Ensayo estandarizado de citometría de flujo utilizando paneles de anticuerpos recombinantes secos para la caracterización de células T CAR

Resumen

Este protocolo demuestra cómo los paneles de anticuerpos recombinantes secos agilizan la caracterización de las células del Receptor de Antígenos Quiméricos T (CAR T) reduciendo la variabilidad y simplificando los flujos de trabajo. Permite una evaluación reproducible de atributos críticos de calidad, incluida la cuantificación absoluta de células T del receptor de antígenos quiméricos, y es compatible entre diferentes plataformas de citometría de flujo.

Resumen

La citometría de flujo se utiliza comúnmente para evaluar atributos críticos de calidad de las células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR T), incluyendo la viabilidad, el fenotipo y la eficiencia de la transducción. Los flujos de trabajo convencionales de reactivos líquidos requieren múltiples pasos de preparación, lo que puede introducir variabilidad y diferencias en el manejo dependiente del operador. Los paneles de anticuerpos recombinantes recombinantes preformulados y secos ofrecen un formato alternativo que combina tecnología de anticuerpos recombinantes con una configuración lista para usar. Los anticuerpos recombinantes ofrecen especificidad definida y una variabilidad reducida de un lote a otro, mientras que el formato seco reduce los pasos de preparación y simplifica el manejo de los reactivos. Aquí presentamos un flujo de trabajo paso a paso para el análisis de células CAR T utilizando paneles de anticuerpos recombinantes secos. El protocolo incluye tinción de muestras, adquisición de datos y análisis, y va acompañado de una visión esquemática del flujo de trabajo. Se muestran resultados representativos de tinción que ilustran la aplicación de paneles, y se destacan las diferencias en el tiempo de trabajo práctico respecto a un flujo de trabajo convencional de reactivos líquidos. Los ejemplos proporcionados demuestran cómo estos paneles pueden utilizarse para agilizar la caracterización multiparamétrica de las células T CAR. En conjunto, este trabajo proporciona un marco práctico para implementar paneles de anticuerpos recombinantes secos en el análisis de células CAR T basadas en citometría de flujo.

Introducción

Las terapias con células CAR T han surgido como un avance importante en el tratamiento del cáncer, especialmente para las malignidades hematológicas. Este enfoque utiliza el propio sistema inmunitario del paciente modificando las células T para expresar receptores de antígenos quiméricos (CARs) que reconocen y atacan las células^{cancerosas 1}. Sin embargo, la infraestructura altamente compleja y los procesos de fabricación intensivos en mano de obra necesarios para producir células CAR T hacen que una caracterización rigurosa y estandarizada sea esencial para garantizar tanto la calidad del producto como la seguridad del paciente. Una parte sustancial del coste total de la terapia CAR T proviene del extenso trabajo de laboratorio y los procedimientos de control de calidad (QC), muchos de los cuales implican flujos de trabajo manuales y en varios pasos. En este contexto, parámetros clave de caracterización—como la eficiencia de la transducción y las pruebas de identidad—son cruciales para evaluar el potencial terapéutico de las células^modificadas. Los métodos tradicionales de tinción líquida en citometría de flujo, comúnmente utilizados para estas evaluaciones, presentan varios desafíos. La variabilidad en el pipeteo, los problemas de estabilidad de los reactivos y el sesgo del operador pueden provocar inconsistencias e inexactitudes en los datos, comprometiendo potencialmente la fiabilidad de los^{resultados 3}.

La citometría de flujo es una tecnología fundamental para la caracterización y control de calidad de las células CAR T, permitiendo un análisis detallado de múltiples parámetros celulares. Sin embargo, el uso convencional de reactivos líquidos en este proceso está plagado de posibles riesgos ^4,5. La variabilidad del pipeteo puede introducir errores significativos, especialmente cuando se trata de volúmenes pequeños y múltiples reactivos. Además, los reactivos líquidos son susceptibles a la degradación con el tiempo, lo que puede comprometer su estabilidad y producir resultados de tinción^{inconsistentes 6}. El sesgo del operador, derivado de la preparación y manipulación manual, agrava aún más estos problemas, lo que puede llevar a la variabilidad de los resultados entre laboratorios e incluso dentro de las etapas del mismo laboratorio. Atributos críticos de calidad como la viabilidad celular, la frecuencia de transducción, el recuento de CD3⁺ e identidad son esenciales para la liberación segura de productos CAR T. Garantizar la precisión y consistencia de estas mediciones es vital, ya que afectan directamente a la eficacia terapéutica y seguridad de las células CAR^{T 1}. Por ejemplo, una evaluación precisa de la frecuencia de transducción es crucial para determinar la proporción de células T modificadas con éxito para expresar la CAR, mientras que el recuento y el porcentaje de CD3⁺ proporcionan información sobre la composición y pureza general de la población de células T.

Los paneles de anticuerpos secos ofrecen una solución prometedora a estos retos, ya que proporcionan una entrega consistente de los reactivos y reducen el tiempo de instalación y el riesgo de error. Estos paneles están compuestos por múltiples anticuerpos que se secaron a partir de cócteles premezclados. Tras el secado, estos paneles son estables y están listos para su uso, eliminando la necesidad de pasos complejos de preparación y minimizando el potencial de error humano ^6,7. Es importante destacar que no es necesario reconstituir estos paneles secos antes de su uso: las suspensiones celulares pueden añadirse directamente a la mezcla de anticuerpos secos. La incorporación de anticuerpos recombinantes en estos formatos secos ofrece varias ventajas frente a los reactivos policlonales convencionales o derivados de hibridomas. Su estructura definida molecularmente garantiza una alta consistencia y reproducibilidad de lote a lote, reduciendo la variabilidad entre experimentos y laboratorios. Una región de Fc diseñada basada en IgG1 humana minimiza la reactividad cruzada y la tinción de fondo. Como consecuencia, no se requiere bloqueo de Fc, lo que reduce aún más el tiempo necesario para realizar el ensayo citométrico de flujo. El formato seco protege a los reactivos de la degradación, manteniendo su eficacia a lo largo del tiempo y entre lotes. Esta consistencia es crucial para lograr resultados fiables y reproducibles en los ensayos de citometría^{de flujo 8}.

La aplicabilidad de los formatos de reactivos secos se extiende a varias etapas del desarrollo y monitorización de la terapia con células CAR T. En el control de calidad de fabricación, los reactivos secos facilitan el muestreo en sistemas cerrados, asegurando esterilidad y consistencia. Esto es especialmente importante en un entorno clínico, donde mantener la integridad de la muestra es fundamental⁹. Para la caracterización del producto, los reactivos secos permiten una evaluación precisa de los recuentos absolutos y subconjuntos inmunitarios, cruciales para determinar la calidad terapéutica de las células T CAR. Además, en entornos de investigación, los reactivos secos son invaluables para el seguimiento longitudinal del paciente, permitiendo un seguimiento consistente de la persistencia de las células CAR T a lo largo del tiempo, lo cual es fundamental para comprender la eficacia y seguridad a largo plazo de la terapia.

Las ventajas de usar paneles de anticuerpos secos en citometría de flujo son múltiples, siendo una de las más importantes su capacidad para reducir errores de pipeteo proporcionando un panel completamente preconfigurado en lugar de requerir que los reactivos individuales sean resuspendidos y combinados manualmente. A diferencia de los anticuerpos secos individuales —que aún necesitan ser reconstituidos y pipeteados y, por tanto, ofrecen principalmente una vida útil prolongada—, los paneles secos preensamblados eliminan múltiples pasos manuales de preparación. Esto agiliza el flujo de trabajo, minimizando significativamente las oportunidades de variabilidad dependiente del operador. Como resultado, el proceso global se vuelve menos propenso a errores, menos tardado y menos dependiente de una formación técnica extensa, lo que lo hace accesible a una gama más amplia de^{laboratorios 10}. Además, el formato estable y listo para usar de los paneles de anticuerpos recombinantes secos garantiza un rendimiento consistente y fiable en el ensayo entre operadores y^{ubicaciones 9}.

Para aprovechar plenamente el potencial de la tecnología de reactivos secos en citometría de flujo, es esencial desarrollar un protocolo paso a paso para su uso. Esto incluye directrices para el tinte de paneles secos, adquisición y análisis automatizado, asegurando que todos los aspectos del proceso estén estandarizados y optimizados para mayor precisión y eficiencia. Al proporcionar un protocolo claro y completo, los laboratorios pueden lograr resultados consistentes y fiables, facilitando la liberación segura y eficaz de productos de células CAR^{T 2}. Aquí, ofrecemos un protocolo que aprovecha las ventajas de los paneles de anticuerpos secos para abordar las limitaciones de los métodos tradicionales de tinción líquida, mejorando así la fiabilidad, eficiencia y reproducibilidad, características clave para garantizar terapias seguras y eficaces con células CAR T (Figura 1).

Protocolo

Todas las muestras humanas se recogieron de voluntarios anónimos sanos tras obtener el consentimiento informado por escrito. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética del Ärztekammer Nordrhein (#2020272) y se llevaron a cabo de acuerdo con las normativas éticas y de bioseguridad requeridas.

1. Recogida y preparación de muestras

1. Recoger muestras de células del Receptor de Antígenos Quiméricos T (CAR T) de forma aséptica de las bolsas de procesamiento para el control de calidad de fabricación.
2. Procesa las muestras rápidamente para mantener la viabilidad celular. Guarda las muestras a 2–8 °C, protegidas de la luz, hasta que se teñan.
3. Determina el número de celda de cada muestra antes de teñir.
4. Ajustar cada muestra a una concentración de hasta 10^{células nucleadas de 6} por 100 μL utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS)/2 mM de EDTA/0,5% de tampón BSA, pH 7,2.
   1. Si es necesario, centrifuga las muestras a 300 × g . durante 5 minutos. Aspira completamente el sobrenadante.
   2. Resuspende las células a la concentración adecuada.

2. Tinción de paneles secos

NOTA: Se utilizan dos paneles de anticuerpos secos preformulados para teñir muestras: el cóctel recombinante de células inmunitarias (ICC) seco, humano, y el cóctel de transducción recombinante CAR T seco, humano. La tinción CAR para el panel de transducción CAR T es fundamental. Se requiere una separación fiable de las células CAR-negativas y CAR-positivas para determinar con precisión la frecuencia de transducción. El lavado puede reducir la recuperación celular debido a la pérdida celular durante la centrifugación y aspiración. Por ello, generalmente se prefieren los protocolos de no-lavado cuando se requiere una concentración celular precisa.

1. ICC Cocktail (protocolo sin lavado)
   1. Añade 100 μL de la suspensión de células preparadas directamente al tubo de anticuerpos ICC seco. Mezcla pipeteando arriba y abajo y/o brevemente en vórtice para disolver completamente el pellet. Incubar durante 10 minutos a oscuridad a temperatura ambiente (19–25 °C).
   2. Confirma que el pellet de anticuerpos seco está completamente disuelto. Proceder directamente a la adquisición sin un lavado de líquidos.
2. Cóctel de transducción CAR T (protocolo de lavado)
   1. Añadir 100 μL de la suspensión de celda preparada al tubo de transducción CAR T seco.
   2. Añade el volumen adecuado de reactivo de detección CAR (por ejemplo, 2 μL). Mezcla pipeteando arriba y abajo y/o brevemente en vórtice para disolver completamente el pellet. Incubar durante 10 minutos a oscuridad a temperatura ambiente (19–25 °C). Confirma que el pellet de anticuerpos seco está completamente disuelto.
   3. Lava las células añadiendo 1 mL de tampón. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos. Elimina completamente el sobrenadante.
3. Tinción secundaria (si es necesario)
   1. Realizar un segundo lavado (véase el paso 2.2.3) para reactivos de detección CAR marcados con biotina para eliminar reactivos libres conjugados con biotina y reducir la mancha de fondo.
   2. Resuspende las células en 98 μL de tampón. Añade 2 μL de anticuerpo secundario marcado con ficoeritrina (PE). Vórtice para mezclar brevemente. Incubar durante 10 minutos a oscuridad a temperatura ambiente (19–25 °C).
   3. Lava las células para eliminar el anticuerpo secundario no unido (véase el paso 2.2.3).
4. Preparación final para la adquisición
   1. Ajusta el volumen de todas las muestras teñidas (CAR T Transduction Cocktail y ICC Cocktail) a 300–500 μL con buffer. Protege las muestras de la luz y mantén entre 2 y 8 °C.
   2. Realizar la adquisición en un plazo de 1 hora para mantener la estabilidad del fluoróforo y preservar la viabilidad celular.

3. Adquisición citométrica de flujo y análisis de datos

1. Prepara y prepara el citómetro de flujo, asegurando que la calibración y los ajustes del instrumento estén optimizados.
2. Enciende los láseres y enjuaga el sistema fluídico. Deja al menos 30 minutos para que el banco óptico se caliente.
3. Durante el calentamiento, ejecuta un programa de limpieza con una solución de hipoclorito al 1%.
4. Usa perlas de calibración para ajustar los ajustes del láser.
5. Prepara controles con una sola tinción para compensación usando conjuntos de anticuerpos compatibles.
   1. Para las cuentas: añade un volumen adecuado de cuentas de control positivo y negativo.
   2. Para las celdas: añade 100 μL de suspensión celular.
   3. Para reactivos conjugados con biotina: incluye un tubo con 98 μL de tampón más 2 μL de anticuerpo secundario marcado con PE.
   4. Verifica que los reactivos de compensación coincidan con el cóctel de anticuerpos (números de lote).
6. Incubar controles durante 10–20 segundos, vórtice durante 5 segundos y luego incubar 10 minutos en la oscuridad a 19–25 °C.
7. Diluye las muestras con 600 μL de tampón y mezcla bien.
8. Configura la compensación usando controles de una sola tinta.
9. Ajusta los voltajes FSC y SSC y define umbrales para excluir los residuos.
10. Adquirir al menos entre 50.000 y 100.000 linfocitos vivos por muestra.
11. Realizar gating para evaluar la viabilidad, la expresión de CD3 y la expresión CAR.
12. Para la cuantificación absoluta, determina la fracción de células T CAR-positivas (f₍CAR T₎).
13. Defina los leucocitos totales (N₍total₎) como ^CD45+ viables, células individuales tras la exclusión de restos.
14. Mide el recuento total de leucocitos mediante conteo directo a partir de muestras teñidas con ICC si el instrumento lo respalda, o utilizando perlas de conteo o un analizador hematólogo.
15. Calcular la concentración de células T CAR:
    
    NOTA: Ejemplo de cálculo con valores de la Figura 2 y la Figura 3
    ​
    
16. Aplica este método para la cuantificación de células T CAR en diferentes instrumentos y flujos de trabajo.

Resultados

Se aplicaron paneles de anticuerpos recombinantes secos a muestras de células T CAR⁺ para demostrar los flujos de trabajo de tinción por citometría de flujo. Como se ilustra en la Figura 1, sustituir los flujos de trabajo convencionales de reactivos líquidos por paneles de anticuerpos secos preformulados elimina varios pasos de preparación, incluyendo el marcado del tubo (para indicar la composición de anticuerpos del panel; cada tubo sigue requiriendo el ID de muestra adecuado), la combinación de reactivos y la mezcla manual, simplificando así el proceso de tinción. Los tubos incluyen una etiqueta que puede escanearse con citómetros compatibles o leerse manualmente, proporcionando opciones flexibles para la identificación de muestras.

Ejemplos representativos muestran que el panel de composición de células inmunitarias secas permite identificar subconjuntos clave de leucocitos (Figura 2), mientras que el panel de transducción CAR T seca permite visualizar las células T que expresan CAR y evaluar la transducción (Figura 3). No se requiere bloqueo de Fc para estos paneles, y solo se necesita un único control isotipo para todos los anticuerpos del panel. Estos ejemplos destacan la aplicación de paneles secos para el análisis multiparamétrico de células T CAR y demuestran cómo el flujo de trabajo puede ejecutarse de forma eficiente con menos pasos prácticos. La composición de los paneles de anticuerpos secos utilizados en este estudio se proporciona en la Tabla 1.

La Figura 4 ilustra la reducción del tiempo de preparación para un experimento representativo al utilizar paneles secos tanto para usuarios menos experimentados como experimentados. El formato secado agiliza los procedimientos de manchado, minimiza el manejo manual y proporciona orientación práctica para la implementación y formación de flujos de trabajo. Es importante destacar que el uso de cócteles de anticuerpos secos produjo frecuencias de subconjuntos de células inmunitarias comparables a las obtenidas con cócteles líquidos convencionales (Figura 5). Además, los paneles de anticuerpos secos son estables a temperatura ambiente y pueden almacenarse en condiciones ambientales durante toda su vida útil de un año, a diferencia de los anticuerpos líquidos convencionales, que normalmente requieren almacenamiento en frío. Esta estabilidad permite el uso repetido, estudios a largo plazo y una gestión simplificada del inventario.

En conclusión, los ejemplos proporcionados demuestran cómo los paneles de anticuerpos recombinantes secos pueden utilizarse para agilizar la caracterización multiparamétrica de las células T CAR. En conjunto, este trabajo proporciona un enfoque práctico para implementar paneles de anticuerpos secos en análisis de células CAR T basadas en citometría de flujo, con un manejo simplificado, reducción de pasos de preparación y configuraciones de paneles adaptables.

Figura 1: Comparación entre el flujo de trabajo de tinción manual y los paneles de anticuerpos recombinantes secos. El flujo de trabajo manual tradicional (top) implica múltiples pasos de preparación, incluyendo el etiquetado de los tubos, la combinación y mezcla de reactivos, y la adición de muestras, lo que puede aumentar el esfuerzo práctico. En cambio, el flujo de trabajo de panel de anticuerpos recombinantes secos (inferior) utiliza paneles premezclados y secos que solo requieren la adición de la muestra. Este enfoque simplificado reduce los pasos manuales y simplifica el proceso de tinte, ilustrando la eficiencia del flujo de trabajo y la implementación práctica. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Análisis citométrico de flujo de una muestra de leucaferesis teñida con el panel de anticuerpos recombinantes secos "Cóctel de Composición Celular Inmunitaria". (A) Los residuos se excluyeron mediante gating en FSC frente a SSC para incluir todas las células. (B) Se retiraron los dobletes usando una compuerta FSC-A frente a FSC-H. (C) Los leucocitos se identificaron mediante la entrada de células CD45⁺ , permitiendo la exclusión de eritrocitos residuales. (D) Las células muertas se excluyeron mediante tinción 7-AAD. (E,F) Se identificaron las células CD3⁺ y se clasificaron posteriormente en células T (E) y células NKT (F) basándose en la expresión de CD56. (G) Las células T se separaron posteriormente en subconjuntos CD4⁺ y CD8⁺ . (H) Dentro de la población CD3^– , los monocitos se definieron por la expresión de CD14 y las células B por la expresión de CD19. (I) Las células restantes CD14^–/CD19^– se subdividieron en células SSC alta/CD16^– eosinófilas, SSC alta/CD16⁺ neutrófilos y SSC baja/CD56⁺/CD16⁺ . Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Análisis citométrico de flujo de células CAR T CD19 (FMC63) teñidas con el panel de anticuerpos recombinantes secos "CAR T Transduction Cocktail". (A) Se excluyeron los residuos mediante gating en FSC frente a SSC para incluir todas las células. (B) Se retiraron los dobletes usando una compuerta FSC-A frente a FSC-H. (C) Los leucocitos fueron identificados mediante gating en células CD45⁺ . (D) Se excluyeron células muertas basándose en la tinción con 7-AAD⁻ . (E,F) Se identificaron células CD3⁺ y posteriormente se separaron en poblaciones ^CAR+ y ^CAR− . (G) Las células ^CAR+ y (H) ^CAR− se subdividieron además en subconjuntos de células T CD4⁺ y CD8⁺ . (I) Dentro de la población CD3⁻ , los monocitos residuales se definieron por expresión CD14. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Ahorro de tiempo logrado con paneles de anticuerpos secos a través de los niveles de experiencia. Para usuarios no experimentados (izquierda) y experimentados (derecha), se evaluó el tiempo necesario para establecer un experimento citométrico de flujo (panel de anticuerpos recombinantes secos "Cóctel de Composición Celular Inmunitaria", triplicados técnicos) desde el inicio del experimento hasta el inicio de la incubación, incluyendo el manejo de reactivos, pipeteo y documentación. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Análisis de citometría de flujo de sangre entera lisada, superposición de una muestra teñida con el panel de anticuerpos recombinantes secos "Cóctel de Composición Celular Inmunitaria" (azul) y una muestra teñida con los mismos anticuerpos en formato líquido (naranja). (A) Se excluyeron los residuos mediante la gratificación en FSC frente a SSC para incluir todas las células. (B) Se retiraron los dobletes usando una compuerta FSC-A frente a FSC-H. (C) Los leucocitos se identificaron mediante la entrada en células CD45⁺, excluyendo así los eritrocitos residuales. (D) Las células muertas se excluyeron mediante tinción 7-AAD. Se identificaron ^células CD3+ (E). (F) Estas células se clasificaron entonces en células T y células NKT basándose en la expresión de CD56. (G) Las células T se separaron posteriormente en subconjuntos CD4⁺ y CD8⁺. (H) Dentro de la población CD3^–, los monocitos se definieron por la expresión de CD14 y las células B por la expresión de CD19. (I) Las células restantes CD14^–/CD19^– se subdividieron en células SSC alta/CD16^– eosinófilas, SSC alta/CD16⁺ neutrófilos y SSC baja/CD56⁺/CD16⁺. (J) Se compararon frecuencias obtenidas con anticuerpos líquidos y paneles de reactivos secos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Propósito	V1 VioBlue	V2 VioGreen	B1 FITC	Educación física B2	B3 7-AAD PerCP-Vio 700	B4 PE-Vio770	R1 APC	R2 APC-Vio770
Determinación de la viabilidad celular y composición de las células inmunitarias	CD45	CD4	CD3	CD56/CD16	7-AAD	CD19	CD14	CD8
Determinación de la eficiencia de transducción de células T CAR	CD45	CD4	CD3	Reactivo de detección CAR	7-AAD	/	CD14	CD8

Tabla 1: Composición de los paneles de anticuerpos recombinantes secos utilizados para el análisis de células CAR T. Esta tabla enumera los anticuerpos incluidos en cada panel seco, especificando el antígeno objetivo, clon, fluorocromo y la cantidad típica por tubo. Se muestran dos paneles: el panel "Composición Celular Inmunita" para la identificación de los principales subconjuntos leucocitos, y el panel "Transducción T CAR" para la detección de la expresión de CAR y la caracterización de subconjuntos de células T. La información proporciona una referencia para la implementación del flujo de trabajo y la adaptación opcional con anticuerpos adicionales conjugados en líquido.

Discusión

Los paneles de anticuerpos recombinantes secos proporcionan un flujo de trabajo eficiente y práctico para la caracterización de células CAR T en laboratorio. El formato preformulado reduce los pasos de preparación y simplifica el manejo, ayudando a limitar la variabilidad dependiente del operador y apoyando la ejecución consistente de procedimientos de citometría de flujo^{multiparamétrico 8}. Ejemplos representativos ilustran el uso de estos paneles para identificar subconjuntos de leucocitos, detectar la expresión de CAR y evaluar subconjuntos de células T. Los paneles también pueden complementarse con anticuerpos conjugados líquidos adicionales para incluir marcadores adicionales o subconjuntos inmunitarios, permitiendo una adaptación flexible a necesidades experimentales específicas o análisis de parámetros superiores.

La detección precisa de CAR es fundamental para la determinación fiable de la frecuencia de^{transducción 1}. La separación clara de poblaciones CAR-negativas y CAR-positivas depende de condiciones de tinción adecuadamente optimizadas, especialmente cuando los niveles de expresión de CAR varían. Controles como las muestras de fluorescencia menos uno (FMO) pueden soportar una programación precisa de la filtración. En algunos casos, los pasos de lavado pueden mejorar la discriminación al eliminar anticuerpos no unidos; sin embargo, estos pasos pueden reducir la recuperación celular debido a la pérdida celular durante la centrifugación y la aspiración. Por lo tanto, pueden preferirse flujos de trabajo sin lavado cuando se requiere una cuantificación precisa de las celdas.

Aunque el enfoque idealmente utiliza un reactivo de detección específico para CAR que reconoce el dominio extracelular del CAR modificado, también se pueden emplear reactivos alternativos, como anticuerpos que apunten a regiones de enlace conservadas entre los dominios de unión al antígeno y señalización. Estas alternativas permiten la detección de células que expresan CAR y pueden incorporarse en flujos de trabajo donde no hay reactivos específicos de CAR, con la optimización adecuada.

La integración con sistemas automatizados de adquisición y análisis, incluido el Modo Exprés, puede agilizar aún más la recogida y el análisis de datos, reduciendo el tiempo de trabajo práctico y permitiendo la ejecución coherente de flujos de trabajo entre operadores.

Aunque este trabajo ilustra el método, no se ha realizado validación formal de ensayos para fabricación regulada o pruebas de liberación. Aún no se ha realizado la validación multicéntrica, por lo que la reproducibilidad entre laboratorios aún está por^{confirmarse 5}. El enfoque se basa en paneles preformulados, lo que puede limitar la flexibilidad para aplicaciones altamente especializadas. Sin embargo, las opciones de paneles secados a medida pueden diseñarse para incluir marcadores o combinaciones específicas, permitiendo flujos de trabajo personalizados y superando las limitaciones de los paneles estándar. Las consideraciones de coste se equilibran en gran medida con una reducción del tiempo de trabajo práctico y procedimientos simplificados, lo que puede ser especialmente ventajoso en flujos de trabajo de alto rendimiento.

Los trabajos futuros podrían centrarse en evaluaciones cuantitativas del rendimiento, validación formal para uso regulado y expansión a estudios multicéntricos para evaluar la consistencia del flujo de trabajo entre laboratorios. El diseño personalizado de paneles representa una vía práctica para ampliar la cobertura de marcadores, abordar preguntas experimentales únicas o adaptarse a estudios longitudinales de inmunomonitorización.

En resumen, los paneles de anticuerpos recombinantes secos proporcionan una plataforma flexible y práctica para la citometría de flujo de células CAR T. Reducen los pasos de preparación, simplifican los flujos de trabajo y permiten un diseño experimental flexible, incluyendo configuraciones personalizadas de paneles.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(Opcional) Biotin Antibody, PE, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-951	Solo se necesita si se utiliza un Reagente de Detección CAR conjugado con Biotina.
(Opcional) CAR T Cell Express Mode Package	Miltenyi Biotec	160-002-376	Complemento de software para MACSQuant Analyzers; permite el gating automatizado y análisis de datos, aunque también es posible el análisis manual.
Reagente de Detección CAR de elección detectable en el canal PE, por ejemplo, CD19 CAR Detection Reagent, humano, Biotina	Miltenyi Biotec	130-129- 550	Opciones alternativas: CD19 CAR FMC63 Idiotype Antibody, PE, REAfinity (130-127-342); CD22 CAR Detection Reagent, humano, Biotina (130-126-727); BCMA CAR Detection Reagent, humano, PE (130-133-888)
Flujómetro, por ejemplo, MACSQuant Analyzer 16	Miltenyi Biotec	130-109-803	Los tubos StainExpress son compatibles con todos los flujocitómetros estándar.
StainExpress CAR T Transduction Cocktail, humano	Miltenyi Biotec	130-127-638	Las configuraciones personalizadas de panel de anticuerpos secos pueden solicitarse a través de su representante local de Miltenyi Biotec o equipo de soporte técnico.
StainExpress Immune Cell Composition Cocktail, humano	Miltenyi Biotec	130-127-637	Las configuraciones personalizadas de panel de anticuerpos secos pueden solicitarse a través de su representante local de Miltenyi Biotec o equipo de soporte técnico.