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Artículo de método

Análisis morfométricos de la forma: la caja de herramientas de software de análisis para la cuantificación de formas craneofaciales en peces cebra

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DOI:

10.3791/70345

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27 de febrero de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville, 2Department of Pediatrics, Section of Developmental Biology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

En este artículo

Resumen

Este trabajo describe un protocolo para cuantificar la forma del cartílago craneofacial utilizando software libre (tpsDigs2, MorphoJ y PAST) para medir cambios en la estructura facial en larvas de pez cebra.

Resumen

Los trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF) se caracterizan por un conjunto variable de discapacidades físicas, cognitivas y conductuales causadas por la exposición prenatal al etanol, incluidas aquellas que afectan al esqueleto facial. Los loci genéticos sensibles al etanol contribuyen a este alto grado de variación en el TEAF, lo que complica los análisis de la forma facial. Anteriormente hemos demostrado que podemos analizar estos cambios en la forma facial derivados de las interacciones gen-etanol en peces cebra. Los peces cebra son un modelo ideal para analizar esta variación por varias razones; (i) el 70% de los genes son ortólogos entre humanos y peces cebra; (ii) la fertilización externa permite a los investigadores controlar el momento y la dosificación de los tratamientos con etanol; (iii) la estructura de su esqueleto facial se conserva con vertebrados; (iv) las larvas translúcidas permiten la visualización directa de los cambios en la estructura esquelética craneofacial durante el desarrollo. Sin embargo, analizar la forma del esqueleto craneofacial puede ser difícil de evaluar completamente mediante medidas lineales simples, ya que estas no capturan los cambios generales de forma. Además, los cambios en el tamaño de la cabeza pueden complicar la interpretación de los datos. Para abordar esto, adoptamos un enfoque morfométrico, analizando la forma general de la cara mediante análisis de componentes principales mediante software gratuito, tpsDigs2, MorphoJ y PAST. La combinación de este software permite la comparación por pares de la morfología facial general. Aquí, exponemos nuestro enfoque y análisis de la forma facial en mutantes cebra tratados con etanol utilizando estos programas para realizar una serie de análisis estadísticos multivariantes complementarios.

Introducción

Los trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF) se caracterizan por una amplia gama de defectos del desarrollo, incluyendo conductuales, neurológicos yfísicos 1,2. Entre estos defectos físicos se incluyen defectos craneofaciales, como la hipoplasiamandibular 3,4,5,6. Aunque el momento y la dosis de exposición al etanol contribuyen a la compleja etiología del TEAF, la contribución genética juega un papel significativo en la etiología delTEAF 6,7,8,9,10,11,12. Esta combinación de factores hace que estudiar defectos faciales en cohortes humanas sea complicado. Para estudiar el impacto de la exposición prenatal al etanol en el desarrollo, utilizamos el modelo del pez cebra. El pez cebra sirve como un modelo sólido para el TEAF, ya que comparten un 70% de ortólogos génicos con los humanos, 82% de los genes causantes de enfermedadesconocidos 13,14,15,16. Además de la conservación genética, los peces cebra: (i) tienen una fecundidad alta, lo que permite producir varias larvas de pez cebra a la vez, (ii) sufren fertilización externa, lo que permite el estudio directo de procesos de desarrollo sensibles al etanol, (iii) tienen un desarrollo craneofacial vertebrado altamente conservado y estereotipado, y (iv) son embriones/larvas translúcidas que permiten la visualización de estructuras óseas17. Anteriormente hemos demostrado que las mutaciones en muchos genes diferentes del pez cebra sensibilizan a los embriones a defectos faciales inducidos por etanol, y estos defectos pueden ser sutiles y difíciles de identificar a simple vista10,18. Además, observamos que las larvas salvajes tratadas con etanol también presentan cambios leves en la región craneofacial en comparación con las larvas silvestres no tratadas, aunque estos cambios son difíciles de identificar a simplevista 10. Aunque estos cambios pasan desapercibidos a simple vista, pudimos mostrar estos cambios en la forma facial inducidos por etanol utilizando análisis morfométricos disponibles en imágenes 2D del viscerocranio10.

La cara es una estructura 3D compleja que es difícil de medir con mediciones lineales convencionales. Estas medidas lineales simples no tienen en cuenta la posición relativa de cada estructura medida ni su impacto en las demás estructuras medidas de la cara. Los análisis morfométricos abordan estas limitaciones utilizando configuraciones de forma mediante puntos de referencia que tienen en cuenta la posición relativa de todas las estructuras medidas, incluso controlando las diferencias generales en tamaño18, 19 y 20. Este enfoque da como resultado datos más precisos, con mayor resolución y mucho más fáciles de visualizar, lo que puede dar resultados que quizá no se observen con mediciones linealesconvencionales 18,19,20. Además, los enfoques morfométricos pueden realizar comparaciones directas entre y dentro de grupos utilizando métodos estadísticos multivariantes. Aquí describimos el uso del software morfométrico gratuito tpsUtil, tpsDigs221, MorphoJ20 y Paleontological Statistics (PAST)22, en combinación con imágenes 2D del viscerocranio en heterocigotos salvajes y larvas de tipo silvestre y larvas sin tratar ni tratados con etanol para el gen de la Proteína Morfogenética Ósea (Bmp) bmp7a. Aunque estos programas se han utilizado principalmente en campos de paleontología y ecología, cuando se usan en conjunto, proporcionan un análisis exhaustivo de la forma facial. En última instancia, en este protocolo, mostramos cómo utilizar estas aplicaciones de software gratuitas para cuantificar los cambios en la forma del cartílago craneofacial en el modelo del pez cebra.

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Protocolo

Todas las larvas de pez cebra utilizadas en este procedimiento fueron criadas y criadas siguiendo los protocolos establecidos de IACUC aprobados por la Universidad deLouisville 23.

NOTA: En este estudio se usaron la cepa de pez cebra bmp7aty68a24 y hermanos de tipo salvaje (todos en el fondo AB), manteniendo los peces adultos a 28,5 °C con un ciclo claro/oscuro de 14/10 horas. Utiliza las líneas adecuadas según los resultados experimentales deseados. Usa agua que haya sido esterilizada por ósmosis inversa. El sexo como variable biológica no se aplica a las etapas de desarrollo estudiadas, ya que el sexo se detecta por primera vez en peces cebra alrededor de 20-25 días después de la fertilización (dpf)25, tras todos los análisis.

1. Tratamiento con etanol

  1. Recoger huevos de cruces heterocigotos y estadio morfológico a los embriones segúnlo descrito 23.
  2. Clasificar los embriones en grupos de muestra de 100 y crecer a 28,5 °C según los puntos de desarrollo deseados. Incubar todos los grupos en medio embrionario (EM)10,18.
  3. A las 6 horas de la fertilización (hpf), cambia la EM por EM fresca o EM que contenga 1% de etanol (v/v). A 24 hpf, lavar el EM que contiene etanol con tres cambios frescos deEM 10,18.

2. Manchas faciales e imágenes

  1. Fijar las larvas de pez cebra a 5 dpf y teñir con azul alciano, marcando el cartílago (Figura 1) como se describióanteriormente 26.
  2. Tomemos imágenes de montaje completo, vista ventral, campo claro del viscerocranio, montando larvas como se describióanteriormente 27.
  3. Brevemente, monta peces, superficie ventral hacia arriba, en la solución al 50% de glicerol del final de la tinción de Alcian Blue.
    NOTA: Los ajustes en los microscopios compuestos pueden variar; Utiliza los ajustes apropiados a las estructuras de imagen deseadas. En este estudio se utilizó un microscopio compuesto Olympus BX53 para generar todas las imágenes analizadas. Las imágenes se tomaron con una ampliación de 10x.

3. Genotipado

  1. Retirar las colas de 5 larvas de dpf tras la tinción de cartílago azul Alciano como se describióanteriormente 18.
  2. Separa las cabezas y colas de las larvas. Mantén las cabezas en almacenamiento de glicerol al 50% para más adelante en las imágenes.
  3. Lisa las colas con 5 μL de Proteinasa K (10 mg/mL) para extraer gDNA.
  4. Realiza una PCR en el ADN g de cada muestra utilizando cebadores dirigidos al gen de interés para amplificar las regiones que contienen el SNP.
  5. Digiera el producto de PCR utilizando la digestión de ADN basada en endonucleasas de restricción para diferenciar alelos mutantes de tipo salvaje basándose en el SNP y así identificar el SNP. Divide las muestras por genotipo en grupos agrupados y haz la imagen para su análisis.
    NOTA: Para este trabajo, el SNP fue amplificado en bmp7a y genotipado usando BslI (NEB).

4. Software utilizado para análisis de formas

  1. Utiliza tpsUtil y tpsDig221, y MorphoJ20 (https://sbmorphometrics.org) para el análisis morfométrico de larvas teñidas con alcianos, y el software de análisis MorphoJ y Paleontological Statistics Package for Education and Data Analysis (https://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/) () para todos los análisis estadísticos.
    NOTA: El software tpsUtil se encuentra en el enlace "Programas utilitarios", el software tpsDig2 en el enlace "adquisición de datos" y MorphoJ en el enlace "Programas integrales" en https://sbmorphometrics.org. La resolución de problemas de cada software se puede encontrar fácilmente tanto en línea, en múltiples plataformas como dentro del propio software. Se generaron el Análisis de Componentes Principales (PCA), el Análisis de Variables Canónicas (CVA), Procrustes ANOVA y gráficos de alambre de variación facial usando MorphoJ, y se realizaron una prueba multivariante de normalidad y un análisis multivariante de varianza (MANOVA) usando PAST.

5. Obtener imágenes del esqueleto facial de forma consistente para todas las muestras a analizar

  1. Asegúrate de que las imágenes del esqueleto facial se tomen con la misma configuración del microscopio y se guarden como archivos .tif.
    NOTA: La configuración del microscopio varía según la configuración y funcionalidad del microscopio y las muestras/tejidos que se van a tomar imágenes. La clave es un montaje consistente del microscopio y la preparación de la muestra.
  2. Guarda archivos en una sola carpeta etiquetada para identificar completamente el experimento.

6. Preparar imágenes con el software tps

  1. Abre el bloc de notas y selecciona Guardar como. Desde aquí, haz clic en todos los archivos al final. Guarda el archivo como "experiment-name.tps" y guárdalo en la carpeta que contiene todas las imágenes a analizar.

7. Introducción de imágenes en el software tps

  1. Abre el software tpsUtil. A continuación, baja Operación y selecciona el archivo Compilar tps desde la pestaña de imágenes .
  2. Desde esta pestaña, haz clic en input y abre el archivo que contiene las imágenes. Haz clic en la primera imagen del archivo y selecciona Abrir.
  3. Selecciona la pestaña de salida , seguida del archivo del bloc de notas de TPS, y guarda. Cuando se te pida que reemplaces el archivo, selecciona sí.
  4. A continuación, haz clic en la pestaña de configurar y crea. Ve al archivo para ver si las imágenes han sido añadidas.

8. Añadir puntos de referencia a las imágenes

  1. Abre tpsDigs2 y abre las siguientes pestañas en orden: Fuente de entrada, archivo y luego el archivo guardado de tps Notepad.
  2. A continuación, haz clic en opciones para visualizar la opción de herramientas de imagen . Aquí, asegúrate de poner la longitud de referencia en 100 μm. Pulsa set scale.
    NOTA: No escales en relación con la escala de la imagen.
  3. Al configurar la escala, pulsa ok para establecer parámetros y luego sal de las herramientas de imagen.
  4. En este punto, añade puntos de referencia a cada imagen para analizar y obtener un análisis morfológico adecuado haciendo clic en el símbolo de apuntado.
  5. Asegúrate de que los puntos de referencia estén colocados en el mismo orden para cada imagen. Se colocaron puntos de referencia en las siguientes articulaciones entre los elementos del cartílago (véase la Figura 1E, E'):
    1. Articulación mediana entre los cartílagos de Meckel (Punto de referencia #1, Figura 1E, E').
    2. Las articulaciones bilaterales entre los cartílagos de Meckel y los palatocuadrados (Puntos de referencia #2, Figura 1E, E').
    3. Articulación mediana entre los cartílagos ceratohiales (Punto de referencia #3, Figuras 1E, E').
    4. Las articulaciones bilaterales entre los cartílagos palatocuadrado y ceratohial (Puntos de referencia #4, Figura 1E, E').
    5. El extremo distal de los cartílagos hiomandibulares (Puntos de referencia #5, Figura 1E, E').
  6. Después de colocar puntos de referencia en una imagen, haz clic en archivos para el menú desplegable. Sigue este camino para guardar datos y luego sobrescribir.
  7. Salir de tpsDigs2.

9. Uso de MorphoJ para analizar la forma mediante Procrustes ANOVA

  1. Abre el software MorphoJ.
  2. En preliminares, crea y nombra el conjunto de datos. Selecciona crear nuevo conjunto de datos y nombra el conjunto de datos. Luego, haz clic en tps y selecciona el bloc de notas con los nuevos puntos de datos añadidos del paso 8.4. Crea el conjunto de datos.
  3. Las imágenes están listas para ser vistas estadísticamente usando el ajuste de Procrustes. Selecciona el árbol de proyecto de lectura de pestañas y haz clic en el conjunto de datos. Selecciona los siguientes botones en este camino: preliminares, nuevo ajuste de Procrustes, Alinear por ejes principales y Realizar ajuste de Procrustes.
  4. Selecciona generar matriz de covarianza bajo preliminares; el software dirá coordenadas de Procruste. Ejecuta la función cuando te lo pidan.
  5. Selecciona crear o editar wireframe en preliminares y enlaza los puntos en las imágenes. Luego selecciona los puntos de enlace y acepta o crea la imagen. Edita clasificadores.
  6. Abre una hoja de cálculo manteniendo MorphoJ abierto. Añade toda la información necesaria, por ejemplo: Genotipo, Tratamiento, Genotipo y Tratamiento, Experimento, etc. Guarda la hoja de cálculo como un archivo CSV.
  7. En MorphoJ, haz clic en archivo e importa variables clasificadoras para seleccionar el archivo CSV. Después de abrir el archivo, vuelve al árbol del proyecto y haz clic en el conjunto de datos.
  8. Una vez abierto el conjunto de datos, haz clic en preliminares y edita clasificadores. Esto garantizará que todas las imágenes se añadan.
  9. Después, haz clic en árbol de proyectos, Covmatrix y luego en Variación en la parte superior.
  10. Selecciona Análisis de Componentes Principales para ver las puntuaciones del PC. Haz clic en puntuaciones de PC para ver el gráfico generado.
  11. Para añadir colores al gráfico, haz clic derecho y pulsa la elipsis de confianza para añadir el clasificador deseado. Pulsa los datos de color para añadir los colores, y vale para aceptar estos cambios.
    NOTA: Una vez que la pestaña de puntuación de PC se cierra y se reabra siguiendo las instrucciones del paso 9.10, los colores deben actualizarse.
  12. Para cambiar los colores del wireframe, ve a Preliminares. Haz clic en establecer opciones para el gráfico de formas, situado en la parte inferior de la pantalla. Selecciona gráficos de alambre para cambiar los colores de la forma objetivo, la forma inicial y los números.
  13. Selecciona Variación, luego Procrustes ANOVA.
  14. Exporta los resultados de la ANOVA de Procrustes al archivo de hoja de cálculo desde el paso 9.7.

10. Análisis de variables canónicas del conjunto de datos

  1. En MorphoJ, selecciona el conjunto de datos o proyecto original. Para comenzar el Análisis de Variables Canónicas (CVA), seleccione Comparación seguida de Análisis de Variables Canónicas. Selecciona la(s) variable(s) clasificadora(s) - selecciona Genotipo y Tratamiento y ejecuta la función.
  2. Para exportar CVA, haz clic en la pestaña de resultados y haz clic derecho en la página de resultados ahora abierta. Selecciona Exportar a Archivo y guarda la información.
  3. Haz clic en Árbol de Proyectos y selecciona CVA, luego en Puntuaciones. En la parte superior izquierda de la página, selecciona Archivo. Una vez abierta la pestaña Archivo , selecciona Exportar Conjunto de Datos y selecciona el tipo de dato y Genotipo y Tratamiento. Guarda las puntuaciones CVA como un archivo .txt.
  4. Para preparar el archivo para el software PAST, abre las puntuaciones CVA guardadas en Notepad o en un software equivalente. Cambia el ID en la esquina superior izquierda a Etiqueta para no confundir el software PASADO. Guarda las puntuaciones CVA editadas o equivalentes.

11. MANOVA en software PASADO

  1. Para importar las puntuaciones CVA en PAST, selecciona Archivo y luego Abrir para acceder a las puntuaciones CVA guardadas desde Notepad o equivalente. Cuando se abra la ventana Importar archivo de texto , selecciona Nombres, Datos para fila y columna, y tab para un separador. Selecciona Importar.
  2. En la pestaña Mostrar , selecciona Atributos de columna. Junto al botón de Tipo , abre el menú desplegable y selecciona Agrupar para la primera columna que debería contener la(s) variable(s) clasificadora(s).
  3. Resalta los datos del PC o los datos del CV. Selecciona Multivariante, Tests y Multivariate Normality para ejecutar la prueba de normalidad. Haz esta prueba en PC y CV por separado.
  4. Haz clic en la celda gris vacía en la esquina superior izquierda, sobre el tipo de escritura, para seleccionar todo el conjunto de datos. Selecciona Multivariante, Tests y MANOVA para procesar el MANOVA. Exporta los resultados de MANOVA al archivo de hoja de cálculo desde el paso 9.7.
    NOTA: El software proporcionará tanto los resultados resumen como los resultados por pares . Exporta o guarda ambos.

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Resultados

Para identificar los cambios de forma facial inducidos por etanol en peces cebra, combinamos aplicaciones de software disponibles gratuitamente para generar y cuantificar datos morfológicos del esqueleto facial. Se generaron embriones de peces portadores adultos heterocigotos de bmp7a y trataron con etanol de 6 a 24 hpf. Las larvas de estos cruces se fijaron a 5 dpf, y los cartílagos faciales se tiñeron con azul Alciano. Se tomaron imágenes del viscerocranio para cada larva de c...

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Discusión

El TEAF se caracteriza por una amplia variedad de defectos del desarrollo, incluidos defectos craneofaciales como la hipoplasia mandibular. El pez cebra es un modelo sólido para el TEAF debido a su conservación genética con los humanos, alta fecundidad, larvas translúcidas y fertilización externa. El pez cebra se ha utilizado durante décadas para estudiar tanto la formación del esqueleto craneofacial como el impacto del etanol en el desarrollo

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La investigación presentada en este artículo fue financiada por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional sobre el Abuso de Alcohol (NIH/NIAAA) R01AA031043 a C.B.L.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
tpsUtil, tpsDig2, MorphoJhttps://sbmorphometrics.orgSoftware gratuito - puede requerir permisos administrativos para descargarse
PASADOhttps://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/Software gratuito - puede requerir permisos administrativos para descargarse
Microscopio compuesto de campo brillanteOlimpoBX53

Referencias

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