Protocolo quirúrgico para una ventana craneal grande y resellable que permite grabaciones electrofisiológicas longitudinales y multimodales de la red de modo predeterminado del ratón

Resumen

Este protocolo describe un método quirúrgico en dos fases para crear una ventana craneal grande, resellable y que salve la duramadre en ratones. Esta técnica permite registros electrofisiológicos crónicos y multimodales de redes profundas del cerebro distribuido, como la Red de Modos Predeterminados, durante varias semanas.

Resumen

La red de modos por defecto (DMN) es una red cerebral central y a gran escala implicada en una variedad de funciones cognitivas y trastornos neuropsiquiátricos, como el trastorno depresivo mayor (TDM). Estudiar la dinámica compleja de la DMN en modelos animales ofrece información invaluable sobre su función tanto en estados sanos como patológicos. Sin embargo, realizar registros electrofisiológicos estables, a largo plazo y a gran escala de los múltiples nodos profundos y distribuidos del DMN en ratones despiertos y comportándose sigue siendo un desafío significativo.

Aquí se presenta un novedoso protocolo quirúrgico bifásico para crear una ventana craneal grande (4 mm × 7,6 mm), duradera y resellable en ratones. El procedimiento está diseñado para preservar la integridad de la duramadre, lo cual es fundamental para la salud cerebral a largo plazo y la estabilidad del registro.

Esta ventana permite registros longitudinales simultáneos y repetidos de más de 1.000 electrodos combinando microelectrocorticografía a nivel superficial (μECoG) con dos sondas intracraneales de alta densidad, proporcionando un acceso sin precedentes al DMN. Esta técnica proporciona una plataforma robusta para la interrogación multimodal y a escala de la dinámica electrofisiológica a nivel de red durante varias semanas, abriendo nuevas vías para investigar los cambios neuroplásicos subyacentes a la fisiopatología de los trastornos cerebrales y para evaluar los efectos crónicos de terapias novedosas.

Introducción

La Red de Modos Predeterminados (DMN) fue identificada por primera vez en estudios de imagen cerebral humana como una constelación de regiones consistentemente suprimidas durante tareas orientadas externamente y que requieren atención¹. Ahora se considera una red fundamental a gran escala que apoya procesos cognitivos orientados a lo interno, como el pensamiento autorreferencial, la memoria autobiográfica y la planificación de eventos^{futuros 2,3}. En humanos, la DMN canónica comprende un conjunto de regiones centrales anatómicamente conectadas, incluyendo la corteza prefrontal medial (mPFC), la corteza cingulada posterior (PCC), el lóbulo parietal inferior (IPL) y la formación^{hipocampal 4}. La disfunción dentro de esta red es una característica clave de varios trastornos neuropsiquiátricos. En el trastorno depresivo mayor (TDM), el DMN comúnmente presenta hiperactividad y patrones alterados de conectividad funcional, que se cree que subyacen a los síntomas centrales del TDM, como la rumiación y la autoimagen^{negativa 5,6}.

Para estudiar los mecanismos celulares y de circuitos que impulsan la disfunción de la DMN, son indispensables modelos animales robustos. Se ha identificado de forma fiable una DMN homóloga en roedores, compuesta por regiones cerebrales comparables como la mPFC, la corteza cingulada y la corteza retroespléndica (RSP), validando así al ratón como un modelo relevante para la investigación mecanicista ^7,8. Además, se ha demostrado que el estrés crónico, un factor clave en la depresión, altera la conectividad del DMN en roedores de manera similar a la observada en pacientes con TDM^{en humanos.}

Comprender los cambios neuroplásticos que ocurren en estados patológicos o en respuesta a intervenciones terapéuticas crónicas requiere observación longitudinal de la actividad neuronal, ya que una sola sesión de grabación no puede capturar la adaptación dinámica de los circuitos neuronales a lo largo del^{tiempo 10}. La electrofisiología in vivo proporciona la resolución temporal a escala de milisegundos necesaria para estudiar las oscilaciones neuronales y la sincronía en el potencial de campo local (LFP). La LFP exhibe la suma de la señal extracelular que refleja la actividad sináptica sincronizada de las poblaciones neuronales locales, que son los sustratos fundamentales de la comunicación en^{red 11,12}. Sin embargo, realizar registros electrofisiológicos crónicos y a gran escala en ratones despiertos sigue siendo técnicamente exigente. Las ventanas craneales crónicas convencionales se desarrollaron para la imagen óptica en ratones despiertos y siguen siendo la preparación estándar para ese propósito, donde su huella típica de un hemisferio y el cobertizo transparente de vidrio son óptimos para la lectura^{prevista 13}. Sin embargo, no estaban diseñados para electrofisiología multi-sitio despierta, por lo que el área de trabajo y la interfaz óptica impiden la grabación simultánea de alta densidad desde los nodos bilaterales distribuidos de una red como el^{DMN 14}. Los implantes crónicos de electrodos, a su vez, permiten registros longitudinales pero provocan una encapsulación progresiva de cuerpo extraño y cicatrices gliales alrededor del vástago permanentemente posicionado, reduciendo la calidad de la señal con^{el tiempo 15,16}.

El procedimiento quirúrgico de dos fases descrito aquí aborda directamente estas limitaciones. Produce una gran ventana craneal resellable cerrada entre sesiones mediante una membrana pasiva de polidimetilsiloxano (PDMS), sellador de silicona y una tapa impresa en 3D que permite la inserción repetida no terminal de rejillas μECoG para registros de LFP a mesoescala junto con múltiples sondas de electrodos intracraneales de alta densidad para microescala, unidad única con resolución laminar y actividad^{LFP 17,18}. A diferencia de los enfoques crónicos previos, que dependen de matrices de electrodos implantados permanentemente que acumulan encapsulación glial de los electrodos con el tiempo o requieren craneotomías agudas terminales que impiden diseños longitudinales, la ventana descrita aquí preserva una duramadre intacta y evita el contacto permanente con cuerpos^extraños 15,16,18 . Además, en una cohorte de validación en la que la ventana craneal se reabrió tres veces (días postoperatorios 0, 21, 22) sin registro electrofisiológico, la inmunorreactividad cuantitativa de la proteína ácida fibrilaria glial (GFAP) y la molécula adaptadora ionizada de unión al calcio 1 (IBA1) no difirió significativamente de los controles no quirúrgicos, lo que sugiere baja astrogliosis y microgliosis bajo el esquema de apertura repetida utilizado aquí. El método es especialmente adecuado para registros longitudinales y multisitio de redes corticales distribuidas, incluido el DMN, combinados con el acceso laminar de alta densidad con sondas intracraneales de electrodos a estructuras profundas en ratones despiertos con la cabeza fija. Sus principales limitaciones operativas son la experiencia microquirúrgica necesaria para la extracción fiable de colgajo óseo que preserva la duramadre y su incompatibilidad con registros de libre movimiento, ya que las sondas de electrodos intracraneales de alta densidad requieren fijación de cabeza.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Junta Nacional de Experimentación con Animales en Finlandia (número de licencia: ESACI/40845/2022) y los experimentos se realizaron en cumplimiento de la directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo sobre la protección del uso animal con fines científicos, así como con las directrices nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

NOTA: Todos los procedimientos quirúrgicos se realizan dentro de una capucha quirúrgica de flujo laminar que ha sido preesterilizada mediante irradiación ultravioleta (mínimo 15 minutos) o mediante una descontaminación exhaustiva de la superficie con etanol. El gas residual isoflurano es capturado por un sistema de recogida de carbón activado montado dentro de la campana. El operador lleva una funda desechable para el cabello, una mascarilla quirúrgica, una bata de laboratorio de manga larga y guantes de examen de nitrilo no estériles de una sola capa (rociados con etanol al 80% antes de entrar en la capucha). Dentro de la campana se coloca un recipiente para desechar objetos punzantes para la disposición inmediata de cuchillas de bisturí y agujas hipodérmicas.

1. Preparación preoperatoria y anestesia

1. Usa ratones C57BL/6JRj, al menos de 10 semanas y con un peso de más de 20 g.
2. Antes de la cirugía, limpia todos los instrumentos en un baño ultrasónico caliente. Enjuaga, seca y remoja en etanol al 70% durante un mínimo de 15 minutos.
3. Alternativamente, esteriliza los instrumentos mediante un breve paso por una perla de vidrio o un esterilizador infrarrojo justo antes de su uso. No se usan cortinas estériles. Entre animales consecutivos en la misma sesión, devuelve los instrumentos al remojo con etanol durante al menos 2^{minutos 19}.
4. Pesa cada ratón individualmente en una báscula calibrada y calcula los volúmenes de fármacos preoperatorios.
5. Prepara las membranas estériles del PDMS con antelación (realizada una vez por lote, fuera del día de la cirugía aguda).
   1. Molde membranas estériles de PDMS a partir de una mezcla 10:1 de elastómero a agente de curado preparada según las instrucciones del fabricante y lámina hasta un grosor objetivo de aproximadamente 500 μm santando la mezcla sin curar entre dos placas planas de vidrio borosilicato, y luego curar a 60 °C durante al menos 2 horas.
   2. Sella las láminas curadas en bolsas de autoclave y esterilízalas mediante autoclave a vapor. En la capucha quirúrgica preesterilizada, utiliza un bisturí estéril #11 y una pequeña regla de acero inoxidable para cortar cada lámina en membranas rectangulares que coincidan con las dimensiones de la ventana craneal.
   3. Almacenar las membranas precortadas en material estéril (por ejemplo, pozos individuales de una placa de cultivo celular de 6 pozos) hasta su uso.
6. Realiza el control de calidad del hardware antes de cada sesión de grabación.
   NOTA: No se realiza una comprobación rutinaria de impedancia en la matriz μECoG: los fallos en el cable de referencia son fácilmente evidentes en las pistas en bruto, y la prueba de impedancia solo se activa cuando se sospecha un problema de hardware. Las sondas de electrodos intracraneales de alta densidad incluyen diagnósticos integrados de impedancia e integridad del cable accesibles a través de la interfaz gráfica del software de grabación; Ejecuta estos cuando la calidad de la señal esté visiblemente comprometida.

2. Fase 1: Preparación animal e implantación de la placa frontal

1. Preparación animal
   1. Anestesiar al ratón con isoflurano (inducción: 4%, mantenimiento: 1,5−2,5%, caudal de osígeno de 0,5 L/min). Confirma la profundidad de la anestesia perdiendo el reflejo de pellizco del dedo.
   2. Afeita el pelaje desde la parte superior de la cabeza, aproximadamente desde los ojos hasta el cuello.
   3. Coloque al animal sobre una almohadilla térmica controlada por realimentación equipada con un sensor interno de temperatura calibrado para mantener la temperatura corporal en 37 °C durante todo el procedimiento. Aplica pomada ocular de carbómero para evitar la sequedad corneal.
   4. Asegura el ratón en el marco estereotáctico usando barras auriculares que no se rompan. Ajustar la barra incisiva para que el cráneo quede plano, con bregma y lambda a igual altura dorsoventral (orientación plana del cráneo). Mantener la anestesia con isoflurano (1,5–2,5%) administrado a través de un cono nasal a un caudal de oxígeno de 0,5 L/min.
   5. Administrar analgésicos y antiinflamatorios preoperatorios mediante inyecciones subcutáneas (s.c.): Carprofeno (5 mg/kg), Buprenorfina (0,05 mg/kg) y Dexametasona (2 mg/kg).
   6. Desinfecta la zona afeitada con solución de povidona-yodo.
   7. Inyecta solución de lidocaína-epinefrina (s.c.) como anestésico local bajo la piel del cuero cabelludo.
2. Exposición al cráneo
   1. Haz una pequeña incisión transversal en la línea de la oreja (aproximadamente 1 cm).
   2. Amplía progresivamente la incisión extendiendo el corte lateralmente alrededor de las orejas y a lo largo de cada lado de la cabeza hacia los ojos, pero sin exceder el corte hacia los ojos. Completa la exposición haciendo un corte diagonal a cada lado hacia la línea media para que toda la superficie dorsal del cráneo quede expuesta.
3. Limpieza del cráneo
   1. Limpia meticulosamente el cráneo expuesto con acetona de laboratorio. Sumerja un hisopo de algodón estéril en acetona, elimina el exceso de disolvente (evitando que goteo sobre el tejido adyacente) y aplícala en el hueso hasta que se haya eliminado todo periosteo visible.
   2. Utiliza acetona por su capacidad de disolver residuos grasos y restos membranosos persistentes en la superficie ósea, no como desinfectante.
      NOTA: La eliminación completa del periosteo y de los residuos lipídicos de la superficie ósea es fundamental para una fuerte adherencia de la placa frontal y el cemento dental. Debido a que el implante debe soportar las tensiones mecánicas generadas por el ratón despierto, cualquier periosteo residual o película lipídica en la interfaz huesa adhesiva se convierte en un punto dominante de fallo.
   3. Utiliza una cuchilla microquirúrgica roma (circular) para eliminar cualquier fragmento perióstico y de tejido conectivo residual que el lavado de acetona no haya disuelto completamente. Mantenlo aproximadamente a 45° respecto a la superficie ósea y raspa el cráneo con golpes leves y radiales dirigidos hacia fuera desde la unión bregma–línea mediana hacia los bordes laterales del hueso expuesto.
   4. Continúa hasta que toda la superficie ósea expuesta haya sido recorrida al menos una vez y parezca uniformemente limpia y mate.
   5. Concluye con una última y breve limpieza usando acetona en un aplicador con punta de algodón.
4. Marcado del sitio de la craneotomía
   1. Coloca un marcador cutáneo quirúrgico biocompatible en el brazo estereotáctico digital.
   2. Marca un área rectangular de 4 mm × 7,6 mm en el cráneo respecto al bregma.
      1. Navega la punta del marcador hasta el bregma y reinicia las coordenadas X e Y en la lectura digital a cero.
      2. Trasladar el brazo a cada una de las cuatro esquinas de la ventana planificada, de modo que el rectángulo se extienda 2 mm lateralmente desde el bregma a ambos lados, 3 mm rostral y 4,6 mm caudalmente, y coloca un único punto en cada esquina.
5. Marque los dos sitios de inserción de la sonda intracraneal en el hemisferio derecho.
   1. Marque el sitio de la sonda rostral a 1,66 mm A/P y 1,95 mm M/L respecto al bregma.
   2. Marque el sitio de la sonda caudal a -2,2 mm A/P y 1,9 mm M/L del bregma.
      NOTA: Estos sitios se ajustan para dirigirse a regiones específicas de DMN. Los sitios de inserción pueden ajustarse a múltiples regiones diferentes con este protocolo.
   3. Desconecta el marcador del brazo estereotáctico.
   4. Sujeta un borde flexible esterilizado (por ejemplo, una tarjeta fina de plástico) contra el cráneo y conecta los cuatro puntos de las esquinas con el marcador para delimitar la futura ventana craneal como un rectángulo continuo.
6. Aumentar la superficie para mejorar la adherencia
   1. Realiza todos los pasos siguientes hasta la sección 4 bajo el microscopio binocular.
   2. Grabar un patrón cruzado sobre todas las superficies óseas expuestas fuera del área designada de la ventana usando una hoja quirúrgica #11 y producir ranuras poco profundas pero definidas, de 0,2 a 0,4 mm de profundidad para formar una cuadrícula uniforme de aproximadamente 1 mm × 1 mm cuadrados.
      NOTA: Esto aumentará la superficie efectiva y, por tanto, la adherencia mecánica del adhesivo y el cemento dental que se cubren.
   3. Crea un aplicador de pegamento fino colocando una aguja estéril de 30 G en la punta de un hisopo de algodón de cuello largo y doblando la aguja en forma de V.
   4. Dispensa cola de cianoacrilato en un pesador de plástico desechable y sumerge el aplicador en el depósito de pegamento.
   5. Deposita pegamento sobre cada superficie ósea expuesta y grabada, aplicando no más de un depósito por sitio para que la cobertura sea completa pero nunca excesiva. Deja que el pegamento seque durante 7 minutos.
7. Implantación del zócalo de referencia
   1. Seleccione un lugar de perforación sobre el cerebelo izquierdo posicionado para evitar vasos superficiales visibles.
   2. Monta el taladro dental en un portataladros en el brazo estereotáctico.
   3. Perfora el agujero piloto en ráfagas de 5–10 s usando una fresa redonda de acero a 20.000–25.000 RPM, retrayendo la broca entre ráfagas para inspeccionar el sitio bajo los prismáticos.
   4. Perfora hasta que el agujero se vuelva más translúcido, revelando un leve tono rosado y la duramadre se hace visible a través del hueso adelgazado.
   5. Deja de taladrar inmediatamente en este punto para evitar la penetración dural. Dimensiona el orificio terminado a un diámetro aproximado de 0,5 mm, solo ligeramente mayor que el diámetro exterior del vaso de referencia.
   6. Inserta el almohadilla de referencia chapada en oro en el agujero piloto, fíjalo con cola de cianoacrilato y refuerza la unión con cemento dental curable por UV. Curar el cemento dental con una lámpara de curado LED de 405 nm durante 1 minuto.
8. Implantación de la placa frontal
   1. Coloca una pequeña cantidad de cemento dental curable por UV en el vértice del hueso rostral expuesto (el punto más cercano a la nariz) para servir como soporte nivelador.
   2. Coloca la placa frontal sobre el cráneo de modo que un borde descanse sobre el andamiaje de cemento dental curado alrededor del almohadilla de referencia (paso 2.7.6), y con el borde opuesto apoyado sobre el dab fresco de cemento rostral.
   3. Alinea la placa de dirección de modo que su eje largo esté centrado en la línea media sagital y sus dos manillas de fijación se extiendan perpendicularmente (90°) al eje media. Curar el compuesto bajo la luz UV para fijar la placa frontal en su lugar.
   4. Refuerza la estructura aplicando capas sucesivas de cemento dental curable por UV de aproximadamente 1 mm de grosor depositado alrededor de la base de la placa frontal, rodeando el hueso grabado y el almohadilla de referencia, hasta que se forme un recinto continuo y sellado alrededor del perímetro de la futura ventana craneal.
   5. Curar cada incremento por separado con una pluma de curado LED de 405 nm durante 40 s a una distancia de trabajo de 1–2 cm, asegurando una polimerización completa antes de aplicar la siguiente capa. Asegúrate de que la pared de cemento terminada se extienda a ras con la superficie superior de la placa y encierra completamente el perímetro de hueso expuesto sin solaparse en la zona marcada de la ventana.
9. Permite que el ratón se recupere de la anestesia. Devuelve al ratón a su jaula durante al menos 48 horas.
10. Antes de pasar a la sección 3, verifica que el animal haya vuelto a estar dentro del 5% de su peso corporal previo a la operación y que no muestre signos de dolor en la escala de muecas^{del ratón 20}. Si alguno de estos criterios no se cumple, prorroga el periodo de recuperación hasta que se cumplan.
    NOTA: Este diseño por etapas con un intervalo de recuperación interquirúrgico es fundamental. Permite al animal recuperarse del estrés fisiológico y la inflamación iniciales antes de la craneotomía, lo que ha demostrado mejorar las tasas de éxito quirúrgico y la salud a largo plazo del implante; Aquí se utiliza un mínimo de 48 horas, y se ha demostrado que un implante craneal escalonado con un intervalo de recuperación de varios días entre la fijación de la placa capálica y la craneotomía reduce la inflamación perioperatoria y mejora la calidad de la preparación a^{largo plazo 14}.

3. Fase 2: Creación crónica de ventanas craneales

1. Preparación preoperatoria
   1. Prepare la zona quirúrgica y los instrumentos según lo descrito en la sección 1.
   2. Reanestesiar al ratón con isoflurano (inducción 4%, mantenimiento 1,5–2,5%)
   3. Coloca el ratón en el marco estereotáctico como se describe en el paso 2.1.4.
   4. Administrar los fármacos preoperatorios a las mismas dosis descritas en el paso 2.1, aparte del anestésico local lidocaína-epinefrina (la piel del cuero cabelludo ya ha sido retirada en la Fase A, por lo que ya no es aplicable).
2. Perforando la ventana
   1. Comienza a adelgazar el hueso con un taladro dental a lo largo del contorno rectangular marcado en la Fase 1 (paso 2.4). Comienza a 25.000 RPM con el dispositivo de perforación perpendicular (≈ 90 °) a la superficie del hueso y realiza una o dos pasadas ligeramente más profundas a lo largo de los bordes rectangulares para establecer una ranura inicial de corte.
      NOTA: La velocidad de inicio del taladro puede ajustarse al nivel de experiencia del operador.
   2. Perforar ranuras (aproximadamente de 0,2 a 0,3 mm de profundidad) en el hueso y el cemento dental adyacentes a la ventana craneal en las dos coordenadas de inserción de la sonda marcadas en el paso 2.5.
      NOTA: Estos surcos sirven como puntos visuales persistentes que permanecen visibles tras la retirada del colgajo óseo y se utilizan para reposicionar las sondas intracraneales de forma reproducible en sesiones electrofisiológicas posteriores.
   3. Aplicar fluido cefalorraquídeo artificial estéril helado (ACSF; preparado según la receta con cefazolina de Goldey et ^al.14) de forma regular durante la perforación para evitar daños térmicos en la corteza subyacente y minimizar el sangrado¹⁴.
   4. Reduce progresivamente la velocidad del taladro hasta 20.000 RPM a medida que el hueso se afine, e inclina la pieza de mano a ≈ 45°, permitiendo al operador estabilizar el taladro contra la mano y pasar a golpes más suaves y controlados.
3. Retirar el colgajo óseo (paso crítico)
   1. Sigue taladrando a lo largo del perímetro rectangular hasta que el hueso dentro del contorno esté aproximadamente un 90% más delgado. No perfores completamente el cráneo.
   2. Confirma el grosor óseo restante mediante dos comprobaciones complementarias:
      1. Bajo el microscopio binocular, golpea suavemente el borde de la estantería de hueso adelgazada con un instrumento romo. La magnitud de la deflexión producida por un golpe ligero proporciona una indicación directa del grosor residual del hueso.
      2. Aplica ACSF helado sobre la ventana perforada e inspecciona inmediatamente con los prismáticos: durante los primeros 20–30 segundos, antes de que el ACSF penetre el hueso, la capa de líquido realza bruscamente el contraste visual, resolviendo los capilares corticales subyacentes donde el hueso ha sido adelgazado cerca de la duramadre, mientras que las regiones de grosor residual permanecen comparativamente opacas bajo el líquido. Una vez que la solapa parezca uniformemente translúcida y demostrablemente flexible, proceda al paso 3.3.3.
   3. Cambia al gancho de dura dura finamente curvado, que termina en una punta curvada a 90°. Inserta la punta bajo el borde del hueso adelgazado con extrema precaución en un ángulo de aproximadamente 15° respecto a la superficie del hueso y desliza el gancho a lo largo del perímetro de la ventana, desprendiendo cuidadosamente el colgajo óseo del cráneo circundante y del tejido subyacente.
   4. Avanza progresivamente de una esquina a la otra a lo largo de los laterales en ambos lados, y finalmente avanza desde las esquinas hacia el centro del rectángulo hasta que todo el perímetro se desprende de la duramadre subyacente.
   5. No apliques ninguna presión hacia abajo sobre el gancho de la duramadre mientras te deslizas y evita tocar el cerebro.
      NOTA: Alternar entre esquinas diagonalmente opuestas con un ángulo de gancho poco profundo distribuye la tensión mecánica de manera uniforme alrededor de la solapa ósea. Esta estrategia previene los desgarros durales y preserva la salud a largo plazo del tejido cerebral subyacente.
   6. No fuerces ningún movimiento si el gancho encuentra resistencia focal en alguna esquina. En su lugar, baja el colgajo y vuelve al paso 3.4 para adelgazar aún más la región adherente.
      1. Si ocurre un desgarro dural, se suspende el procedimiento en ese animal (reconocido por una protuberancia focal repentina, una filtración de líquido con un tono rosado o un sangrado arterial rojo brillante que no desaparece tras inundar la cavidad de la placa capilámica tres veces con ACSF helado, permitiendo que cada lavado repose durante 30 segundos).
         NOTA: Un desprendimiento exitoso se indica porque el colgajo óseo se vuelve uniformemente móvil a lo largo de todo su perímetro, sin protrusión dural visible y solo con un leve sangrado capilar.
   7. Levanta con cuidado el colgajo óseo que se ha desprendido con éxito con el gancho de la duramadre en dirección posterior a anterior, aproximadamente a 35° sobre la superficie del cráneo.
   8. Agarra el borde levantado con la pinza y balancea suavemente a izquierda y derecha hasta que la placa se suelte por completo. Si la placa resiste en alguna esquina, bájala de nuevo en su posición y vuelve al paso 3.3.4 para adelgazar la zona adherente antes de intentar retirarla de nuevo; dicha resistencia indica una sección de hueso localmente subafinada.
   9. Despeja suavemente la zona expuesta de sangre coagulada con repetidos lavados de ACSF bien frío.
   10. Verifica que la duramadre esté intacta y transparente antes de continuar.
       NOTA: Es esencial un levantamiento lento y gradual desde el borde posterior para minimizar el riesgo de lesión en los senos venosos superiores superiores y transversos subyacentes, así como en la superficie cortical.
4. Sellado de la ventana craneal
   1. Coloca una sola membrana PDMS prefabricada y estéril (preparada en la sección 1) directamente sobre la superficie dural una vez que haya disminuido el sangrado. Cuando se ajusta correctamente, cubrirá la ventana con precisión y se adhiere pasivamente a la duramadremadre, manteniéndola plana contra el cerebro.
   2. Absorbe el ACSF residual del perímetro de la ventana con una toallita no fibrosa.
      NOTA: La toallita nunca debe entrar en contacto con la duramadre expuesta, y se debe mantener una técnica aséptica estricta (operador estéril, herramientas y campo) en todo momento, porque la ventana se vuelve a abrir repetidamente, y cualquier contaminación introducida en este paso comprometerá los registros longitudinales posteriores.
   3. Prepara el sellador de elastómero de silicona de dos componentes según las instrucciones del fabricante y aplica el elastómero mezclado en un plazo de 30 segundos tras la dispensación para rellenar cada grieta entre el recinto de cemento dental y el borde interior de la placa frontal, rodeando y solapando completamente los bordes de la membrana PDMS.
   4. Deja que el elastómero cure durante aproximadamente 2 minutos (o el tiempo especificado por el fabricante). Asegúrate de que el sello curado sea continuo y hermético al líquido, pero que se mantenga removible mecánicamente al inicio de cada sesión de grabación.
   5. Coloca una tapa protectora personalizada impresa en 3D en la placa frontal con una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato para proteger la ventana entre sesiones de grabación.
   6. Permite que el ratón se recupere de la anestesia y devuelvo al ratón a su jaula de origen para alojarlo individualmente y así evitar daños en el implante.

4. Cuidados postoperatorios y habituación

1. Vigila de cerca la salud del ratón durante al menos 2 días tras la cirugía. Administra analgésicos adicionales (s.c.) durante 2 días tras la cirugía si el ratón muestra signos de dolor según la escala de muecas^{del ratón 20}.
2. Permite que el ratón se recupere sin ser molestado durante un mínimo de 4 días tras la operación. Luego, comienza un periodo de habituación de 5 días de duración incremental: 5 minutos el día 1, seguidos de 15, 30, 45 y 60 minutos en los días 2, 3, 4 y 5, respectivamente, para acostumbrar al ratón al manejo y a la plataforma de registro de fijación de cabeza.
   NOTA: Se sabe que el edema tisular y la inflamación local tras la craneotomía pueden persistir hasta dos semanas^{y 21}. Cuando el calendario experimental lo permite, se recomienda un periodo de recuperación prolongado antes de la primera sesión de grabación. Antes de la primera sesión de registro, verifica que la ventana craneal esté clara y libre de opacidad o tejido fibroso bajo el microscopio binocular, y que el peso y comportamiento del animal sean normales.

5. Procedimiento para registros electrofisiológicos longitudinales

1. Colocar al animal en la plataforma de grabación
   1. Coloca el ratón en la plataforma de grabación y guía las abrazaderas de fijación de la cabeza del ratón. Asegúrate de que la altura haya sido ajustada previamente para preservar la postura natural del animal de pie durante la fijación de la cabeza.
      NOTA: Si el ratón resiste persistentemente la fijación de la cabeza, no fuerces el procedimiento. Devuelve al animal a su jaula de origen y extiende la fase de habituación (sección 4) con una o dos sesiones adicionales antes de intentar volver a fijarla.
   2. Aprieta los tornillos de bloqueo de la abrazadera.
   3. Remojad la hoja microquirúrgica circular roma en etanol al 80% justo antes de usarla.
   4. Inserta la hoja entre la tapa impresa en 3D y la superficie superior de la placa frontal, manteniendo la hoja casi paralela a la superficie de la placa frontal. Nunca avances la hoja más allá del borde interior de la apertura de la placa frontal, para evitar el riesgo de contacto con el cerebro.
      NOTA: La tapa está intencionadamente impresa en resina transparente para que la profundidad de la hoja sea visible en toda la pantalla.
   5. Avanza alrededor de la tapa con suaves movimientos de izquierda a derecha que cortan la capa adhesiva de forma incremental.
   6. Usa pinzas finas de disección para levantar la tapa y deséchala una vez que esté completamente liberada.
   7. Agarra el borde exterior del sello de elastómero de silicio y levántalo lentamente desde el lado caudal hacia el lado rostral. El sello de elastómero y la membrana subyacente del PDMS se desprenden juntos como una sola unidad, dejando al descubierto una duramadre intacta.
   8. Mantén el cerebro húmedo aplicando unas gotas de ACSF.
2. Colocación de los dispositivos de grabación
   1. Montar la matriz μECoG sobre un brazo articulado con base magnética; Ajusta el dial de fricción del brazo según la experiencia del operador, y los operadores experimentados prefieren una configuración de baja fricción que preserve el control motor fino durante la posición.
   2. Guiar la matriz de modo que la cara del electrodo quede perpendicular (90°) a la superficie cortical a lo largo del borde derecho de la ventana craneal; Una vez posicionado satisfactoriamente, aprieta la perilla de fricción para fijar el brazo.
   3. Utiliza una herramienta puntiaguda de silicona para golpear suavemente el cable plano de la matriz hacia abajo sobre la superficie superior de la placa frontal, de modo que el cable encaje en conformación con la placa y la matriz se asiente plana contra la duramadre, donde el ACSF residual proporciona adhesión pasiva. Debido a que la ventana craneal está dimensionada para acomodar la matriz de dos subcuadrículas en una sola orientación, la alineación gruesa es fácilmente detectable.
   4. Realiza ajustes finos finales con la herramienta de silicona, empujando lateralmente la matriz hasta que la línea media sagital quede claramente centrada dentro de la matriz semitransparente.
      NOTA: La rejilla translúcida μECoG expone el seno sagital como una señal anatómica inequívoca de alineación que permanece visible a través del arreglo, permitiendo reproducir el mismo desplazamiento lateral a lo largo de las sesiones longitudinales. El arreglo está posicionado para cubrir bilateralmente la corteza cingulada anterior (ACC) en su mitad rostral y la corteza retroesplénica (RSP) bilateralmente en su mitad caudal, abarcando los nodos DMN dirigidos en este estudio. Un paquete de análisis de código abierto (ephy_spatial_fidelity-toolkit, disponible en https://github.com/RazBalin/ephy_spatial_fidelity-toolkit) cuantifica la deriva de colocación de la cuadrícula de sesión a sesión a partir de grabaciones conservadoras.
   5. Conecte el cable de referencia μECoG al zócalo de referencia bañado en oro implantado en el paso 2.7.
      NOTA: Como comprobación opcional de control de calidad previa a la sesión, obtén una breve grabación con las sondas y la matriz sumergidas en un tubo cónico de 50 mL de ACSF para confirmar que la jaula de Faraday está atenuando eficazmente la interferencia electromagnética ambiental antes de proceder con la grabación in vivo .
   6. Colocar la sonda caudal de electrodo intracraneal de alta densidad sobre un brazo micromanipulador orientado perpendicular (≈ 90°) a la superficie cerebral y la sonda rostral de electrodo intracraneal de alta densidad en un segundo brazo inclinado a 50°.
   7. Bajo el microscopio binocular, adelanta cada sonda aproximadamente 1 mm por encima de la duramadre y alinea el eje Y de cada sonda con la correspondiente ranura guía grabada fresada en el paso 3.2.4.
   8. Registrar mediante nota escrita o fotografía a través de los prismáticos, donde la rejilla de electrodos μECoG se encuentra justo al lado del punto de entrada previsto de cada sonda.
      NOTA: Cuando la cirugía se realiza correctamente y no hay edema cortical, el espaciamiento entre el borde óseo y la matriz μECoG es mínimo, lo que hace que la selección del punto de entrada sea inequívoca. Para lograr la máxima precisión espacial a lo largo de las sesiones longitudinales, captura una fotografía de la corteza expuesta con la matriz en su lugar e identifica un vaso pial distintivo dentro de la estrecha región entre el borde óseo y la matriz μECoG. Esta imagen, anotada con el recipiente de referencia y su posición relativa respecto a las almohadillas μECoG, sirve como mapa de referencia sesión a sesión para reproducir el mismo punto de entrada en días de grabación posteriores.
   9. Retrae cada sonda hacia arriba aproximadamente 15 mm una vez que se haya registrado la correspondencia sonda-almohadilla para proteger el frágil vástago del electrodo durante la punción dural.
   10. Fabrica la herramienta de punción dural fijando una aguja hipodérmica estéril de 30 G en la punta de un aplicador con punta de algodón y doblando la punta de la aguja a 90° con pinzas finas sin dientes.
   11. Guía lentamente la herramienta de pinchazo sobre la placa frontal. Mirando a través del prismático, cuenta las almohadillas de electrodos de μECoG para alinear la herramienta con la coordenada de entrada registrada. Baja la punta doblada a la superficie dural de modo que la punta de corte se acerque a la duramadre a 90° mientras el eje de la herramienta se mantiene paralelo al eje largo de la espalda del ratón.
   12. Avanza la punta aproximadamente 1 mm por debajo del plano dural y retrae. Se espera una pequeña hemorragia transitoria en la punción; Sécalo con la esquina torcida de una toallita no fibrosa.
   13. Baja cada sonda de electrodo intracraneal de alta densidad a la superficie dural bajo observación binocular continua inmediatamente después de la punción. Si la perforación se coloca con precisión, la sonda se desliza suavemente a través de la perforación, sin desviación del vástago.
   14. Desciende cada sonda gradualmente hasta la profundidad objetivo de 5 mm por debajo de la duramadre a una velocidad controlada de aproximadamente 0,1 mm/s o^{más lenta de 22}.
   15. Permite que las sondas se asienten mecánicamente durante 10 minutos antes de iniciar la adquisición de datos.
       NOTA: La pequeña perforación dural creada por la aguja de 30 G se cierra sola en minutos; por lo tanto, la inserción de la sonda debe seguir la perforación sin demora.
3. Adquisición de datos
   1. Comienza la adquisición de datos.
      NOTA: Las señales μECoG se amplifican mediante cuatro etapas digitales de 128 canales conectadas mediante cables de interfaz SPI a una placa de adquisición de código abierto, mientras que las dos sondas de electrodos intracraneales de alta densidad se adquieren mediante un módulo de adquisición dedicado a sondas de alta densidad alojado en un chasis modular de instrumentación junto a módulos multifunción de entrada/salida y adquisición de datos para sincronización y señalización digital. Un reloj maestro TTL común es generado por la tarjeta de adquisición de código abierto μECoG y distribuido como una línea de sincronización hardware al chasis de adquisición de la sonda (a través de su módulo de E/S multifunción), de modo que los dos flujos de adquisición comparten una base de tiempo alineada con muestras. Todos los flujos de datos se graban de forma sincrónica a través de la interfaz gráfica del sistema de adquisición; los modelos completos de hardware y los números de catálogo se listan en la Tabla de Materiales.
   2. Al final de la sesión de grabación, dispensar 0,5 mL de ACSF en las rejillas μECoG, luego retraer cada sonda de electrodo intracraneal de alta densidad a la misma velocidad utilizada para la inserción (≈6 mm/min) y retirar suavemente la matriz de μECoG.
   3. Limpia las sondas y el conjunto remojándolas durante 45 minutos en una solución enzimática de detergente recién preparada al 1% (p/v).
   4. Tras el remojo enzimático en detergente, enjuaga los electrodos mediante tres inmersiones secuenciales en agua purificada por ósmosis inversa, utilizando un tubo nuevo para cada enjuague.
   5. Sustituye la membrana PDMS por una lámina estéril nueva como en el paso 3.4.1.
   6. Reaplica el sellador de elastómeros (paso 3.4.3–3.4.4) y coloca una nueva tapa protectora impresa en 3D (paso 3.4.5).
   7. Deja que el conjunto sellado se seque al aire durante 5 minutos antes de devolver al ratón a su jaula de origen. El procedimiento puede repetirse durante varias sesiones de grabación durante varias semanas.

Resultados

Una cirugía exitosa resulta en una ventana clara y transparente sobre la corteza, con vascularización visible y signos mínimos de inflamación o infección. Esta claridad puede mantenerse durante más de 21 días (Figura 1), lo que permite estudios longitudinales a largo plazo. La robustez del implante se demuestra por su capacidad para mantenerse estable incluso durante un paradigma crónico de administración de corticosterona durante 21 días, un modelo común pa...

Discusión

Este informe detalla un protocolo quirúrgico de dos fases que preserva la duramadre, que proporciona un método fiable y altamente eficaz para crear una ventana craneal grande, crónica y resellable en ratones. La importancia de esta técnica va más allá del tamaño de la ventana. Su principal ventaja es la capacidad de interrogar simultáneamente a múltiples escalas redes cerebrales a gran escala a lo largo de escalas temporales longitudinales. Combinando rejillas de superficie μECoG (propor...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
& micro; Matriz ECoG y mdash; Personalizado de 512 canales (2 y veces 256 canales)	NeuroNexus	E256-200-30-80	Embalaje: IH256. Dos 16 y puntos; 16 subrejillas (cada una de 3,3 mm y 3,5 mm); 200 & mu; tono m; 80 & mu; diámetro del electrodo m. Grabaciones DMN a nivel superficial.
Brazo micromanipulador izquierdo de 3 ejes	Instrumentos de Precisión Mundial (WPI)	504926	10 & mu; resolución m; pantalla digital; Usado para la posición de la placa de cabeza/sonda durante la cirugía
Tapa protectora impresa en 3D	Interno (Anycubic Photon Mono 4K)	N/A	Diseño personalizado; impreso en resina UV Anycubic High Clear; Archivo STL disponible en https://github.com/RazBalin/ProtectiveDMN_Cap
Acetona (grado de laboratorio)	Sigma-Aldrich	179973	Desgrasado de la superficie del cráneo y eliminación del periosteo antes de la aplicación del adhesivo
Gancho Adson Dura 5 mm (Gancho fino de duramára)	gSource	gS 25.2570	Se utiliza para desprender la placa ósea de la duramadre a lo largo del perímetro; fabricado con alambre fino de tungsteno o similar
Resina UV Anycubic High Clear	Anycubic	STMGCL-102B	Resina fotopolimérica utilizada con impresora Anycubic Photon Mono 4K para cápsulas protectoras impresas en 3D
Impresora de resina 3D 4K Anycubic Photon Mono	Anycubic	PHOTON-MONO-4K	Se usa para imprimir tapas protectoras de ventana con resina Anycubic High Clear
Lavado y lavado de resina UV Anycubic Máquina de Curar 2.0	Anycubic	285-550	Lavado postimpresión y curado UV de condensadores impresos en 3D
Brazo articulado con base magnética (y tiempos; 2)	Haas Tooling	09-0535	Solía mantener y micrometer; Sub-redes ECoG en la superficie cortical durante las grabaciones
LCR artificial (aCSF)	Preparación interna	N/A (Interna)	receta de aCSF: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSsub4, 1,25 mM KH2PO4, 10 mM de D-glucosa; oxigenar con 95% de O2 / 5% CO2 inmediatamente después de la preparación. Números de catálogo listados por separado.
Cuchilla microquirúrgica roma (bisturí circular) y nbsp;	Iogen	374769	Usado para raspar la superficie del cráneo y retirar la tapa
Buprenorfina (Temgesica)	Indivior	BE-112515	analgésicos opioides; 0,05 mg/kg de s.c. preoperatorio
Ratones C57BL/6JRj	Janvier Labs		Hombre o mujer; mínimo 10 semanas, >20 g de peso corporal en el momento de la cirugía
Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2 y middot; 2H2O)	Sigma-Aldrich	C-7902	2 mM; Miércoles 147.02; 0,29 g/L. Preparado como Ca y tiempos; 100 acciones. Componente de la aCSF interna.
Carprofeno (Rimadyl)	Zoetis Salud Animal	RXRIM-INJ 	Analgésico AINE; 5 mg/kg de s.c. preoperatorio
Corticosterona	Sigma-Aldrich	C2505	Disuelto en agua potable para un modelo de estrés crónico / depresión durante 21 días
Hisopo de algodón	Fisherbrand	22-363-157	Sirve como mango para dispositivos de duropunción de 30 G y para desengrasar la superficie del cráneo con acetona
Pegamento de cianoacrilato y mdash; Loctite 401	Adhesivos Henkel	Loctite 401	Cianoacrilato de viscosidad fina; Usado para imprimación de superficies del cráneo, fijación de placas frontales y capuchones
Taladro dental y mdash; Foredom K.1070	Foredom	K.1070	Taladro rotatorio de eje flexible; Utilizado para adelgazamiento de craneotomías y perforación de agujeros piloto
Dexametasona	Dopharma	1DEX004	antiinflamatorio corticosteroide; 2 mg/kg de c.a. preoperatorio
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G-7021	10 mM; MW 180.20; 1,80 g/L. Preparado como glucosa y tiempos; 100 acciones. Componente de la aCSF interna.
Broca de acero redonda 1/007W	Hager & Meisinger	18089	Utilizado como sitio de referencia y ventana craneal
Etanol 80% (v/v) - A12t diluido	Berner	13221132	Remojo preoperatorio de instrumentos quirúrgicos y capucha laminar quirúrgica para esterilización
Aparato de evacuación de gas	Ciencias de la Vida RWD	R546W	Elimina gases anestésicos de la zona quirúrgica
Vaso de referencia bañado en oro	DigiKey	310-13-102-41-001000	Implantado sobre el cerebelo izquierdo; sirve como tierra/referencia ECoG
GRANT Limpiador Ultrasónico y mdash; Modelo 17002A	Instrumentos GRANT	17002A	EAN: 4064343191654. Baño ultrasónico de agua caliente; Usado con TICKOPUR TR 3 para limpieza de instrumentos
Manta térmica y mdash; Supertech TMP-5B	Supertecnología	TMP-5B	Mantiene la temperatura corporal en 37 °F; C durante la anestesia
Isoflurano	Piramal Healthcare	66794-017-25	Anestésico por inhalación; inducción 4%, mantenimiento 1,5 y NDASH; 2.5%
Kimtech Science, Toallitas de precisión (tejido no fibroso)	KIMBERLY CLARK	7552	Se usa con punta puntiaguda para secar ACSF residual y ayudar a la adhesión de membrana PDMS a la duramadre
Sellador Kwik-Cast para elastómeros estérils	Instrumentos de Precisión Mundial (WPI)	KWIK-CAST-s	Modelo: KWIK-CAST-S. silicona biocompatible; se usó para crear un sellado extraíble alrededor de la membrana PDMS.
Lápiz de curado UV LED 405 nm	CureUV	514424-405	Se utiliza para curar cemento dental activado por UV (C-Ram total) durante la implantación
Solución de lidocaína-epinefrina	Orion Pharma	05 10 31	anestesia local; inyección de s.c. bajo la piel del cuero cabelludo
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4· 7H2O)	Sigma-Aldrich	M-7774	1 mM; MW 246.48; 0,25 g/L. Preparado como Mg y tiempos; 100 acciones. Componente de la aCSF interna.
Placa frontal metálica y mdash; Neurotar Modelo 13	Neurotar	Modelo 13	Placa de titanio para la cabeza; abertura redonda de 11 mm de diámetro; fijado al cráneo con cianoacrilato y cemento dental
Adaptador de headstage NeuroNexus )	NeuroNexus	IH256 personalizado 64 y días; 4 Molex	Placa adaptadora personalizada; bocadillos cada uno y micro; Subred ECoG entre dos headstages Intan RHD 128-ch
Sonda Neuropixels 1.0 con tapa metálica (y tiempos; 2)	IMEC	PRB_1_4_0480_1_C	960 sitios de grabación; Espina de 10 mm. Una sonda apunta a la columna hipocampo-talámica-visual y otra a la columna mPFC
Chasis NI PXIe-1083	Instrumentos Nacionales	PXIe-1083	Chasis PXI Express de 9 ranuras que alberga el módulo Neuropixels y tarjetas NI DAQ
Módulo multifunción de E/S NI PXIe-3839	Instrumentos Nacionales	PXIe-3839	Instalado en chasis NI PXIe-1083; Utilizado para sincronización y E/S auxiliar
DAQ multifunción NI PXIe-6363	Instrumentos Nacionales	PXIe-6363	Instalado en chasis NI PXIe-1083; E/S analógica y digital para sincronización
Nova Microcinerator -  Esterilizador infrarrojo	Argos Tech	S3022	Se utiliza para la esterilización rápida de cualquier instrumento que pueda tocar tejidos cerebrales expuestos
Microscopio binocular estereoscópico Olympus SZ51	Olimpo	SZ51	Visualización quirúrgica; Utilizado durante los pasos de craneotomía y implantación
Tablero de Adquisición Open Ephys (One Box, 1ª generación)	Open Ephys	OEPS-9029	Recepciones y micro; Flujos de datos ECoG vía SPI; Hardware de código abierto. Véase open-ephys.org
Interfaz gráfica de Open Ephys	Open Ephys	N/A (código abierto)	Software gratuito y de código abierto para adquisición de electrofisiología. Disponible en: open-ephys.org
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich	P-5405	3 mM; MW 74.55; 0,22 g/L. Componente de la aCSF interna.
Dihidrógeno fosfato potásico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P-5655	1,25 mM; MW 136.09; 0,17 g/L. Componente de la aCSF interna (Klebs y épocas; 10 acciones).
Solución de povidona-yodo (BETADINE)	Takeda	45 70 28	Desinfectante tópico para preparación quirúrgica en el campo
Módulo de adquisición PXIe	Neuropíxeles	PXIE_1000	módulo en formato PXI para adquisición de datos de Neuropixels 1.0; instalado en chasis NI PXIe-1083
Conector de enchufe de referencia	DigiKey	342-10-102-00-591000	Conector de acoplamiento correspondiente para el zócalo de referencia arriba; confirma el número de parte con DigiKey
Headstage de 128 canales (y horarios; 4)	Intan Technologies	RHD 128	Dos etapas principales por µ Sub-red ECoG; Confirmar el modelo (por ejemplo, RHD2132 o RHD2164)
Cable de interfaz RHD SPI, 0,9 m	Tecnologías Intan / Open Ephys	C3203	Cable SPI estándar que conecta las etapas de cabeza RHD a la caja de adquisición de Open Ephys
Bomba de aire de tracción posterior	Ciencias de la Vida RWD	R510-29	Proporciona flujo de aire a través del circuito anestesioso
Vaporizador de anestesia animal de tracción trasera	Ciencias de la Vida RWD	R5835	Vaporizador de isoflurano de precisión para inducción y mantenimiento de anestesia
Bisturí #11	Swann Morton	SM0103	Utilizado para grabar patrones cruzados en la superficie del cráneo para mejorar el agarre adhesivo
Recortadora de pelo para animales pequeños - GT416	Aesculap Schermaschinen GmbH	D-98528H	Se usaba para recortar el cuero cabelludo de un animal antes de la cirugía
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S-5761	26 mM; MW 84.01; 2,18 g/L. Componente de la aCSF interna.
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S-5886	124 mM; MW 58.44; 7,25 g/L. Componente de aCSF interno.
SOL-M (Aguja hipodérmica estéril 30 G)	Europa Sol-Milenio	113005	Curvado 90º ºC; en la punta y fijado a un hisopo de algodón para crear el dispositivo de punción dura
Brazo manipulador estándar, 3 ejes IZQUIERDO (Stoelting)	Stoelting Co.	51604	Utilizado para la inserción de sondas Neuropixels durante sesiones de grabación
Brazo manipulador estándar, 3 ejes DERECHO (Stoelting)	Stoelting Co.	51606	Utilizado para la inserción de sondas Neuropixels durante sesiones de grabación
Marco estereotáctico y mdash; RWD F67001	Ciencias de la Vida RWD	F67001	Marco estereotáctico estándar; Utilizado para la estabilización de la cabeza y la colocación de implantes referenciada por coordenadas
Pluma de piel con marcador quirúrgico y regla (tinta violeta)	Fannin	SM0372	Marcador cutáneo cutáneo biocompatible a base de genciana-violeta utilizado para delinear la craneotomía y la huella del implante planificada en el hueso. Resistente al cebado de cianoacrilato (Loctite 401) y permanece visible mediante el desengrasado del cráneo y la fijación de la cabeza, permitiendo una transferencia fiable de coordenadas estereotácticas a la superficie ósea.
Kit de elastómeros de silicona SYLGARD 184 (PDMS)	Dow (Alemania)	1673921	Polidimetilsiloxano; fundido en fina (< membranas de 1 mm; colocado sobre la superficie dural para proteger el cerebro
Detergente enzimático Tergazyme	Alconox	1304-1	Limpiador a base de proteasa usado al 1% (p/v) en agua osmosmosa tibia para la limpieza de electrodos tras la sesión (45 minutos de remojo, luego triple enjuague en agua purificada).
Total C-Ram Automix Cemento Dental UV (Blanco)	Itena	R301950	Modelo: TTCRAM-BLC. resina dental curable por rayos UV; Utilizado para refuerzo de placas frontales y fijación de vasos
Solución de limpieza ultrasónica (TICKOPUR TR 3)	Dr. H. Stamm GmbH	TR-3-913	Concentrado a base de ácido cítrico; Utilizado en baños ultrasónicos para la limpieza de instrumentos postquirúrgicos
Gel ocular Viscotears 2 mg/g	Alcon	503849	Ungüento lubricante para ojos a base de carbómero; aplicado en córneas durante la anestesia para evitar el secado
Fuente de luz fría Zeiss KL1500 LCD	Carl Zeiss	KL1500 LCD	Iluminación en frío por fibra óptica para el campo quirúrgico; Previene daños térmicos