Artículo de método

Generación del modelo ratón de activación inmune materna gestacional temprana para evaluar la inflamación prenatal en el neurodesarrollo

DOI:

10.3791/70352

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24 de marzo de 2026

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1Department of Cell Biology, College of Medicine, University of Oklahoma, 2Graduate Program in Neuroscience, College of Medicine, University of Oklahoma

En este artículo

Resumen

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El artículo proporciona un protocolo completo para generar un modelo murino de activación inmunitaria materna (MIA) para estudiar los efectos de la inflamación gestacional temprana en el neurodesarrollo, incluyendo métricas clave para garantizar la fiabilidad y reproducibilidad.

Resumen

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Los trastornos del neurodesarrollo (NDD) surgen de interacciones complejas entre factores de riesgo genéticos y ambientales, incluida la activación inmune prenatal. La activación inmune materna (MIA) en ratones es un modelo ampliamente utilizado para estudiar las contribuciones ambientales a las NDDs; La variabilidad en los resultados experimentales limita la reproducibilidad. Aquí presentamos un protocolo estandarizado para inducir la MIA durante la gestación temprana en el día embrionario 9,5 (E9,5) en ratones, incorporando múltiples métricas de control de calidad para evaluar la respuesta inmunitaria y predecir los resultados del embarazo. Tras la administración de ácido poliinosínico:policítidico (poli(I:C)), se cuantifican las citocinas séricas maternas para confirmar una activación inmunitaria robusta, permitiendo una métrica de exclusión para los respondedores bajos. Las trayectorias del peso materno de E0.5 a E12.5 predicen la viabilidad de la camada, con las presas que produjeron camadas mostrando patrones característicos de aumento de peso distintos de las que perdieron una camada. También observamos que el vendedor animal influyó significativamente en la respuesta inmunitaria materna y la viabilidad de camada, mientras que la formulación poli(I:C) no fue un factor relevante. En conjunto, el protocolo proporciona estrategias para mejorar la reproducibilidad del modelo de MIA gestacional temprana y la viabilidad de la descendencia mediante el seguimiento de la respuesta inmunitaria materna y los cambios en el peso, y controlando a los vendedores animales, para estudiar finalmente el efecto de la activación inmunitaria prenatal en el neurodesarrollo.

Introducción

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Los estudios actuales de asociación genómica identificaron cientos de alelos de riesgo, reordenamientos cromosómicos y variantes del número de copias que contribuyen a la susceptibilidad al trastorno neurodesarrollativo (NDD) 1,2,3,4,5. Sin embargo, las alteraciones genéticas convierten solo un pequeño grado de riesgo aumentado, y el gran número de variantes con asociaciones más fuertes afectan solo a un pequeño porcentaje de loscasos 6. Además, estudios epidemiológicos en humanos revelan que los factores de estrés en la vida temprana, como la inflamación prenatal, aumentan el riesgo de diagnóstico con unNDD 7,8,9. Por lo tanto, está bien establecido que los factores ambientales actúan en conjunto con los factores de riesgo genéticos en la etiología de los NDD, y los modelos murinos son una herramienta importante para desentrañar las contribuciones de factores de riesgo genéticos y ambientales en el desarrollo cerebral y el riesgo de enfermedades. Aunque los modelos animales que evalúan factores de riesgo genéticos para las NDD son ampliamente aceptados por sus resultados robustos y reproducibles, los modelos que evalúan riesgos ambientales tienen dificultades con una estandarización y variabilidad consistentes en los fenotipos resultantes, como diferencias conductuales o neuroanatómicas en descendenciaMIA 10,11,12,13,14,15,16,17. Por ejemplo, parámetros experimentales clave, como el momento gestacional del desafío inmunitario, la variabilidad en el tipo y la dosificación del estímulo inmunitario, las respuestas citoquinas maternas y la variabilidad de la camada, como la descendencia resistente y susceptible, influyen sustancialmente en los resultados experimentales, pero no siempre se abordan en las descripciones metodológicas. Aquí se presenta un protocolo estandarizado para generar activación inmunitaria materna (MIA) en ratones en fase de gestación temprana, incluyendo múltiples controles de calidad para garantizar el rigor y la reproducibilidad al estudiar cómo el estrés inmunitario en la vida temprana afecta al neurodesarrollo y a los resultados de salud.

Nuestros objetivos son presentar un protocolo para 1) mejorar la fiabilidad del modelo MIA y 2) caracterizar variables que puedan contribuir a la heterogeneidad experimental. En roedores, la MIA se induce comúnmente por la administración sistémica de estimulantes inmunitarios como el ácido poliinosínico:policítidico (poly(I:C)), un mimético viral, o lipopolisacárido (LPS), un mimético bacteriano, en varios momentos de gestación, incluyendo el día embrionario 9,5 (E9,5), E12,5, E15,5, E17,5 ymás 18,19. Estas manipulaciones inducen una respuesta robusta de citoquinas maternas que altera el neurodesarrollo fetal y conduce a fenotipos conductuales y moleculares indicativos de lasNDDs 20,21,22,23. Sin embargo, muchos estudios no evalúan rutinariamente la respuesta inmune materna, lo que dificulta confirmar la intensidad o consistencia de la inducción de la AM en losexperimentos 12, 14 y 24. Para abordar esto, establecimos múltiples métricas de control de calidad y fijamos un umbral para la respuesta materna de E9,5 MIA basado en los niveles de citocinas medidos en el suero materno tras la estimulación inmune poli(I:C). Nuestro enfoque permite una dosificación más precisa del estimulante inmunitario y la identificación y exclusión de personas con bajo o no respondedor, mejorando en última instancia la fiabilidad y robustez del modelo. Aunque rara vez se discute en el campo, la baja viabilidad de la camada es una limitación conocida del modelo MIA, especialmente con inducción en E9,5. Aunque la inducción a mitad de la gestación (E12.5) puede mejorar la viabilidad de la camada, nuestro objetivo es establecer puntos de control durante la inducción de la ACN gestacional temprana que ayuden a predecir la viabilidad de la camada y, además, identificar variables que mejoren el éxito reproductivo.

La MIA es un modelo valioso para estudiar los efectos ambientales en el neurodesarrollo porque, a diferencia de los modelos in vitro, que aíslan células de su entorno, la MIA utiliza el entorno in utero para estudiar los efectos en el neurodesarrollo de la descendencia. Aunque la MIA suele usarse sola para modelar las NDDs, también puede combinarse con modelos genéticos o factores adicionales de estrés en la vida temprana, ofreciendo una visión de la compleja interacción entre genes y entorno o de factores ambientales repetidos. Los estudios han combinado MIA con roedores que presentan variantes genéticas de riesgo de NDD, como DISC1, CNTNAP2 y SHANK3, para demostrar la interacción sinérgica entre el entorno y la genética 25,26,27,28,29. Además, un modelo de estrés ambiental "de dos impactos" combinó la desaparición con un segundo factor estresante en la vida temprana, como el estrés psicológico o la exposición a drogas en la adolescencia, lo que conducía posnatalmente al inicio o exacerbación de los fenotipos 30,31,32. En conjunto, estos enfoques destacan la versatilidad del modelo MIA, que puede usarse solo o en conjunto con otros factores de riesgo ambientales o genéticos.

Este artículo ofrece métodos paso a paso para inducir la MIA en ratones con el fin de estudiar los efectos de la inflamación prenatal en el neurodesarrollo. Incluye puntos de control para aumentar la reproducibilidad y comprender los distintos factores que afectan a la eficiencia de la MIA (Figura 1).

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Figura 1: Cronología de la generación de MIA. A las madres embarazadas cronometradas se les administra poli(I:C) o solución salina a E9,5, seguida de una extracción de sangre 3 horas después. Se recogen pesos maternos en E0.5, E9.5, E10.5, E11.5 y E12.5 para monitorizar la progresión del embarazo tras la inyección. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Protocolo

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Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las directrices éticas de la Universidad de Oklahoma y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Los animales se alojaban en jaulas ventiladas individualmente sobre cama de celulosa de 1/8 de pulgada con acceso improvisado a comida y agua, y enriquecimientos de jaulas que incluían un nido y una cabaña. La instalación de cría animal se mantiene con un ciclo de luz de 14 horas encendido y 10 horas apagado, de acuerdo con Jackson Laboratory, para reflejar el fotoperiodo de finales de primavera, una temporada pico de cría de ratones.

Consulte la Tabla 1 para los campos de datos específicos que se recogerán a lo largo del protocolo. Consulte la tabla de estadísticas suplementarias (Tabla Suplementaria 1) y GitHub (https://hayes-lab.github.io/2026_Camfield_JoVE/) para análisis estadísticos detallados.

Tabla 1: Ejemplo de hoja de recogida de datos. Plantilla de datos importantes para recopilar al generar el modelo MIA. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

1. Generación de embarazos programados

  1. Coloca dos hembras de 8-10 semanas, C57BL/6, con machos reproductores C57BL/6 a última hora de la tarde o por la noche. Utilizar machos experimentados de entre 2 y 10 meses que son aislados antes de la reproducción da lugar a embarazos más rápidos y fiables.
  2. Evalúa a las mujeres para detectar tapones vaginales a la mañana siguiente y continúa revisando una vez al día hasta que ocurra el tapón. Es importante destacar que las bujías son temporales y pueden caerse por la tarde si no se revisan por la mañana.
    NOTA: Para un protocolo detallado para la comprobación de plugs, consulte Behringer et al. (2016)33.
  3. Tras confirmar el implante vaginal, pesa a la hembra y registra el peso para monitorizar el estado del embarazo según el aumento de peso durante la gestación.
  4. Separar a las hembras conectadas en jaulas individuales y mantenerlas bajo condiciones estándar de vivienda con acceso improvisado a comida y agua. Designar a las hembras tapadas como embrionarios día 0,5 (E0,5). Registra la fecha del plug para asegurar un seguimiento preciso de la edad gestacional.

2. Preparación del ácido poliinosínico:policítidico (poly(I:C))

  1. Reconstituir el poli(I:C) liofilizado en una solución de stock de alta concentración (10-20 mg/mL) disolviéndola en solución salina o agua estéril según las instrucciones del fabricante, lo que da como resultado una solución transparente. Proveedor de discos, número de catálogo y número de lote de poli (I:C).
    NOTA: El poli(I:C) es un riesgo químico; manejar conforme a las directrices de bioseguridad institucional y deshacerse en recipientes adecuados de residuos de riesgo biológico utilizando el EPI adecuado para minimizar la exposición.
  2. Vórtice y diluir aún más a una solución de fondo de baja concentración (4 mg/mL) en solución salina. Para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación, agítalo volúmenes de un solo uso de material de baja concentración (~125 μL) en tubos de 1,5 mL y almacenal a -20 °C o -80 °C. Mantén el poliuretano reconstituido (I:C) sobre hielo durante la preparación y manipulación para minimizar la degradación.
    NOTA: Para una revisión exhaustiva sobre la variabilidad de poly(I:C), consulte Mueller et al. (2019)14.
  3. Inmediatamente antes de la inyección con E9.5, diluir la base de poli (I:C) de baja concentración (4 mg/mL) hasta la concentración de trabajo deseada (2 mg/mL) en solución salina estéril.
    NOTA: Las dosis típicas de inyección poli(I:C) en ratones oscilan entre ~5 y 20 mg/kg, pero la dosis óptima debe ser determinada empíricamente por cada investigador.
  4. Calentar el material de trabajo (2 mg/mL) a 65 °C durante 10 minutos para asegurar un recocido adecuado de la estructura de ARN de doble hebra.
  5. Mezclar mediante vórtices o pipeteo para asegurar que la solución sea homogénea antes de la inyección.

3. Inyección de poli(I:C)

  1. En la mañana de E9.5, pesa la presa para confirmar el embarazo y utiliza el peso para calcular el volumen de inyección de poli(I:C) para MIA y el volumen de inyección salina del 0,9% para controles (CON). En los resultados descritos, se obtiene una dosis de 10 mg/kg utilizando un volumen de inyección igual al 5× del peso corporal del animal. Se deben evitar inyecciones de más de 10 veces el peso del animal.
    E9,5 peso corporal * 5 = μL de poli(I:C) (a 2 mg/mL) o 0,9% de suero fisiológico
    NOTA: Se espera un aumento de peso típico de 2-3 gramos entre E0,5 y E9,5 para indicar un embarazo viable.
  2. Extrae el volumen adecuado de solución de trabajo poli(I:C) preparada (2 mg/mL) o solución salina en una jeringuilla estéril de calibre 27 o menor.
  3. Sujeta correctamente la presa para minimizar el dolor y la angustia. Inyecta la poli(I:C) o solución salina intraperitonealmente (IP) en el cuadrante inferior izquierdo o derecho, justo por encima del nivel de la cadera o en el segundo par de pezones. Desecha correctamente las jeringuillas en un recipiente designado para bioseguridad para objetos punzantes. Registra la parte de la inyección para mantener la consistencia entre la cohorte.
  4. Devuelve inmediatamente la presa a su jaula de origen y vigila si hay signos de malestar. Suplementa con hidrogel al menos 24 horas después de la inyección para evitar la deshidratación por conductas de enfermedad.
  5. Para asegurar una documentación exhaustiva, anote la dosis de poli(I:C), μL de poli(I:C) inyectada, fecha/hora de inyección, edad gestacional y número de lote de poli(I:C) utilizado (Tabla 1).

4. Extracción de sangre

  1. Tres horas después de la inyección, se observaron ratones individualmente durante 1 minuto. La presencia de cualquiera de los siguientes comportamientos, como reducción de actividad, postura encorvada, muecas faciales o heces acuosas, se registró en una escala de tres puntos (sin fenotipo, leve, prominente), y los ratones que mostraron uno o más comportamientos se clasificaron como presentadores de náuseas agudas.
    NOTA: No se deben observar conductas de enfermedad en las presas CON.
  2. Además, recoge cuidadosamente la sangre materna de las madres inyectadas mediante un método mínimamente invasivo, como la hemorragia de la cola, y devuélvelo a la jaula de casa. Procura recoger aproximadamente 50 μL de sangre para cuantificar las citocinas inflamatorias.
    NOTA: Todos los materiales que contacten con sangre deben considerarse biopeligrosos y eliminarse utilizando el EPI adecuado y conforme a las directrices de bioseguridad institucional.
  3. Deja que la sangre coagule durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25 °C). Centrifuga a 2.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para separar el suero del coágulo. La capa superior y transparente representa el suero, mientras que la bolita oscura en la parte inferior contiene el coágulo. Recoge cuidadosamente el suero sin alterar ni aspirar ninguna parte del coágulo. El suero puede almacenarse a -20 °C hasta estar listo para el análisis posterior de citocinas.

5. Seguimiento de presas inyectadas

  1. Pesa las barreras diariamente durante tres días después de la inyección (E10.5, E11.5 y E12.5) para monitorizar su respuesta a la poli(I:C). Es común observar una pérdida de peso de hasta 1 g al día siguiente de la inyección de poli(I:C) (E10.5), seguida de una recuperación gradual, con un peso que suele superar la línea base de E9.5 en E12.5.
    NOTA: Perder peso que supere 1 g o no recuperar peso antes de E12.5 suele ser señal de pérdida de camada.
  2. Durante el resto de la gestación, asegúrate de que las presas tengan acceso continuo a alimentos, agua y materiales para anidar. Además, limita la manipulación de animales o el movimiento de jaulas, ya que puede suponer un estrés adicional y contribuir a una menor viabilidad de la camada.
  3. El día del parto esperado (E19.5), registrar los resultados de la camada como tamaño de la camada, viabilidad del cachorro o ausencia de camada, indicando un embarazo fallido. Retirar rápidamente cualquier cachorro fallecido y deshacerse de ellos conforme a las directrices de bioseguridad institucional y a las directrices aprobadas por la IACUC para la eliminación de cadáveres animales.
    NOTA: Los desaparecidos pueden tener camadas de tamaño más pequeño y pueden experimentar complicaciones en el parto, lo que puede llevar a un parto tardío con E20.5.

6. Validación de la respuesta inmune

  1. Utilizando el suero materno recogido tras inyecciones de MIA y CON, cuantifiquen citocinas inflamatorias, como IL-6 o TNF-α, mediante ensayos inmunoenzimáticos ligados a enzimas (ELISA) o ensayos multiplexados según las instrucciones del fabricante. Las diluciones típicas del sérum son 1:100 para el suero MIA y 1:25 para el suero CON.
  2. Tras la cuantificación, utiliza los resultados para establecer un umbral representativo para la respuesta MIA. El umbral de MIA se define como una respuesta materna sérica de IL-6 superior a 1.000 pg/mL (aproximadamente un 25% menor que la respuesta media del grupo MIA), y cualquier presa MIA con respuestas por debajo de este umbral queda excluida del conjunto de datos como baja o no respondedora.
    NOTA: Las presas CON deben tener niveles de citoquinas muy bajos o indetectables; cualquier CON dam con niveles de citocinas superiores al 25% de la media del grupo CON (es decir, umbral de 250 pg/mL) debe ser excluida.

7. Análisis estadístico

  1. Realiza todos los análisis estadísticos utilizando el software estadístico R. Considera a la presa como la unidad biológica en todos los análisis. Define la significación estadística como p < 0,05. Los datos actuales son diagramas de caja que representan el rango mediano e intercuartílico (IQR; percentiles 25-75), los bigotes se extienden hasta 1,5 × IQR, y los puntos representan la presa individual.
  2. Evalúa la normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk para guiar la selección de análisis paramétricos o no paramétricos. Realizar comparaciones entre dos grupos independientes utilizando pruebas t de doble cara no emparejadas (normales) o pruebas de suma de rangos de Wilcoxon (no normales) según corresponda. Analizar mediciones pareadas dentro de los mismos animales (es decir, pesos) utilizando pruebas t pareadas (normales) o pruebas de rango por signos de Wilcoxon (no normales). Realizar pruebas de una muestra con una media de cero al evaluar el aumento relativo de peso en días embrionarios.
  3. Evalúa la relación entre los niveles maternos de IL-6 sérico y TNF-α utilizando la correlación de rango de Spearman. Utiliza la prueba exacta de Fisher para comparar la proporción de camadas exitosas entre proveedores y formulaciones poli(I:C). Consulte el resumen estadístico detallado proporcionado en la Tabla Suplementaria 1 y el código de análisis en GitHub (https://hayes-lab.github.io/2026_Camfield_JoVE/).

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Resultados

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Tras la administración de poli(I:C) o solución salina en E9.5, se evaluaron las citocinas séricas maternas para evaluar la eficiencia y robustez de la inducción de la MIA (Figura 2). Las presas MIA mostraron niveles significativamente aumentados de interleucina-6 (IL-6) en comparación con las presas CON (Figura 2A). Además, la evaluación de los niveles de IL-6 permitió excluir presas MIA que no alcanzaran el umbral predefinido d...

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Discusión

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En este protocolo, establecimos puntos de control para aumentar la eficiencia, robustez y reproducibilidad del modelo de activación inmunitaria materna (MIA) gestacional temprana, centrándose en las respuestas de citocinas maternas, trayectorias de peso y variables experimentales que influyen en los resultados del embarazo. Nuestros resultados demuestran que la MIA induce respuestas inmunitarias maternas variables, siendo la IL-6 un biomarcador fiable para identificar madres con activaci...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

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La investigación fue financiada generosamente por un K01 del NIH (K01AG087810), una beca de la iniciativa de embarazo Next Gen del Burroughs Wellcome Fund (1266845) y una beca piloto COBRE (P20GM134973). La Figura 1 fue creada con BioRender.com.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Báscula para animalesKent ScientificSCL-4000Para pesar ratones
Agujas e insulina BD Lo-Dose U-100 - 28GFisher Scientific14-826-79Para PIC, inyección intraperitoneal
Ratones hembra C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664Edad 10-12 semanas, hembras vírgenes
Ratones machos C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664Machos reproductores
Ratones hembras C57BL/6NCrlCharles River Laboratories027Edad 10-12 semanas, hembras vírgenes
Centrífuga (estándar de laboratorio de 24 posiciones)Eppendorf5425 RCentrifugación de sangre para recolectar suero
Plataforma de documentación de datos Airtable, Microsoft Excel, etc.Mantener registros de datos importantes, como pesos, hora de inyección, etc. (Tabla 1)
Baño seco digital - Un bloqueMedicus Health5277M1Usar para calentar PIC antes de la inyección
Tubos Eppendorf - 1.5 mLEppendorf30123611Usar al diluir PIC a concentraciones de stock y de trabajo
Gasas FisherbrandFisher ScientificMSD-1400250Usar para detener el sangrado de la cola después de la recolección de sangre
Sondas mallas Fisherbrand de 6 pulgadasFisher Scientific13-820-026Usar para el control de fugas
HydroGelClear H2070-01-5022Suplemento después de las inyecciones
Kit ELISA no recubierto para IL-6 de ratónThermo Fisher Scientific88-7064-88Cuantificar niveles de IL-6 en suero materno
Recipientes de polipropileno Griffin de bajo perfil NalgeneThermo Fisher Scientific1201-1000PKPoner ratones en el recipiente al momento de pesar
Poly(I:C) (LMW)Invivogentlrl-picwPIC (LMW) para inyección MIA
Sal sódica de ácido poliinosínico-policitidílicoSigmaP9582PIC (Sigma) para inyección MIA
Cuchillas de bisturí, #22, paquete de 10Home Science ToolsDE-SC22BLDUsar para cortar el extremo de la cola para recolectar sangre
Cloruro de sodio al 0.9% (solución salina normal), USP, grado estéril, Cytiva HycloneCytivaZ1376Inyectar para la generación de ratones de control
Plataforma para cortar colasBraintree Scientific, Inc.IL-200Restringe adecuadamente a los ratones durante las sangrías de cola
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc.SI-0236Vortexear PIC después de la dilución

Referencias

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