Method Article

Transcriptómica espacial de la morfogénesis dental temprana en tejido embrionario de ratón embebido con parafina fijado en formalina

DOI:

10.3791/70340

⸱

March 13th, 2026

 , 
1Section on Craniofacial Genetic Disorders, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Shriners Hospital for Children

In This Article

Summary

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El protocolo actual describe el uso de secciones fijadas en formalina, incrustadas en parafina, de regiones craneofaciales E13.5 y E15.5 de embriones de ratón para analizar los perfiles diferenciales de expresión génica mediante transcriptómica espacial.

Abstract

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El diente en desarrollo comprende poblaciones celulares diversas y altamente especializadas que trabajan juntas para mantener la forma y función adecuadas. Esclarecer las interacciones entre estas células y su microentorno es fundamental para comprender los mecanismos reguladores que subyacen al desarrollo normal de los dientes. Las perturbaciones en estos procesos pueden provocar trastornos congénitos como la agenesia dental, la dentinogénesis imperfecta y la amelogénesis imperfecta. A pesar del avance sustancial permitido por la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) en la revelación de la heterogeneidad celular, no preserva el contexto espacial de las células dentro de los tejidos, limitando la capacidad de relacionar la expresión génica con la arquitectura tisular. Las tecnologías transcriptómicas espaciales abordan esta limitación integrando el perfilado de expresión génica de alta resolución con la preservación de la arquitectura tisular nativa, permitiendo la localización in situ de firmas moleculares. Aquí describimos un protocolo paso a paso para la recogida, fijación e incrustación de parafina de tejido craneofacial embrionario de ratón, adecuado para aplicaciones transcriptómicas espaciales posteriores. El flujo de trabajo detalla la optimización de la sección y manejo de tejido fijado en formalina, incrustado en parafina, para preservar la integridad del ARN y la morfología tisular para un análisis espacial de alta resolución. Este método es compatible con plataformas de secuenciación y transcriptómica espacial basada en imágenes, permitiendo un perfil transcriptómico espacial reproducible de morfogénesis dental temprana en embriones de ratón. Este enfoque ofrece potentes conocimientos sobre la organización espacial y la dinámica funcional de las estructuras craneofaciales tanto en estados de desarrollo como patológicos, proporcionando un marco crítico para vincular los mecanismos moleculares con la morfología tisular.

Introduction

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El desarrollo dental se basa en una secuencia altamente coordinada de procesos morfogenéticos durante el crecimiento embrionariotemprano 1,2,3,4. Aunque numerosos genes clave y vías de señalización han sido identificados mediante estudios genéticos y del desarrollo, nuestra comprensión de cómo interactúan estos factores para moldear las estructuras craneofaciales individuales sigue siendo limitada. Cabe destacar que, incluso con avances sustanciales en vincular variantes genéticas específicas tanto con trast....

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Protocol

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Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal (ACUC) de los Institutos Nacionales de Salud Infantil y Desarrollo Humano (ACUC), bajo el Protocolo de Estudio Animal #21-031.

1. Preparación del animal experimental y recogida de tejido

  1. Empareja a Mus musculus macho y hembra sanos y fértiles para apareamientos temporizados. Identificar a las hembras de ratón preñado por la presencia de un plug vaginal, designado como día embrionario (E) 0,5.
  2. Eutanasiar a las ratones embarazadas mediante inhalación de CO₂ seguida de luxaci....

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Results

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Este método describe el procesamiento de cabezas embrionarias de ratón recién diseccionadas para generar muestras de FFPE de tejidos craneofaciales, incluido el diente en desarrollo, que pueden ser fácilmente seccionadas por micrótomo manteniendo la integridad del ARN (Figura 1). Este protocolo se aplicó con éxito a las cabezas de embrión murino E13.5 (día embrionario 13.5), E15.5 y E16.5 para regiones craneofaciales de alta resolución basadas en imágenes (<.......

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Discussion

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En este trabajo, presentamos un protocolo detallado para preparar bloques FFPE de cabezas embrionarias de ratón, optimizados para su uso con plataformas de imagen espacial de ARN de alta resolución, incluyendo transcriptómica espacial basada en secuenciación e imagen. Un objetivo clave de este protocolo es preservar tanto la morfología tisular como la integridad de los ácidos nucleicos en secciones de toda la cabeza, con especial atención a la región craneofacial en desarrollo. Garantiza.......

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Disclosures

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Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Acknowledgements

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Agradecemos sinceramente al Dr. Sergey L. Leikin, la Dra. Elena Makareeva (Sección de Bioquímica Física, NICHD/NIH) y al Dr. Jeremie Oliver Piña (Sección de Biología Molecular de Huesos y Dientes, NIDCR/NIH) por sus consejos sobre el diseño de los experimentos y la asistencia técnica. Agradecemos al Dr. Iben James y al Dr. Vivek Mahadevan (Molecular Genomics Core, NICHD/NIH) por proporcionar asistencia técnica para la prueba de transcriptómica espacial basada en secuenciación. Agradecemos al Dr. Gustaf Wigerblad (Rama de Autoinmunidad Sistémica, Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel, NIAMS/NIH)....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSThermo Fischer10010023Uso  realizar lavados durante el flujo de trabajo
Tubos cónicos de 50 mL (Ambión) libres de ARNASAThermo FischerAM12502Uso para almacenar muestras en diferentes soluciones
Agitador orbital avanzadoVWR6683-470Se usa para agitar tejidos en la solución de fijación durante la incubación
Alcohol, 70%, Fisherbrand, HistoPrepFisher ScientificHC-1000-1GLÚsalo para limpiar y desinfectar todo el espacio de trabajo
Procesador automático de tejidos al vacíoLeica BiosystemsASP300SUso para limpiar, deshidratación, rehidratación e infiltración de cera de muestras
Espesor de vidrio de cubierta 1,5, 25 mm x 25 mm  Corning2850-25Uso para el montaje de corredera en el flujo de trabajo Visium HD
Buffer de azulado Dako, listo para usarTecnologías AgilantCS70230-2Uso para H& Tinción con E
Eosina-Y con floxinaFisher Scientific22050198Uso para H& Tinción con E
Hematoxilina, Mayer, solución acuosa lista para usarTecnologías AgilantS330930-2Uso para H& Tinción con E
Baño María HistoCore Leica BiosystemsHIS2326Úsalo para flotar las secciones a 40-43 grados; C para eliminar arrugas de las secciones FFPE 
Loupe browser  9.0.010X Genomics, Inc. Uso para analizar datos de Visium HD  
Cuchillas desechables de perfil bajo DB80LXLeica Biosystems14035843496Úsalo para seccionar bloques FFPE  
Formalina amortiguada en neutro 10%Azer ScientificNBF-4-GÚsalos para arreglar los pañuelos
Solución de descontaminación RNasa RNaseZapThermo FischerAM9782Úsalo para limpiar y eliminar RNasa
Microtomo rotatorio semiautomatizadoLeica BiosystemsRM2245Úsalo para seccionar los bloques FFPE según lo indicado en las directrices.
Calentador de corredero con cubiertaEstreno y Estreno;XH2004Uso para incubación de portaobjetos a diferentes temperaturas
Superfrost Plus Slides Fisher Scientific12-550-15 Úsalo para conectar secciones en Vsium HD
Hoja quirúrgica nº 11Integra Miltex4-311Uso para la puntuación de tejidos FFPE
Paraplasto SurgipathLeica Biosystems39601006Se utiliza para realizar infiltración tisular e incrustación de tejidos
TISsue DISH de cultivo 100X20MM 500/CSFisher Scientific877222Uso para recoger y diseccionar muestras en 1x PBS
Glucerol UltraPureThermo Fischer15514011Uso para montaje de la corredera Visium HD en coverglass antes de CytAssist
Visium CytAssist10X Genomics, Inc. PN-1000442Uso para experimentos de flujo de trabajo Visium HD
Visium HD Secuenciación Espacial de ARN10X Genomics, Inc. 1000676Uso para realizar experimentos transcriptómicos espaciales
Xenium 5K Localización in situ de ARN  10X Genomics, Inc. PN-1000724Uso para realizar experimentos transcriptómicos espaciales
Analizador de xenio10X Genomics, Inc. PN-1000481Utiliza la imagen de ARN Xenium y Xenium 5K 
Xenium Explorer 410X Genomics, Inc. Usar para analizar datos de Xenium  
Localización in situ de ARN de xenio10X Genomics, Inc. 1000672Uso para realizar experimentos transcriptómicos espaciales

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thesleff, I. From understanding tooth development to bioengineering of teeth. Eur J Oral Sci. 126 (1), 67-71 (2018).
  2. Bei, M. Molecular genetics of tooth development. Curr Opin Genet Dev. 19 (5), 504-510 (2009).
  3. Roth, D. M., et al.

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Spatial TranscriptomicsTooth MorphogenesisMouse Embryonic TissueFormalin Fixed TissueParaffin EmbeddingCraniofacial DevelopmentRNA IntegrityTissue MorphologyGene Expression ProfilingSingle Cell RNA Sequencing

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