la filtración en condiciones locales y alinear el esfuerzo de muestreo con la capacidad del buque y la duración del viaje. Se recomiendan herramientas digitales de introducción de datos que permitan un registro estructurado y de campo por parte de científicos ciudadanos para futurasaplicaciones 93.

La aplicación exitosa de este flujo de trabajo de principio a fin demuestra robustez bajo restricciones operativas, al tiempo que destaca las limitaciones relacionadas con el espacio, el tiempo, el clima y los riesgos de contaminación inherentes a los contextos de cienciaciudadana 10,94. A pesar de estas limitaciones, los buques de avistamiento de ballenas representan una plataforma poderosa y poco utilizada para el monitoreo de cetáceos de eADN cuando se proporciona formación y supervisiónestandarizadas 31,32,42,95. Integrar este flujo de trabajo con herramientas consolidadas de monitoreo de cetáceos, como la fotoidentificación, la acústica pasiva y el muestreo de biopsias, puede vincular las detecciones genéticas con datos de comportamiento y demográficos. Aunque este estudio se centra en la detección basada en qPCR específica de cada especie, futuras aplicaciones podrían integrar metabarcoding de ADN o análisis genéticos de poblaciones, ampliando aún más el valor ecológico y de conservación del monitoreo del eADN de cetáceos.

A medida que los enfoques basados en ADN electrónico continúan prosperando, este flujo de trabajo proporciona una base escalable para integrar la monitorización genética en los programas existentes de observación y conservación marina, especialmente en puntos críticos de cetáceos y ecosistemas sensibles.

Divulgaciones

Belén García Ovide es fundadora y directora ejecutiva de Ocean Missions, una organización sin ánimo de lucro centrada en la conservación del océano y con sede en Húsavík, al noreste de Islandia. Ocean Missions coordina la toma de muestras de embarcaciones de avistamiento de ballenas en Islandia, así como de embarcaciones de expedición ártica. También representa a North Sailing, una empresa de avisionamiento de ballenas en Húsavík, dentro del proyecto eWHALE. Estas afiliaciones no influyeron en el diseño del estudio, la recogida de datos, el análisis ni la interpretación de los resultados.

Agradecimientos

Queremos reconocer a todas las personas implicadas en el trabajo de campo y de laboratorio, a saber:

i) Aidan Mabey, Matteo Tosato, Anouk Adolph, Jeanne Laporte, Romi Neerot e Isabell Österle, que participaron en muestras recogidas en la bahía de Skjálfandi, Islandia; ii) Dania Tesei, Michael Costa, Rita Norberto, Marlene Schwandt, Rita Leitão, Ricardo Ventura, Martijn Schouten, Giada Viscontii, Katharina Leeb, Anthony Le Floch, Francisco Nunes, Renato Cardoso, Faustine Darius, Monique Schouten, Laura Biet en las Azores (Portugal); iii) Sandra Schallhart, Jana Robertson en Austria; y iv) Sabina Airoldi, Mario Gabualdi, Marina Costa, Morgana Vighi, Nino Pierantonio, Roberto Raineri para la recogida de datos en el Santuario de Pelagos (Italia).

Esta investigación fue financiada por Biodiversa+, la Asociación Europea para la Biodiversidad en el marco de la convocatoria conjunta BiodivProtect 2021-2022 para propuestas de investigación, cofinanciada por la Comisión Europea (GA nº 101052342) y con las organizaciones financiadoras: 1) El Centro Islandés de Investigación (RANNÍS), (Subvención nº 229030), 2) el Ministerio de Universidades e Investigación (MUR), a partir de la cuenta especial FIRST e IGRUE relacionada con la asociación europea Biodiversa+ Call 2021 - proyecto eWHALE, 3) el Fondo Austríaco de Ciencia (FWF) [doi: 10.55776/I6389] y el fondo de publicaciones de la Universidad de Innsbruck.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtros alternativos de eADN: SterivexTM /WaterraMerck Millipore/Waterra Pumps LimitedSVHVL10RC/NA0,45 & micro; Tamaño de poro. Exigir buffers de preservación de eADN 
AW1, AW2, búferes AEQiagen   19081, 19072, 19077Soluciones tampón utilizadas para la purificación del ADN durante la extracción
Solución de lejía (1:10)DM - Denk mit, HygienereinigerPersonalizadoDescontaminación superficial. Todos los pasos en los procesos de laboratorio
CubosTiendas de navegación, equipo de pesca, AmazonRígido. Goma o plástico duro (≥ 10 L). Uno o más, dependiendo del montaje de muestreo y la logística a bordo
Reactivo de limpieza, PCR Express & nbsp;ExoSAP-IT75001.1.EAPreparación de productos PCR para la secuenciación Sanger
Caja de refrigeraciónViviendaRecipiente rígido aislante o bolsa de refrigeración
Guantes desechables, tamaños Grande (L) y Medio (M),
Sin polvo		Kimberly-Clark43431, 55090Guantes desechables de nitrilo o látex, caja de 100 unidades. Cantidad requerida: 1 caja por cada 10 - 15 viajes
Estándares de ADN (3 & mu; L) NAPersonalizadoDilución serial derivada de tejido de ADN (8 puntos, 10 ng/y micro; L) de ballena jorobada. Calibración en qPCR
Ropa de laboratorio segura para ADNFalano, PP-Overall081-2900Todos los pasos en los procesos de laboratorio.
Contenedor de eDNATiendas de viviendas o ferreteríaNATapa, duradero, transparente (≥ 10 L). 
Placa de elución, tapa de varilla, placas de lavado, placa de uniónQiagen19581, 997004, 1031656, 302570Plásticos usados para la extracción de ADN y nbsp;
Etanol (8:10)Aguanta, sonó el ISO de ACSVariosEsterilización en el banco. Todos los pasos de laboratorio
Fichas de datos de campo
Ensayo de alta sensibilidad basado en fluorescenciaThermo Fisher ScientificP32851Ensayo de alta sensibilidad de Qubit dsDNA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.)
Centrífuga de alta velocidad (24.000 rpm)Hettich Zentrifugen Separa el sobrenadante que contiene ADN de los restos. Lisis del ADN
Compresas de hieloTiendas de viviendaEnfriamiento de las muestras dentro del contenedor de transporte
Cebadores directos e inversos IPCTecnologías integradas de ADNNAProducto personalizado utilizado para la amplificación del ADN de la especie objetivo
Sondas qPCR de IPC PrimeTimeTecnologías integradas de ADNNAProducto personalizado utilizado para la amplificación del ADN de la especie objetivo
Campana de flujo laminar y nbsp;Productos de Kendro LaboratoryVFS1206Ambiente estéril para preparaciones de reactivos en la preparación qPCR
Protocolo de campo ilustrado laminado  Personalizado
Búfer de lisisQiagen79216Buffer de lisis DNeasy AL. Alternativa al buffer TES + Proteinasa K
Cuenta magnética y guion; Robot de ADN basadoCabezal PCR KingFisher Apex 965400910Software: BindIx PC 
Partículas magnéticas para la unión a ácidos nucleicos (30 & micro; L)Qiagen67563Partículas MagAttract. Facilita la unión del ADN a perlas magnéticas en la extracción de ADN
Master mix (5 y mu; L)EMM, Tecnologías Vitales4396838Mezcla Maestro Ambiental TaqMan (2.0)
Mini centrifugadora giradora de placas  LabnetC1000Centrifuga gotas líquidas y condensación de PCR y microplacas
Kit de eliminación de inhibidores de PCR OneStep-96ZYMO InvestigaciónD6035Purificación y eliminación de contaminantes en extractos de eADN 
Placas de PCRBio-RadHSP9601Hard-Shell 96-Pozo
Pipetas + puntas estériles filtradasPipettes: BIOHIT, Consejos para filtro: Biozym Safe  Consejos para sellar y sellares; ProfesionalVariosSe pueden usar pipetas manuales o electrónicas a varios volúmenes máximos
Centrifugadora de placas giratoria  NANAElimina burbujas antes de qPCR 
Proteinasa KAvantor VWRA4392.0010Digiere proteínas para ayudar a liberar ADN durante la lisis
Agua purificadaMilliQNAAgua sin RNASA, usada para controles negativos y solución de limpieza  
Tubos de reacción (2 mL)Eppendorf30120094Lisis del ADN
Termociclador cuantitativo de PCR en tiempo realAnalytikjenaNAPlataforma QTower 3G. Amplifica y cuantifica el ADN en tiempo real
CuerdasNavegación, ferreterías, puertos pesquerosNAMaterial resistente (por ejemplo, polietileno o cuerda trenzada). Longitud al menos el doble de altura de la embarcación
Película de sellado, adhesivo, ópticoBio-RadMSB1001Microsello 'B'. Sella la placa PRC antes de la PCR
Filtros de ADN electrónico autopreservativosSmith-Root 11579-251.2 & micro; Tamaño de poro. Cantidad por campaña de muestreo: según sea necesario
Contenedor de transporteLaboratorios, farmacias, AmazonVariosAislamiento de poliestireno
Software para alineación y análisis de secuencias biológicasBiografía EditVersión 7Editor y programa de análisis de alineación de secuencias biológicas fácil de usar para Windows 95/98/NT
Botella de exprimirLaboratorios, farmaciasVariosRelleno de lejía doméstica (1:10)
Software de análisis estadísticoEquipo de R Studio. (2023)Versión 4.2.1
Guantes esterilizados sin ADNSempercare  Edición79712Todos los pasos en los procesos de laboratorio.
Búfer TESProducto personalizado, equivalente al búfer de lisis DNeasy
Contenedor de residuos tóxicosEliminación segura de residuos peligrosos. Todos los pasos
Lámpara UV SterilAIREsterilización con campanas para preparación de qPCR
Mezclador vórtice Vortex-genie 2 & nbsp;Thermo Fisher Scientific50728002Homogeneiza y mezcla reactivos. Lisis de ADN, extracción
Contenedor de residuosTiendas de viviendaContenedor rígido pequeño
Bomba de agua (peristáltica/vacío)Eijkelkamp; Solinst/Smith-Root 12.34.SB; 410/12099Bombas portátiles
Marcador impermeableVarios

Referencias

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