Artículo de método

Cirugía estereotáxica en ratones infantiles y cuidados postoperatorios

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DOI:

10.3791/70335

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31 de marzo de 2026

 , 
1Neurobiology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, Research Triangle Park

En este artículo

Resumen

La capacidad de expresar vectores virales en el cerebro prepuberal es fundamental para estudiar los mecanismos celulares y de circuito para el desarrollo cerebral. Aquí describimos un protocolo para realizar cirugía viral estereotáxica en el ratón bebé en los días posnatales 11 o 12 (P11-P12) y proporcionamos directrices para el cuidado postoperatorio.

Resumen

Comprender los procesos del desarrollo, celulares y circuitos a lo largo del periodo posnatal es fundamental para esclarecer las complejidades del desarrollo cerebral y su impacto en la maduración conductual y social. La transición del lactante a la adultez implica cambios neurobiológicos significativos, incluyendo la poda sináptica y la mielinización, que son fundamentales para las capacidades cognitivas, la regulación emocional y las interacciones sociales. Estudiar el desarrollo cerebral en ratones prepubertales permite a los investigadores identificar periodos críticos que favorecen un crecimiento cerebral saludable y establecer intervenciones oportunas para los trastornos del neurodesarrollo. Para diseccionar con precisión la función cerebral, la cirugía estereotáxica ha sido una técnica clave en la investigación en neurociencia, ofreciendo una precisión sin igual para atacar regiones cerebrales de interés y permitir la administración de agentes virales. Aunque las cirugías estereotaxicas en ratones adultos se implementan ampliamente en laboratorios de neurobiología, existen directrices muy limitadas para realizar cirugías estereotaxicas en ratones prepuberales, así como cuidados postoperatorios cruciales para asegurar que el bebé pueda ser reintroducido con éxito a su madre y a sus hermanos de camada. Aquí describimos un protocolo para cirugía estereotáxica e inyección viral en ratones infantiles (P11-P12), destacando la anestesia y la administración de analgesias, consideraciones para el cuidado postoperatorio y diferencias respecto a la cirugía estereotáxica en adultos. Este protocolo puede implementarse en cualquier región cerebral de interés actualizando las coordenadas objetivo deseadas y puede modificarse para la localización cerebral en etapas posteriores del desarrollo postnatal, como durante el periodo juvenil (P15-P30). En conjunto, este protocolo proporciona un punto de entrada para el estudio del desarrollo y la función cerebral postnatal.

Introducción

La infancia y la adolescencia son periodos posnatales cruciales para el desarrollo cerebral, caracterizados por mielinización, sinaptogénesis y poda sináptica, que facilitan el refinamiento decircuitos 1,2. La aparición de comportamientos sociales, incluyendo el apareamiento, la agresión y el juego social, surge durante el periodo peripubertal (P28-40)3, y está estrictamente regulada por la circulación de hormonasesteroides 4,5. A pesar de los avances significativos en herramientas para diseccionar los fundamentos celulares de los comportamientos sociales en adultos, se sabe poco sobre los mecanismos neuronales que subyacen a la aparición de comportamientos sociales a lo largo del desarrollo postnatal. Las razones de la falta de comprensión de los circuitos sociales en desarrollo incluyen: 1) dificultades asociadas a realizar cirugías en ratones bebés, incluyendo equipos estereotaxicos no instalados para ratones jóvenes, 2) equilibrar la seguridad y la eficacia de la analgesia y la anestesia durante la cirugía6) y 3) la aceptación de los bebés por la presa tras la cirugía. Además, los métodos actuales utilizados para administrar constructos genéticos en los primeros puntos postnatales, como la electroporaciónin utero 7, la inyección viral intracerebroventricular en el cerebroneonatal ratón (P0-P10) 8, o los cruces genéticos de recombinasa driver y línearesponsiva 9, no son ideales, ya que carecen de una dirección precisa y un enfoque en la segmentación embrionaria o P0.

Aquí ofrecemos un protocolo sencillo para la cirugía estereotáxica en ratones bebés (P11-P12) y el cuidado postoperatorio para apoyar la reintegración exitosa con la madre y los hermanos de camada. Este protocolo aprovecha el protocolo estereotáxico actual para ratones adultos10 y solo requiere cambios menores en la configuración estereotaxica. También ofrecemos orientación detallada sobre el cuidado postoperatorio y sobre la anestesia y analgesia exitosas en ratones infantiles. Seleccionamos el punto temporal P11-12 para la cirugía, ya que existe un periodo de incubación de 2 semanas para la expresión viral, por lo que los ratones pueden ser analizados in vivo a partir de P24, antes del periodo peripubertal (P28-40)3. Sin embargo, este mismo protocolo puede usarse para cirugía estereotáxica en momentos posteriores. Nos centramos en la amígdala medial en desarrollo (MeA), una subdivisión de la amígdala caracterizada por su papel en un conjunto diverso de comportamientossociales 11,12. Investigamos específicamente la subpoblación de MeA que expresa Foxp2 (MeAFoxp2)13, un factor de transcripción forkhead box, ya que hemos descubierto previamente que estas células están programadas de forma única para el procesamiento in vivo de señales sensoriales masculinas en ratones machos a lo largo del desarrollopostnatal 14. Además, la subpoblación MeAFoxp2 debe modular de forma bidireccional la agresión territorial enlos machos 14. En general, el protocolo actual permite a los neurocientíficos administrar con precisión agentes virales en regiones cerebrales específicas en etapas clave del desarrollo postnatal para estudiar los fundamentos celulares y circuitales de los comportamientos sociales y afiliativos durante la adolescencia y la adultez.

Protocolo

Este procedimiento fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso Animal del NIEHS y estaba de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el uso y cuidado de animales. Durante toda la cirugía y durante la presencia de animales se utilizaron equipos de protección personal apropiados, incluyendo guantes, mascarilla, bata desechable, redecillo y fundas para zapatos.

1. Preparación y ajustes de aparatos estereotáxicos para ratones (Figura 1)

  1. Prepara el aparato estereotáxico con accesorios estereotáxicos para ratones bebés, incluyendo un par de barras para los oídos que no sean rapture, un soporte para anestesia de gas modificado y una barra para el paladar para bebés con P12.
  2. Desinfecta todas las herramientas quirúrgicas con un esterilizador de perlas de vidrio (250 °C, 30 s para herramientas pequeñas y 1 min para herramientas grandes). Coloca las herramientas estériles sobre una cortina estéril después de la esterilización. Las herramientas estériles deben permanecer en el campo estéril durante toda la cirugía.
  3. Coloque otra manta estéril sobre una almohadilla térmica a una temperatura de ~37 °C en el equipo estereotáxico para mantener al bebé a una temperatura controlada durante todo el procedimiento quirúrgico. Controla la temperatura de la almohadilla térmica durante toda la cirugía.

2. Preparación quirúrgica del ratón, colocación estereotaxica, nivelación y craneotomía

  1. Mide el peso corporal para proporcionar la dosis adecuada de analgesia.
  2. Coloque al ratón en una cámara de inducción llena de isoflurano al 3% con un caudal de oxígeno de 0,9 L/min. Comprueba que la respiración del ratón haya disminuido a ~1 respiración/s y que no haya respuesta tras probar el reflejo de retirada del pedal. Cambia el flujo de isoflurano/oxígeno al marco estereotáxico y reduce la concentración de isoflurano al 2%.
    NOTA: La anestesia adecuada debe confirmarse por la ausencia de respuestas al reflejo de retirada pedal cada 5 minutos durante la intervención quirúrgica. Observa cuidadosamente el patrón de respiración del ratón durante toda la cirugía. Ajusta la concentración de isoflurano durante toda la cirugía para que el porcentaje más bajo se utilice para mantener la anestesia profunda y evitar una sobredosis anestésica.
  3. Monta el ratón en el aparato estereotáxico modificado con accesorios estereotáxicos para ratones bebés. Coloca barras auriculares que no perforan en los laterales de la cabeza del ratón y alinea la regla de la barra para que quede equidistante para ambos lados respecto a la regla estereotáxica del armazón. Para bebés P11, ajusta la regla estereotáxica en 5 mm.
    NOTA: Los bebés en P11 normalmente no tienen los ojos abiertos aún, por lo que no se requiere lubricante para los ojos. Para P12, algunos bebés tienen los ojos abiertos. Si los ojos del bebé están abiertos, se debe aplicar pomada oftálmica y volver a aplicarse según sea necesario durante toda la cirugía.
  4. Inyecta Meloxicam de 5 mg/kg por la vía intraescapular subcutánea (e.c.) usando una jeringuilla de 1 mL con una aguja de 27 G.
  5. Diluir bupivacaína al 0,5% (5 mg/mL) con solución salina a 0,5 mg/mL (1:10) e inyectar s.c. bajo la piel de la cabeza (es decir, 0,05 mL para un bebé de 5 g).
    NOTA: Los pasos 2.6 a 3.15 deben realizarse con guantes estériles.
  6. Realiza una incisión de 1,5 cm con tijeras pequeñas a lo largo de la línea media de la cabeza.
  7. Utiliza un hisopo de algodón estéril para eliminar cuidadosamente el tejido blando de la superficie del cráneo con betadina.
  8. Coloca un capilar de vidrio estirado (~0,8 mm de longitud) en un portamicropipetas de vidrio. Monta el soporte en el brazo estereotáxico vertical.
    NOTA: Los pasos 2.9 a 3.10 deben realizarse bajo un microscopio de disección.
  9. Nivelar el ángulo anteroposterior-posterior de la superficie del cráneo:
    1. Mueva el capilar hasta el punto de confluencia rostral de los senos dorsales (RCS) (Figura 2) como se describe en Chan et al.15.
    2. Bajo un microscopio con aumento 2x, cero las coordenadas X (Medial-Lateral), Y (Antero-Posterior) y Z (Dorsal-Ventral) cuando el capilar toque ligeramente el cráneo en el punto RCS usando la consola digital del instrumento estereotáxico.
    3. Mueve el capilar hacia lambda (en Y = -7,30 mm) y baja el capilar hasta que toque ligeramente el cráneo (Figura 2).
    4. Comprueba el valor de las coordenadas Z y nivela el ángulo anteroposterior-posterior en el equipo estereotáxico para cambiar el ángulo de inclinación de la cabeza. Repite los pasos 2.9.1 a 2.9.3 hasta que la diferencia en el valor de la coordenada Z entre RCS y lambda sea <0,02 mm.
  10. Nivelar el ángulo medial-lateral de la superficie del cráneo:
    1. Mueve el capilar al punto RCS.
    2. Cero las coordenadas X (medial-lateral) e Y (antero-posterior) cuando el capilar está ligeramente en contacto con el cráneo en el punto RCS.
    3. Para nivelar la cabeza usando las coordenadas posterodorsales MeA (MeApd), mueve el capilar a X = +2,50 mm, Y = -4,20 mm y cero Z (Dorsal-Ventral) cuando el capilar toca ligeramente el cráneo.
    4. Mueve el capilar a X = -2,50 mm, Y = -4,20 mm en el otro hemisferio y baja ligeramente el capilar hasta tocar el cráneo.
    5. Comprueba el valor de Z y ajusta el eje medial-lateral en el equipo estereotaxico para cambiar el ángulo de inclinación de la cabeza. Repite los pasos 2.10.1 a 2.10.4 hasta que la diferencia en el valor Z entre los hemisferios derecho e izquierdo sea <0,03 mm.
  11. Quita el soporte capilar y monta un microtaladro con una broca #75 en un soporte estereotáxico de taladro en el brazo estereotáxico vertical.
  12. Coloca la punta de la broca sobre el punto RCS, cero las coordenadas X (Medial-Lateral) y Y (Antero-Posterior). Moverse a X = ±2,03 mm, Y = -4,20 mm para dirigirse al MeApd de los bebés P11.
  13. Perfora una craneotomía de 0,5 mm de diámetro a través del cráneo.
  14. Limpia cuidadosamente la superficie del cráneo con suero fisiológico estéril usando toallitas delicadas y hisopos de algodón.
    NOTA: Aplica solución salina estéril regularmente para mantener la superficie del cráneo hidratada.

3. Inyección viral

  1. Rellena un nuevo capilar con aceite mineral usando una aguja flexible microfil.
  2. Conecta y aprieta el capilar al inyector de nanolitros.
  3. Quita el microtaladro y monta el inyector de nanolitros en el brazo estereotáxico vertical.
  4. Retira al menos el doble de la cantidad de virus necesaria para la cirugía (aquí, 400 nL) a una tasa de 10 nL/s.
    NOTA: Cualquier virus AAV de interés puede usarse para la inyección viral tras la aprobación institucional. En este protocolo, utilizamos AAV2-DIO-mCherry (BSL-1, 2,5 E+13 vg/mL, 3 μl/tubo, almacenado a -80 °C y luego transferido a hielo para la cirugía).
  5. Mueve el capilar al punto RCS y pone en cero las coordenadas X e Y.
  6. Mueve el capilar al área cerebral de interés, aquí el MeApd (coordenadas: X = ±2,03 mm, Y = -4,20 mm, Z= -5,08 mm desde RCS).
  7. Baja el capilar hasta la superficie del cráneo y luego pone la coordenada Z a cero.
  8. Haz un camino bajando el capilar hasta la profundidad deseada y retirando el capilar fuera del cerebro.
  9. Inyecta ~8 nL de virus para asegurarte de que el capilar no está obstruido antes de volver a insertarlo en el cerebro. Si está obstruido, añade solución salina estéril al limpiaparabrisas y limpia suavemente los laterales y la parte inferior del capilar para eliminar la obstrucción.
  10. Baja el capilar una vez más hasta la profundidad deseada e inyecta la cantidad viral deseada (en este caso, 150 nL de virus) a una tasa de 20 nL/min.
  11. Cuando termines, espera 5 minutos antes de retirar lentamente el capilar.
  12. Si es necesario, repite los pasos 3.4-3.11 para inyectar el virus en el hemisferio contralateral.
  13. Retira el capilar del inyector de nanolitros. Desecha los capilares usados y tubos virales en un tubo cónico de 50 mL con lejía al 10%.
    NOTA: Los laboratorios individuales deben seguir todas las directrices de manejo de residuos, gestión de vertidos y cumplimiento de bioseguridad de su Rama Institucional de Biología y Bioseguridad.
  14. Sutura la piel con una sutura 7-0 no absorbible. Prueba a levantar el pelo al suturar para que las suturas permanezcan ocultas.
    NOTA: Normalmente, 3-4 suturas son suficientes. En nuestras manos, una sutura 7-0 funciona mejor para evitar que la madre rompa las suturas una vez que el bebé sea devuelto a la jaula de casa.
  15. Limpia la zona de sutura con peróxido de hidrógeno al 3%, seguido de solución salina con hisopos de algodón estériles.
    NOTA: La cirugía suele durar entre 1 y 2 horas, dependiendo del número de virus inyectados. Los virus suelen requerir un mínimo de 2 semanas para su expresión completa.

4. Cuidados postoperatorios

  1. Saca al bebé del marco estereotáxico y colócalo en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica. Para prevenir la deshidratación, se recomienda la inyección de solución salina estéril.
  2. Vigila al bebé hasta que esté en movimiento.
  3. Cuando el bebé pueda moverse por la jaula, coloca a la madre en una jaula nueva y limpia durante ~2 minutos.
  4. Coloca al bebé en su jaula original junto a sus hermanos de camada. Limpia cuidadosamente a todos los polluelos con material de nido y cama de su jaula y luego vuelve a colocarlos dentro del nido. Procede a colocar la presa de nuevo en la jaula.
  5. Vigila de cerca a la madre y a los bebés. Confirma que la madre regresa al nido y acicala al bebé quirúrgico pero no extrae las suturas.
  6. Si después de 1 hora la madre no acepta al bebé quirúrgico, utiliza una madre de acogida. Si una madre ya ha demostrado aceptar a los crías, úsalo para las camadas siguientes (la aceptación tras aceptar a los bebés en la primera camada ha sido del 100%).
  7. Veinticuatro horas después de la cirugía, revisa la zona de la incisión y administra Meloxicam (5 mg/kg, s.c.).
  8. Tras un cuidado postoperatorio exitoso, deja al ratón quirúrgico con la madre y sus hermanos de camada hasta que sea destetado en P21. Retira cualquier sutura visible en un plazo de 10-14 días tras la cirugía.
    NOTA: No se esperan diferencias significativas en la ingesta de alimentos, el peso corporal o el comportamiento de locomoción en los ratones quirúrgicos en comparación con los controles de camada de la camada.
    Los bebés serán monitorizados diariamente al menos 2 días después de la cirugía y luego al menos dos veces por semana. Criterios de Endpoint Humanitarios: Si el bebé no es ambulatorio tras las 2 horas de la cirugía, será sacrificado humanamente. Si el bebé muestra disminución del peso corporal y/o locomoción tras la cirugía, será sacrificado de forma humana.

Resultados

Seguridad de la combinación de isoflurano, bupivacaína y meloxicam para cirugías infantiles
La seguridad del uso de anestesia y analgesia en ratones bebés sigue siendoincierta 6. Por ello, probamos el uso de una combinación de anestesia y analgesia en ratones bebés para determinar la tasa de supervivencia. Los ratones bebés con P11 (peso corporal = 6,09 ± 0,90 g, el peso corporal más bajo fue 3,9 g; n=13) fueron colocados en la cámara de inducción para anestesia inicial con un 3% de isoflurano en 0,9 L/min de osígeno. Una vez que los bebés fueron anestesiados y no respondieron al reflejo de retirada del pedal, se transfirieron al aparato estereotáxico, y la anestesia con isoflurano se redujo al 1,5-2% de isoflurano en 0,9 L/min de oxígeno con una almohadilla térmica (41,23 ± 2,28 °C). Tras la colocación de los bebés en el aparato estereotáxico, se administró analgesia interescapular (5 mg/kg de Meloxicam) y anestesia tópica administrada por debajo de la piel de la cabeza (0,05 mg/mL de bupivacaína). Treinta minutos después, sacamos a los bebés del equipo estereotáxico y los colocamos en una jaula limpia. Observamos una tasa de supervivencia del 100% (13/13) 30 minutos después de la administración de la analgesia. Además, no observamos complicaciones a las 24 y 72 horas tras la cirugía, ni en la edad adulta. Estos resultados demuestran que combinar anestesia local con un antiinflamatorio no esteroideo es seguro para ratones bebés y reduce el dolor y la angustia.

Entrega viral precisa y precisa en el MeA
Para confirmar la precisión y exactitud de la administración viral durante las cirugías estereotaxicas infantiles, administramos AAV2-hSyn-DIO-mCherry bilateralmente en el MeApd de ratones machos Foxp2cre+/- en P11 (Figura 3A). Los ratones fueron destetados en P21. En P45, se recogieron cerebros de ratón para inmunohistoquímica y análisis de imágenes, como se describió previamente por nuestro grupo14 y otros16 (Figuras 3B,C). Los ratones fueron anestesiados y perfundidos con 30 mL de PBS al 1×, seguidos de 30 mL de PFA al 4% a 10 mL/min. Los cerebros se fijaron durante la noche a 4 °C con un 4% de PFA, crioprotegidos con un 30% de sacarosa, incrustados en O.C.T. y seccionados a 50 μm en un criostato. Cada tercera sección se procesó para inmunohistoquímica como se describióanteriormente, 14. Las secciones flotantes se bloquearon con suero de burro normal al 10%, se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche, se lavaron, se incubaron con el anticuerpo secundario durante 4 horas, se lavaron de nuevo y se montaron con un medio que contenía DAPI antes de hacer el coverslip. Las secciones cerebrales se teñieron con anticuerpos Foxp2 y Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L).

Para confirmar la eficiencia del objetivo, determinamos la coexpresión de las células mCherry+ y Foxp2+ en el MeA y observamos una superposición del 90,2% ± 2,1 entre poblaciones, lo que indica que la expresión de mCherry está restringida a las células Foxp2+ de manera dependiente de Cre (Figura 3D). Este resultado destaca la alta eficiencia de la inyección viral utilizando este protocolo. Además, investigamos la precisión de las inyecciones virales analizando el porcentaje de células de mCherry+ en la MeApd en relación con el porcentaje total de mCherry en todas las regiones. Observamos que el 93,7% ± 1,4 de las células mCherry+ estaban localizadas dentro del MeApd, lo que indica que la expresión espacial del virus está restringida a nuestra región de interés (Figura 3E).

Figura 1
Figura 1: Preparación para cirugía estereotáxica infantil. (A) Equipo estereotaxico. (B) Barras auriculares anti-rupturas. (C) Soporte para anestesia gaseosa y barra para el paladar de bebés con P12. (D) Esterilizador de cuentas. (E) Controlador de almohadilla térmica. (F) Brazo estereotáxico. (G) Inyector de nanolitros. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Puntos de referencia principales en el cráneo del ratón P11. (A) Ilustración esquemática de los principales puntos de referencia en el cráneo del bebé. (B) La cabeza del bebé está asegurada con accesorios estereotáxicos especializados que incluyen barras para los oídos que no se rompen, un soporte para cabezas de gas modificado y una barra de pellets para ratones P12. Abreviatura: RCS = confluencia rostral de los senos nasales, SSS = seno sagital superior, RRV = venas rostral-rinales, SOS = seno olfativo superior. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3
Figura 3: Expresión viral bilateral dirigida en la MeApd tras cirugía estereotáxica infantil. (A) Ilustración esquemática del MeApd (vista coronal). (B) Imagen histológica representativa de la expresión bilateral del anticuerpo Foxp2 (verde) y de las células mCherry+ (magenta) en ratones machos adultos Foxp2cre+/- (C) Vista ampliada del MeA tanto desde canales fusionados como individuales. Las flechas blancas indican anticuerpos Foxp2 y células mCherry+ co-marcadas. (D) Eficiencia de inyección. (E) Precisión de inyección. (D,E) n=3 ratones, hemisferios izquierdo y derecho/ratón. Abreviaturas: MeApd = amígdala medial posterodorsal; MeApv = amígdala medial posteroventral. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

MétodosProsContrasReferencia
Electroporación in uteroTransfección de plásmidos de mayor tamañoCarece de una selección precisa de objetivos, toxicidad, y hay que ser altamente cualificadoWang, et al., Methods Mol Biol. (2013).
Inyección viral intracerebroventricularRápido, fácil, económicoLa falta de puntería precisa y riesgo de infanticidioKim, et al., J Vis Exp. (2014).
Microinyección estereotáctica en P0Selección precisa, menor riesgo de rechazo maternoToxicidad celular debida al virus, no es ideal para estudiar los momentos postpuberalesChen, et al., J Vis Exp. (2018).
Cruce genético de líneas de recombinasaNo invasivoFalta de puntería precisa, caroRobertson et al., Nat Neurosci. (2013).

Tabla 1: Resumen de métodos previos utilizados para estudiar el desarrollo embrionario y postnatal celular y de circuitos en roedores.

Discusión

Estudiar los mecanismos neuronales que subyacen a los comportamientos sociales a lo largo del desarrollo postnatal es esencial para entender no solo su aparición, sino también cómo estos mecanismos pueden verse alterados por factores ambientales o en trastornos neurodesarrollativos. Nuestro estudio describe un protocolo detallado para la cirugía estereotáxica que introduce el virus de forma precisa y eficiente en los cerebros de ratones infantiles P11-12. Por ello, este protocolo permite la manipulación, registro y estudio de circuitos de subpoblaciones neuronales definidas molecularmente antes y después de la pubertad utilizando una estrategia viral. Destacamos las modificaciones y cuidados pre y postoperatorios, así como una combinación segura de agentes anestésicos y analgésicos bien tolerados por los ratones bebés.

Un componente clave y desafiante de la cirugía estereotáxica infantil es reintroducir con éxito al bebé en su jaula de origen junto a su madre y sus hermanos de camada. Para asegurar un cuidado adecuado al bebé al volver a la jaula, la madre debe recoger y acicalar al bebé (sin sobreacicalar), y cualquier signo de posible abandono debe ser vigilado de cerca. Debido a la incisión y suturas del bebé, la madre podría acicalar en exceso la zona de la cabeza, lo que podría provocar el desgarro y la retirada de las suturas. Esto sería perjudicial y, por tanto, es fundamental monitorizar el comportamiento de la madre hacia el bebé tras la cirugía para garantizar la supervivencia. Para aumentar la aceptación de la presa del bebé tras la cirugía, recomendamos usar peróxido de hidrógeno y suero fisiológico tras suturar para limpiar cualquier residuo de sangre residual en la piel y el pelaje, y usar suturas más finas (7-0) que las usadas en adultos (5-0). Estas dos estrategias dieron lugar a la aceptación por parte de la madre de ratones bebés tras la cirugía.

Además, nuestro estudio ofrece orientación sobre el uso seguro de la anestesia y la analgesia en cirugías infantiles. Esto es fundamental, ya que los recién nacidos y ratones bebés no resisten tan bien las dosis de analgesia y anestesia como los adultos, lo que puede provocar efectos secundarios respiratorios y cardíacosperjudiciales. Observamos que el isoflurano, un anestesia oral, y la combinación de analgesia meloxicánica y bupivacaína, administrados por vía subcutánea (intracuspular y bajo la piel de la cabeza, respectivamente), fueron bien tolerados por los bebés y resultaron en una supervivencia a largo plazo. Además, hemos demostrado previamente que el procedimiento quirúrgico estereotáxico en ratones bebés llevó a tiempos de investigación similares para conspecífos en ratones juveniles 2 semanas después de la cirugía, en comparación con controles emparejados por edades que no se sometierona cirugía 14. Por lo tanto, estos resultados indican una recuperación suficiente y sin déficits motores evidentes tras la cirugía en ratones lactantes. Cabe destacar que no medimos la oxigenación sanguínea durante toda la cirugía. Los niveles de oxígeno en sangre deben monitorizarse con un pulsioxímetro para prevenir lahipoxia 17.

Otro componente crítico de este protocolo es el uso del sistema de coordenadas estereotáxicas basado en la lambda y el RCS en la línea mediasagital 15. El RCS es un hito definido por la unión del seno sagital superior y la unión del seno olfativo superior a lo largo de la línea media sagital. Se ha demostrado que este punto de referencia presenta una variabilidad posicional consistentemente menor que otros puntos dorsales tras la alineación global de la cabeza. Esto es cierto, ya que el aumento de la distancia de separación entre RCS/lambda, en comparación con bregma/lambda, mejora la estabilidad y reproducibilidad de la angulación horizontalinteranimal 15.

Métodos previos para estudiar el desarrollo neuronal se han centrado en estrategias virales en puntos temporales embrionarios y P0, o en cruces genéticos para células de interés que mapean el destino (Tabla 1). Técnicas como la electroporación in utero y las inyecciones virales intracerebroventriculares carecen de un objetivo preciso. Realizar inyecciones virales dirigidas a P018 se resuelve este problema inyectando con precisión un constructo viral en una región de interés. Sin embargo, los constructos virales pueden volverse citotóxicos tras varias semanas, lo que conduce a la muerte celular. Por lo tanto, inyectar un constructo viral en el cerebro del recién nacido para estudios pubertales longitudinales que puedan continuar en la edad adulta podría no ser lo ideal. Por lo tanto, nuestro enfoque, en el que la inyección viral ocurre una semana y media después del nacimiento, reduce el riesgo de toxicidad celular durante la pubertad.

A pesar de las ventajas de nuestro enfoque, quedan varias consideraciones. En primer lugar, las coordenadas cerebrales usadas en ratones bebés deben modificarse respecto a las empleadas en adultos. Por ejemplo, en ratones bebés P11, usamos las siguientes coordenadas para apuntar al MeApd: X= +2,03 mm, Y= -4,20 mm, Z= -5,08 mm; mientras que las coordenadas usadas en adultos son X = +2,15 mm, Y = -5,00 mm, Z = -5,10 mm. Desafortunadamente, hay menos referencias a atlas cerebrales para ratonesprepubertales 19 que para ratones adultos (Allen Mouse Brain Atlas, mouse.brain-map.org y atlas.brain-map.org)20,21. Por lo tanto, para lograr con éxito la dirección viral correcta en otras regiones cerebrales más allá del MeA, los investigadores deberán obtener una estimación informada de las coordenadas y realizar pruebas de coordenadas. En segundo lugar, es necesario considerar el tiempo de incubación de los AAV. El tiempo óptimo de incubación para la expresión in vivo de AAV es de al menos 2-3 semanas. Teniendo en cuenta que, en nuestro protocolo, la cirugía estereotáxica se realiza en ratones bebés en P11, los investigadores solo podrán comenzar a probar ratones después de la cirugía en P25, después del periodo óptimo de incubación de AAV.

En general, este protocolo proporciona directrices detalladas para que los investigadores puedan dirigirse con alta precisión a las regiones cerebrales de interés en ratones bebés utilizando vectores virales. Este enfoque es muy ventajoso, ya que es extremadamente flexible: cualquier constructo AAV comercial o personalizado puede ser inyectado. Por ello, permite estudiar subpoblaciones celulares de interés definidas molecularmente y su circuitería anatómica, dinámica neuronal y papel celular antes y después de la pubertad durante una ventana de tiempo crítica alineada con la aparición de comportamientos sociales. Además, este enfoque es eficaz para atacar no solo la amígdala, como se muestra aquí, sino también otras estructuras subcorticales, como el hipotálamo y las regiones corticales.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Andrew Gorman, la Dra. Donna Webb y David Goulding de la Rama de Medicina Comparada (CMB) del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental (NIEHS/NIH) por valiosas discusiones sobre las mejores prácticas en anestesia y analgesia para cirugías de roedores. También agradecemos a todos los miembros del CMB en el NIEHS por su excelente cuidado con los sujetos animales y a todos los miembros del Grupo de Circuitos Neuroconductuales. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, Institutos Nacionales de Salud (NIEHS/NIH) (ZIA ES103403) (J.E.L.). Las contribuciones de los autores del NIH se consideran Obras del Gobierno de los Estados Unidos. Los hallazgos y conclusiones presentados en este documento son responsabilidad de los autores y no reflejan necesariamente las opiniones del NIH ni del Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Broca #75Ciudad de la Broca10WS75-850FL
Aguja de 27 GCovetrus60757
Peróxido de hidrógeno al 3%SwanNDC 0809-0871-43
32% de paraformaldehídoCiencias de la Microscopía Electrónica15714
AAV2-hSyn-DIO-mCherryAddgene50459-AAV2
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey (1:1000) Anti-Rabbit IgG (H+L)Investigación Inmunológica de Jackson711-545-152
Balance analíticoSartorius1102--15
BetadineFarmacia AvrioNDC 67618-155-15
BupivacaínaHospiraNDC 0409-1163-18
CriostatoLeicaCM1950
Microscopio DisecadorZeiss2149-629
Pomada para los ojosDechra VeterinaryPuralube
Medios de montaje Fluoromount con DAPIThermo Fisher Scientific00-4959-52
Anticuerpo Foxp2 (1:1000)Anticuerpos Atlas/Biología CosmoHPA000382
Ratones Foxp2cre+/-El Laboratorio Jackson30541
Soporte para la cabeza y barra para el paladar de anestesia gaseosa para cachorros P12David Kopf Instruments1934-C
Esterilizador de cuentas de vidrioFisher Scientific10-000-632
Capilar de vidrioInstrumentos de Precisión Mundial504949
Soporte para pipetas de vidrioDavid Kopf Instruments1975-1.2-A
Almohadilla térmicaKent Scientific & nbsp; CorporaciónRT-0520
IsofluranoCuidados Críticos Piramal.NDC 66794-017-10
MeloxicamSuministro Veterinario PivetalNDC 46066-937-13
Micro DrillDavid Kopf InstrumentsTaladro Modelo 1911
Aguja flexible MicrofilInstrumentos de Precisión MundialMF28G67-5
Portaobjetos de microscopioThermo Fisher Scientific12-550-15
Aceite mineralSigma-AldrichM5904-500ML
Inyector de nanolitrosInstrumentos de Precisión MundialNANOLITER2020
Sutura no absorbibleAD SurgicalS-N718SP13
Barras para los oídos no de RaptureDavid Kopf Instruments1921-A
Suero normal de burroJackson ImmunoResearch017-000-121
Complejo O.C.T.Sakura4583
Equipo estereotáxicoDavid Kopf Instruments1900
Hisopo de algodón estérilULINES-21102
Drapeado estérilDesechables del Hospital Busse696
Solución salina estérilHospiraNDC 0409-1966-02
Agua estérilHospiraNDC 0409-4887-24
SacarosaFisher ChemicalS5-500
JeringuillaFisher Scientific50-252-2568

Referencias

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