Transcriptómica espacial de la morfogénesis dental temprana en tejido embrionario de ratón embebido con parafina fijado en formalina

Summary

El protocolo actual describe el uso de secciones fijadas en formalina, incrustadas en parafina, de regiones craneofaciales E13.5 y E15.5 de embriones de ratón para analizar los perfiles diferenciales de expresión génica mediante transcriptómica espacial.

Abstract

El diente en desarrollo comprende poblaciones celulares diversas y altamente especializadas que trabajan juntas para mantener la forma y función adecuadas. Esclarecer las interacciones entre estas células y su microentorno es fundamental para comprender los mecanismos reguladores que subyacen al desarrollo normal de los dientes. Las perturbaciones en estos procesos pueden provocar trastornos congénitos como la agenesia dental, la dentinogénesis imperfecta y la amelogénesis imperfecta. A pesar del avance sustancial permitido por la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) en la revelación de la heterogeneidad celular, no preserva el contexto espacial de las células dentro de los tejidos, limitando la capacidad de relacionar la expresión génica con la arquitectura tisular. Las tecnologías transcriptómicas espaciales abordan esta limitación integrando el perfilado de expresión génica de alta resolución con la preservación de la arquitectura tisular nativa, permitiendo la localización in situ de firmas moleculares. Aquí describimos un protocolo paso a paso para la recogida, fijación e incrustación de parafina de tejido craneofacial embrionario de ratón, adecuado para aplicaciones transcriptómicas espaciales posteriores. El flujo de trabajo detalla la optimización de la sección y manejo de tejido fijado en formalina, incrustado en parafina, para preservar la integridad del ARN y la morfología tisular para un análisis espacial de alta resolución. Este método es compatible con plataformas de secuenciación y transcriptómica espacial basada en imágenes, permitiendo un perfil transcriptómico espacial reproducible de morfogénesis dental temprana en embriones de ratón. Este enfoque ofrece potentes conocimientos sobre la organización espacial y la dinámica funcional de las estructuras craneofaciales tanto en estados de desarrollo como patológicos, proporcionando un marco crítico para vincular los mecanismos moleculares con la morfología tisular.

Introduction

El desarrollo dental se basa en una secuencia altamente coordinada de procesos morfogenéticos durante el crecimiento embrionario^temprano 1,2,3,4. Aunque numerosos genes clave y vías de señalización han sido identificados mediante estudios genéticos y del desarrollo, nuestra comprensión de cómo interactúan estos factores para moldear las estructuras craneofaciales individuales sigue siendo limitada. Cabe destacar que, incluso con avances sustanciales en vincular variantes genéticas específicas tanto con trastornos dentarios sindrómicos como no sindrómicos, los mecanismos moleculares detallados que subyacen a la morfogénesis específica de la estructura aún no están completamente^definidos 1,2,3,4. Esta brecha de conocimiento sigue limitando el avance de estrategias terapéuticas específicas para la agenesia dental u otras aberraciones dentales.

La secuenciación de ARNm unicelular (scRNA-seq) ha permitido el descubrimiento de tipos celulares previamente no reconocidos tanto en tejidos sanos como enfermos, así como la identificación de múltiples subtipos celulares basándose en perfiles de expresión génica distintos. Sin embargo, dado que el scRNA-seq requiere la disociación de los tejidos en células individuales, se pierde información sobre la posición espacial original de cada célula dentro del tejido. Como resultado, estos conjuntos de datos no capturan cómo están organizadas las células en relación con la arquitectura^{tisular 5,6,7}. Además, las interacciones predichas célula a célula dependen de la presencia de interacciones complementarias de los transcritos, pero no tienen en cuenta la información espacial real, lo cual es importante para determinar si tales interacciones ocurren in^{vivo 5,6,7}.

La tecnología de transcriptómica espacial permite un perfil de alto rendimiento de la expresión génica mientras retiene la información espacial dentro de las secciones^{tisulares 8,9}. Las tecnologías de transcriptómica espacial son ^10,11,12 basadas en imágenes o ^12,13 basadas en secuenciación. Los enfoques de transcriptómica espacial impulsados por imagen emplean FISH para detectar y medir la expresión génica dirigida con precisión espacial celular o subcelular. En cambio, las tecnologías basadas en secuenciación capturan la expresión génica en todo el transcriptoma a una resolución espacial menor. La transcriptómica espacial basada en secuenciación emplea una estrategia para lograr una resolución casi unicelular con cobertura de transcriptoma completo (~20.000 genes), apoyando análisis exploratorios imparciales, mientras que la transcriptómica espacial basada en imágenes se dirige a paneles génicos (hasta ~5.000 genes), permitiendo un análisis preciso basado en hipótesis de vías específicas e interacciones^{celulares 14}.

Los avances tecnológicos en transcriptómica espacial permiten ahora el análisis de la expresión génica dentro de la arquitectura de tejidos preservados. Los flujos de trabajo basados en parafina fija en formol (FFPE) y los flujos de trabajo basados en criosección ofrecen enfoques complementarios para la transcriptómica espacial 15,16,17. El FFPE proporciona una preservación superior de la arquitectura tisular, permitiendo un mapeo espacial preciso de la expresión génica en tejidos estructuralmente complejos, como dientes en desarrollo y plataformas palatinas. En nuestro estudio y otros, la fijación y el archivo del FFPE han dado como resultado datos transcriptómicos espaciales altamente precisos^{y reproducibles 18}. Los flujos de trabajo de criosección preservan la integridad del ARN pero son más propensos a la distorsión^{tisular 18}. Por ello, se seleccionó FFPE para este estudio. Aunque el éxito de la scRNA-seq depende en gran medida de mantener una alta integridad del ARN, la transcriptómica espacial también requiere una morfología tisular de alta calidad para localizar con precisión las señales de expresión génica en características histológicas específicas.

Este protocolo es más adecuado para tejidos craneofaciales embrionarios de ratón con FFPE que abarcan las primeras etapas del desarrollo, donde la preservación de la arquitectura fina del tejido es fundamental para el análisis transcriptómico espacial. El flujo de trabajo probablemente funcionará de forma subóptima en muestras demasiado fijas, bloques de parafina mal orientados o tejidos con integridad de ARN comprometida, lo que puede resultar en una reducción de la calidad de la señal y pérdida de resolución espacial. La aplicación exitosa de este método se indica por morfología tisular intacta, mínima distorsión de sección y señales transcriptómicas robustas y espacialmente resueltas que se alinean con las características histológicas.

Protocol

Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal (ACUC) de los Institutos Nacionales de Salud Infantil y Desarrollo Humano (ACUC), bajo el Protocolo de Estudio Animal #21-031.

1. Preparación del animal experimental y recogida de tejido

1. Empareja a Mus musculus macho y hembra sanos y fértiles para apareamientos temporizados. Identificar a las hembras de ratón preñado por la presencia de un plug vaginal, designado como día embrionario (E) 0,5.
2. Eutanasiar a las ratones embarazadas mediante inhalación de CO₂ seguida de luxación cervical. Colocar el supino del animal sobre una superficie quirúrgica absorbente y estéril y desinfectar la zona abdominal con etanol al 70% a lo largo del lugar de la incisión previsto.
3. Realiza una incisión abdominal media con tijeras quirúrgicas estériles y abre cuidadosamente la pared peritoneal con tijeras microquirúrgicas para exponer los cuernos uterinos. Exterioriza suavemente la cadena uterina usando pinzas romas. Aislar los embriones liberando el tejido uterino a lo largo del miometrio y seccionando el oviducto y la unión del cuerno uterino mediano.
4. Transfiere inmediatamente embriones enteros a un PBS 1x frío y estéril en una placa de Petri de 10 cm.
5. Separa cuidadosamente cada embrión de las membranas uterina, amniótica y coriónica circundante, y transfiere a un recipiente fresco de 10 cm que contenga 1x PBS estéril y helado.
6. Disecciona las cabezas embrionarias en las fases de desarrollo deseadas con una cuchilla quirúrgica estéril y enjuágalas una vez en un congelado, 1x PBS, antes de continuar el procesamiento.

2. Fijación y procesamiento del tejido

1. Diseca las cabezas embrionarias de ratón en las etapas de desarrollo deseadas y fija formalina tampón neutra al 10% durante la noche a temperatura ambiente sobre un shaker.
2. Tras la fijación, retirar el formol y enjuagar las muestras con 1x PBS antes de transferirlas al etanol al 70% para su almacenamiento. Realiza deshidratación, limpieza e infiltración de tejidos utilizando un procesador automático de tejidos.
3. Incrustar cabezas embrionarias en parafina con orientación en el plano coronal o sagital.
4. Tras la solidificación de la cera, retira los bloques de parafina de los moldes, colócalos en recipientes herméticos etiquetados o bolsas zip-lock, y guárdalos a 4 °C hasta la sección.
   NOTA: Los bloques de FFPE pueden almacenarse durante varios años antes de ser seccionados sin comprometer la integridad del tejido.

3. Procesamiento de tejido FFPE para transcriptómica espacial

1. Desinfectar superficies de trabajo e instrumentos con etanol al 70%, seguido de tratamiento con solución descontaminante de RNasa para minimizar la degradación del ARN.
2. Prepara un baño maria que contenga agua desionizada y mantenlo a 40 °C, ajustando la temperatura entre 40 °C y 43 °C según sea necesario según la etapa embrionaria o las características del tejido.
3. Monta el microtomo, instala una hoja nueva después de limpiarla suavemente con solución desinfectante de RNasa, asegura la hoja y ajusta el ángulo de espacio libre a 10°.
   NOTA: Asegúrese de que la nueva hoja se utilice para seccionar y lograr cortes de tejido precisos. Cambiar el ángulo de la lámina del microtomo puede afectar significativamente a la calidad de la sección, afectando la integridad del tejido, la uniformidad del grosor y la preservación de las características morfológicas.
4. Recorta el exceso de parafina alrededor del tejido incrustado y monta el bloque de FFPE en la etapa fría del microtomo.
5. Prepara y trata pinzas y cepillos limpios con una solución descontaminante de RNasa antes de usarlas.
6. Alinear la cara del bloque de parafina con la hoja del microtomo y realizar cortes de recorte de aproximadamente 12 μm hasta que se acerque a la región de interés (por ejemplo, hasta que la parte mesial de los molares sea visible en las secciones coronales). Ajusta la posición del bloque y de las palas según sea necesario para asegurar secciones coronales simétricas y correctamente orientadas de toda la cabeza.
7. Si se va a realizar el aislamiento de secciones de tejido con ARN, se recogen directamente secciones de 10 μm en tubos microcentrífugas de 1 mL y se procesan según las recomendaciones del^{fabricante 19,20} para la evaluación de calidad de DV200.
8. Cortar secciones seriadas de 5 μm de espesor y monitorizar continuamente la proximidad al área de interés examinando secciones de ensayo en una lámina normal bajo un microscopio.
9. Una vez cerca de la región de interés, marcar cuidadosamente el área del tejido con una hoja de bisturí nº 11 sin cortar completamente, en dos regiones estratégicamente espaciadas para evitar que las secciones se enrollen o se adheran. Después de seccionar, retira cualquier parafina adherida usando las cerdas de un pincel fino.
10. Coloca secciones de tejido flotante sobre el baño maria a 41 °C para permitir una relajación suave y aplanamiento antes de recogerlas en un tobogán.

4. Transcriptómica espacial basada en secuenciación

1. Recoge secciones de tejido en las láminas de vidrio recomendadas, asegurando que todas las regiones de interés estén contenidas en un área de 6,5 × 6,5 mm. Cuando se colocan varias secciones adyacentes sobre la misma corredera, calienta brevemente las correderas en un calentador de correderos a 40 °C para favorecer la adhesión y evitar el desprendimiento de secciones previamente colocadas. Una vez posicionadas todas las secciones, incuba las láminas en un calentador cubierto a 60 °C durante 2 horas para mejorar la adherencia del tejido.
   NOTA: No se procesaron secciones que se extendían más allá del área de 6,5 × 6,5 mm.
2. Tras la incubación, realizar la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) utilizando un protocolo estándar de tinción H&E, sustituyendo agua desionizada por agua del grifo para preservar la integridad del ARN.
3. Montar los coverslips usando un 80% de glicerol y adquirir imágenes H&E de alta resolución, proporcionando una imagen de referencia de mayor calidad que sustituye la típica imagen H&E generada por el sistema de imagen de diapositivas y transferencia de tejidos.
4. Tras la imagen, retirar las cubiertas sumergiendo las láminas individualmente en tubos de 50 mL que contienen agua desionizada, y preparar las láminas para su envío a la instalación central para su posterior procesamiento.

5. Transcriptómica espacial basada en imágenes

NOTA: El fabricante suministró²⁰ diapositivas, cada una con un área designada para imágenes (líneas delimitadas) de 12 mm × 24 mm, con una región de colocación de muestras disponible de aproximadamente 235 mm² (10,45 mm × 22,45 mm).

1. Coloca las secciones de tejido completamente dentro de esta área definida, asegurando que las secciones, incluida la parafina residual, no se solapen. Al colocar varias secciones adyacentes, calienta brevemente las correderas en un calentador de corredero a 40 °C para favorecer la adhesión y evitar el desprendimiento de secciones previamente montadas.
2. Una vez posicionadas todas las secciones de tejido, coloque las láminas en un calentador cubierto y incube durante la noche a 40 °C para asegurar una adherencia adecuada.
3. Tras la incubación, sigue el protocolo¹⁹ del fabricante para procesar las láminas y cargarlas en la máquina para la secuenciación de ARN, con el protocolo contrastado con la versión más reciente, ya que los detalles procedimentales están sujetos a actualizaciones periódicas.
   NOTA: Todos los materiales peligrosos generados durante el protocolo, como formalina, etanol y soluciones descontaminantes de RNasa, deben eliminarse conforme a las políticas de seguridad institucionales y a la normativa local, utilizando contenedores adecuados de residuos químicos, métodos de eliminación de riesgos biológicos y prácticas de exhaladores extractores.

Results

Este método describe el procesamiento de cabezas embrionarias de ratón recién diseccionadas para generar muestras de FFPE de tejidos craneofaciales, incluido el diente en desarrollo, que pueden ser fácilmente seccionadas por micrótomo manteniendo la integridad del ARN (Figura 1). Este protocolo se aplicó con éxito a las cabezas de embrión murino E13.5 (día embrionario 13.5), E15.5 y E16.5 para regiones craneofaciales de alta resolución basadas en imágenes (<...

Discussion

En este trabajo, presentamos un protocolo detallado para preparar bloques FFPE de cabezas embrionarias de ratón, optimizados para su uso con plataformas de imagen espacial de ARN de alta resolución, incluyendo transcriptómica espacial basada en secuenciación e imagen. Un objetivo clave de este protocolo es preservar tanto la morfología tisular como la integridad de los ácidos nucleicos en secciones de toda la cabeza, con especial atención a la región craneofacial en desarrollo. Garantiza...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fischer	10010023	Uso  realizar lavados durante el flujo de trabajo
Tubos cónicos de 50 mL (Ambión) libres de ARNASA	Thermo Fischer	AM12502	Uso para almacenar muestras en diferentes soluciones
Agitador orbital avanzado	VWR	6683-470	Se usa para agitar tejidos en la solución de fijación durante la incubación
Alcohol, 70%, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	Úsalo para limpiar y desinfectar todo el espacio de trabajo
Procesador automático de tejidos al vacío	Leica Biosystems	ASP300S	Uso para limpiar, deshidratación, rehidratación e infiltración de cera de muestras
Espesor de vidrio de cubierta 1,5, 25 mm x 25 mm	Corning	2850-25	Uso para el montaje de corredera en el flujo de trabajo Visium HD
Buffer de azulado Dako, listo para usar	Tecnologías Agilant	CS70230-2	Uso para H& Tinción con E
Eosina-Y con floxina	Fisher Scientific	22050198	Uso para H& Tinción con E
Hematoxilina, Mayer, solución acuosa lista para usar	Tecnologías Agilant	S330930-2	Uso para H& Tinción con E
Baño María HistoCore	Leica Biosystems	HIS2326	Úsalo para flotar las secciones a 40-43 grados; C para eliminar arrugas de las secciones FFPE
Loupe browser  9.0.0	10X Genomics, Inc.		Uso para analizar datos de Visium HD
Cuchillas desechables de perfil bajo DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	Úsalo para seccionar bloques FFPE
Formalina amortiguada en neutro 10%	Azer Scientific	NBF-4-G	Úsalos para arreglar los pañuelos
Solución de descontaminación RNasa RNaseZap	Thermo Fischer	AM9782	Úsalo para limpiar y eliminar RNasa
Microtomo rotatorio semiautomatizado	Leica Biosystems	RM2245	Úsalo para seccionar los bloques FFPE según lo indicado en las directrices.
Calentador de corredero con cubierta	Estreno y Estreno;	XH2004	Uso para incubación de portaobjetos a diferentes temperaturas
Superfrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Úsalo para conectar secciones en Vsium HD
Hoja quirúrgica nº 11	Integra Miltex	4-311	Uso para la puntuación de tejidos FFPE
Paraplasto Surgipath	Leica Biosystems	39601006	Se utiliza para realizar infiltración tisular e incrustación de tejidos
TISsue DISH de cultivo 100X20MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Uso para recoger y diseccionar muestras en 1x PBS
Glucerol UltraPure	Thermo Fischer	15514011	Uso para montaje de la corredera Visium HD en coverglass antes de CytAssist
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.	PN-1000442	Uso para experimentos de flujo de trabajo Visium HD
Visium HD Secuenciación Espacial de ARN	10X Genomics, Inc.	1000676	Uso para realizar experimentos transcriptómicos espaciales
Xenium 5K Localización in situ de ARN	10X Genomics, Inc.	PN-1000724	Uso para realizar experimentos transcriptómicos espaciales
Analizador de xenio	10X Genomics, Inc.	PN-1000481	Utiliza la imagen de ARN Xenium y Xenium 5K
Xenium Explorer 4	10X Genomics, Inc.		Usar para analizar datos de Xenium
Localización in situ de ARN de xenio	10X Genomics, Inc.	1000672	Uso para realizar experimentos transcriptómicos espaciales