Artículo de método

PCR superpuesta en un solo paso para la síntesis rápida de plantillas de ADN de ARN de una sola guía para el sistema CRISPR

193 vistas

⸱

DOI:

10.3791/70369

⸱

24 de abril de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

En este artículo

Resumen

Un método de PCR superpuesta de un solo paso que utiliza cuatro cebadores permite la generación rápida y de bajo coste de plantillas de ADN para la transcripción in vitro de sgRNA. Una proporción optimizada de cebadores (50:5:1:50) produce sgRNAs de alta calidad en 5 horas, con validación funcional demostrada mediante ensayos in vitro y actividad de edición en HEK293T células.

Resumen

El sistema CRISPR–Cas ha revolucionado la edición genómica; sin embargo, los métodos convencionales para generar ARN de una sola guía (sgRNA) suelen implicar pasos de clonación que consumen mucho tiempo o costosos kits comerciales de síntesis. Se presenta una estrategia optimizada de PCR superpuesta en un solo paso para la síntesis rápida y rentable de plantillas de ADN para la transcripción in vitro de sgRNA. Utilizando cuatro cebadores parcialmente superpuestos que abarcan el promotor T7, la secuencia guía específica del objetivo y el andamiaje de sgRNA, se ensamblan plantillas de longitud completa en una sola reacción PCR sin clonación. La optimización experimental sistemática estableció una proporción óptima de cebadores (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50), minimizando subproductos inespecíficos y maximizando el rendimiento completo del producto, como confirma la electroforesis en gel de agarosa. Este enfoque se amplió con éxito para generar plantillas para sgRNA de Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9), demostrando aplicabilidad entre sistemas más allá de Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9). Aunque la síntesis química directa de sgRNAs ofrece ventajas como alta pureza, modificaciones químicas para mejorar la estabilidad y efectos fuera del objetivo, sigue siendo prohibitivamente costosa para aplicaciones de alto rendimiento o cribados a gran escala que requieren numerosos sgRNAs. Los ensayos de cliveja in vitro demostraron que los ARNguía generados mediante este método alcanzan eficiencias de edición comparables a las obtenidas mediante clonación convencional basada en plásmidos. Además, los complejos ribonucleoproteicos ensamblados con estos sgRNAs y entregados a las células HEK293T mediante electroporación resultaron en la formación detectable de indel en el locus objetivo, confirmando la funcionalidad in vivo. El análisis de costes indica que este método reduce sustancialmente los costes de preparación de plantillas en comparación con los kits comerciales de síntesis, al tiempo que reduce el tiempo de respuesta de días a horas, proporcionando así un enfoque accesible y escalable para los laboratorios dedicados a la investigación genética.

Introducción

El sistema CRISPR–Cas, derivado de un mecanismo inmunitario adaptativo en bacterias y arqueas, ha revolucionado la ingeniería genética al permitir una edición genómica precisa en diversos organismos 1,2. Un componente clave es el ARN de una sola guía (sgRNA), un ARN quimérico que dirige nucleasas Cas a loci genómicos específicos; su diseño modular permite la reorientación mediante la modificación de una secuencia protoespaciadora de aproximadamente 20 nucleótidos3. Más allá de SpCas9, se han adoptado ampliamente otras nucleasas de Cas con propiedades distintas. Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) es más pequeño, facilitando la administración del virus adenoasociado (AAV) y ampliando así las opcionesde administración 4. Cada sistema requiere arquitecturas específicas de ARN guía, lo que hace que un método de síntesis versátil sea muydeseable 3.

Los métodos tradicionales para generar ARNa guía funcional incluyen la clonación basada en plásmidos, kits comerciales de síntesis de sgRNA o síntesis comercial directa de sgRNAs 5,6. La clonación basada en plásmidos requiere múltiples pasos laboriosos —digestión por restricción, ligadura, transformación y cribado de colonias— que suelen durar más de 48 horas(2, 4, 6). Los kits comerciales de sgRNA, aunque ofrecen un flujo de trabajo optimizado (<5 h), siguen siendo prohibitivamente caros para aplicaciones de alto rendimiento y suelen costar entre 35 y 45 dólares por reacción. La síntesis química directa de sgRNAs ofrece ventajas como alta pureza, modificaciones químicas para mejorar la estabilidad y reducción de efectos fuera del objetivo7; sin embargo, es prohibitivamente cara (típicamente entre 200 y 280 dólares por sgRNA) para aplicaciones de alto rendimiento o cribado a gran escala que requieren cientos de sgRNAs.

En cambio, el método de PCR superpuesta de un solo paso descrito aquí completa la síntesis de plantilla en menos de 5 horas usando cebadores estándar a un coste de aproximadamente 5–8 dólares por sgRNA, lo que representa una reducción sustancial tanto en tiempo como en coste material. Además, los sgRNAs producidos por este método alcanzan eficiencias de edición comparables a las generadas por la clonación basada en plásmidos, como lo confirman ensayos de corte in vitro . Una comparación de estos enfoques se ilustra en la Figura 1.

La PCR de extensión por solapamiento (OE-PCR) proporciona una estrategia rápida e independiente de ligasas para ensamblar fragmentos deADN 8. Este enfoque se ha adaptado para la síntesis de plantillas de sgRNA utilizando cebadores superpuestos. En una reacción de un solo paso usando cuatro cebadores parcialmente superpuestos, se produce unión competitiva: los cebadores exteriores (AF1 y Tracr-R) definen los límites de amplificación, mientras que los cebadores interiores (AF2 y AF3) deben diluirse para asegurar una extensión ordenada desde ambos extremos hacia el centro. A pesar de este marco teórico, un parámetro crítico que afecta a la eficiencia del ensamblaje—la relación óptima de cebadores—no ha sido investigado sistemáticamente. Además, la aplicabilidad más amplia de estos métodos OE-PCR en diferentes sistemas CRISPR sigue sin explorarse.

Para abordar estas limitaciones, se diseñó un estudio para optimizar y validar un método de PCR superpuesta de un solo paso para la síntesis de plantillas de sgRNA. La proporción óptima de cebadores se estableció mediante un diseño experimental estructurado, utilizando electroforesis en gel de agarosa para identificar condiciones que producían un único producto de tamaño correcto. Tras la optimización, se evaluó la versatilidad del método en dos sistemas CRISPR ampliamente utilizados (SpCas9 y saCas9), con amplificación exitosa de ambas plantillas. La validación funcional mediante ensayos de corte in vitro demostró que los sgRNA generados con este método alcanzan eficiencias comparables a las obtenidas mediante clonación basada en plásmidos.

Para evaluar aún más la funcionalidad en un contexto celular, el ARNsgRNA de SpCas9 se complejó con la proteína Cas9 para formar complejos ribonucleoproteicoicos (RNP) y se entregó a HEK293T células mediante electroporación. La edición genómica en un locus endógeno se evaluó mediante un ensayo de endonucleasa T7 I (T7EI), con patrones de canalización en geles de agarosa que indican la formación detectable de indel in vivo. En conjunto, estos hallazgos demuestran que este método produce de forma fiable plantillas de ARNsgRNA funcionales de alta calidad. El siguiente protocolo describe el procedimiento detallado usando SpCas9 como ejemplo representativo, con plantillas de cebador proporcionadas para adaptarse a otras nucleasas de Cas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

El uso de la línea celular de HEK293T disponible comercialmente (ATCC CRL-3216) se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Ético del Primer Hospital Popular de la Ciudad de Chenzhou, Universidad del Sur de China, para el uso de líneas celulares de origen humano. Los reactivos, software y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Diseño de secuencias de sgRNA objetivo

  1. Identificar la región genómica objetivo utilizando herramientas online establecidas (por ejemplo, CRISPRscan, CHOPCHOP o Broad Institute CRISPick)3.
  2. Accede al servidor web de CHOPCHOP en https://chopchop.cbu.uib.no/ 3,9.
  3. Introduce la información del gen objetivo y selecciona el sistema CRISPR/Cas adecuado (por ejemplo, EGFR para CRISPR/Cas9) (Figura 2A).
  4. Revise la tabla de salida, incluyendo rango, secuencia objetivo, ubicación genómica, hebra, contenido de GC (%), auto-complementariedad, sitios fuera del objetivo predichos (MM0, MM1, MM2, MM3) y puntuación de eficiencia (Figura 2B).
  5. Seleccione una secuencia de ARN guía con alta eficiencia en el objetivo y baja actividad prevista fuera del objetivo.
  6. Registrar la secuencia final de sgRNA objetivo para el diseño del cebador (por ejemplo, secuencia objetivo EGFR: "CTTAATTCCTTGATAGCGACGG") (Figura 2B).

2. Síntesis y preparación de cuatro cebadores superpuestos

  1. Diseña cuatro cebadores oligonucleótidos (AF1, AF2, AF3, Tracr-R) con regiones superpuestas de la siguiente manera (Figura 3A):
    AF1: 5′–TTCTAATACGACTCACTATAG
    [objetivo seq] GTTTTAGAGCTAGAAATAG–3′
    AF2: 5′–GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
    TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC–3′
    AF3: 5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT–3′
    Tracr-R: 5′–AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC–3′
    NOTA: Sustituye [target seq] en el cebador AF1 por la secuencia obtenida en el paso 1.6.
  2. Sintetiza cebadores a escala de 25 nmol con purificación estándar por desal.
  3. Resuspende cebadores secos en agua sin nucleasas hasta una concentración de 100 μM. Centrifuga a 5000 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente.

3. Optimización de concentraciones de cebadores y PCR superpuesta en un solo paso para la síntesis de plantillas de sgRNA

  1. Preparar mezclas cebadoras con diferentes concentraciones de AF2 y AF3 según la Tabla 1. Mantener AF1 y Tracr-R a 10 μM.
  2. Prepara las reacciones PCR en tubos libres de nucleasa de 0,2 mL según la Tabla 2. Utiliza una ADN polimerasa de alta fidelidad.
  3. Mezcla suavemente pipeteando cinco veces. No pongas vórtice. Centrifuga a 5000 × g durante 1 minuto.
  4. Ejecuta la PCR usando las condiciones de ciclo descritas en la Tabla 3.

4. Electroforesis y recuperación de plantillas de ADN

  1. Prepara un gel de agarosa al 2% disolviendo 2 g de agarosa en 100 mL de tampón TAE de 1× TAE. Enfría a 50–60 °C, añade tinción de ácido nucleico de 5 μL y funda el gel.
  2. Deja que el gel se solidifique durante 30 minutos a temperatura ambiente.
  3. Carga un producto PCR de 10 μL mezclado con 2 μL de tampón de carga de 6×. Incluye una escalera de ADN de 100 pb.
  4. Haz electroforesis a 100 V durante 30–40 minutos.
  5. Visualiza bajo iluminación UV. Confirma que la Condición 9 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50) produce una sola banda de ~120 bp (Figura 4A).
  6. Utiliza concentraciones optimizadas de cebador: AF1 10 μM, AF2 1 μM, AF3 0,2 μM, Tracr-R 10 μM.
  7. Elimina la banda objetivo con un bisturí estéril. Limita la exposición a los rayos UV a ≤30 s.
    NOTA: Conserva las rodajas de gel a −20 °C durante hasta una semana o procede inmediatamente.

5. Purificación de plantillas de ADN

  1. Purifica el ADN usando un kit de extracción en gel según las instrucciones delfabricante 10.
  2. Elute ADN en agua precalentada (60 °C) libre de nucleasas de 20 a 30 μL.
  3. Medir la concentración de ADN. Rendimiento típico: 15–50 ng/μL; A260/A280: 1,8–2,0.
    NOTA: Almacenar ADN purificado a −20 °C durante hasta 1 año.

6. Transcripción in vitro y purificación de sgRNA

  1. Ensamblar la reacción de transcripción usando un kit de síntesis de ARN T7 (Tabla 4). Preparar sobre hielo11.
    NOTA: Utilice materiales libres de RNasa y descontamine todas las superficies.
  2. Incubar a 37 °C durante 16 horas.
  3. Añade 1 μL de DNasa I e incuba a 37 °C durante 15 minutos.
  4. Purifica el ARNsg usando un kit de limpieza deARN 12.
  5. Elute en agua libre de nucleasa de 30–50 μL.
  6. Cuantificar sgRNA. Rendimiento esperado: 700–900 ng/μL; A260/A280: 1,9–2,1.
    NOTA: Almacenar sgRNA a −80 °C durante un máximo de 1 año.

7. Ensayo de corte in vitro para verificar la actividad del sgRNA

  1. Preparar y purificar el ADN objetivo. Ajustar la concentración a 60 ng/μL13.
  2. Ensamblar la reacción de escisión (Tabla 5): preincubar sin ADN a 25 °C durante 30 minutos. Incluir un control negativo.
  3. Añade 1 μL de ADN objetivo.
  4. Incuba a 37 °C durante 2 horas.
  5. Añade 4 μL de buffer de carga de 6× para detener la reacción.
  6. Haz correr los productos con un gel de agarosa al 2% a 100 V durante 30–40 minutos.
  7. Visualiza bajo luz ultravioleta. Confirma la cliveja (por ejemplo, 617 pb→ 414 pbb + 203 pb) (Figura 4C).

8. Validación celular de la edición guiada por sgRNA en Cas9

  1. Prepara el complejo ribonucleoproteico (RNP) mezclando la proteína Cas9 y el ARNsgDNA en una proporción molar de 1:2. Combina 10 μL de Cas9 (4 mg/mL), 280 μL de ARNsgDNA (60 ng/μL) y 200 μL de DMEM. Incuba durante 15 minutos.
  2. Cultiva HEK293T células hasta ~80% de confluencia. Cosecha y ajusta a 3 × 106 células por muestra.
  3. Combina el complejo RNP con las células e incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  4. Transfiere a una cuveta de electroporación de 2 mm. Electropora a 115 V, 4 ms, un pulso (575 V/cm). Añade inmediatamente 10 mL de medio completo y transfiera a una placa de 6 pozos.
  5. Incubar a 37 °C con 5% deCO2 durante 48 horas.
  6. Extraer ADN genómico de células tratadas y de control. Mide la concentración.
    NOTA: Almacenar ADN a −20 °C durante hasta 6 meses.
  7. Amplificar el locus objetivo mediante PCR (Tabla 6 y Tabla 7).
    NOTA: Tamaño esperado del producto: 617 pb para EGFR.
  8. Verifica los productos de PCR en un gel de agarosa al 2%. Purifica la banda correcta y cuantifica el ADN.
  9. Realizar la formación heterodúplex (Tabla 8 y Tabla 9).
  10. Añadir 1 μL de Endonucleasa T7 I e incubar a 37 °C durante 15 minutos. Inactivar a 85 °C durante 10 minutos.
  11. Añade el buffer de carga y funciona con un gel de agarosa al 2%.
  12. Visualiza bajo luz ultravioleta. Confirma la formación de indel (617 pb → 414 pb + 203 pb) (Figura 4D).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

La aplicación exitosa del protocolo PCR superpuesta de un solo paso produce una única banda de ADN afilada del tamaño esperado cuando se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa.

Las relaciones subóptimas de cebadores, especialmente aquellas con concentraciones excesivas de cebadores internos (AF2 y AF3), resultan en bandas adicionales mayores que el producto esperado, indicando amplificación inespecífica o formación cebador-dímero, junto con bandas t...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Se describe un protocolo simplificado y económico para sintetizar plantillas de ADN de ARNsgs mediante una estrategia de PCR superpuesta de un solo paso. Este método elimina la necesidad de construcción y clonación de plásmidos, reduciendo el tiempo de preparación de la plantilla de varios días a aproximadamente 5 horas. Un aspecto clave de este enfoque es la optimización sistemática de la proporción cebadora, determinada en 50:5:1:50 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R), correspondiente a con...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Investigación en Salud de la Comisión Provincial de Salud de Hunan (subvención número W20243264), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hunan (subvención número 2023JJ50368), el Proyecto Clave de Investigación del Departamento de Educación de la Provincia de Hunan (subvención número 24A0607) y el Proyecto de Equipo Innovador del Primer Hospital Popular de Chenzhou (subvención número CX202103).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
100 bp DNA LadderTIANGENMD109Marcador de tamaño de ADN para electroforesis
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849MReactivo de amplificación PCR
50 bp DNA LadderTIANGENMD108Marcador de tamaño de ADN para fragmentos pequeños
6DNA loading bufferTIANGEN1109565Buffer de carga de muestras para electroforesis
Agarose Gel DNA Recovery KitTIANGENDP219Purificación de ADN de gel de agarosa
Agarose I Thermo Scientific 17850Preparación de gel de agarosa
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicHerramienta de diseño de sgRNA
CentrifugeHENGNUO2-16RCentrifugación de muestras
Certified Copper Fetal Bovine SerumUmedium, Beijing BioTopped Technology Co., Ltd3023ASuplemento para cultivo celular
CH3CO2HShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA758682Reactivos para la preparación de la solución de tampón TAE
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/Herramienta de diseño de sgRNA
CO2 incubatorThermo Scientific51032874Incubación de cultivo celular de mamíferos
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/Herramienta de diseño de sgRNA
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)KeyGEN BioTECHKGL1211-500Medio de cultivo celular
dsDNaseThermo Scientific EN0771Eliminación de la plantilla de ADN después de la transcripción
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTXECM830Electroporación de células
EDTA Na2BioSharpBS108Reactivos para la preparación de la solución de tampón TAE
Electric thermostatic water bathSHANGHAI SUMSUNG LABORATORY INSTRUMENT CO.,LTDDKD8Incubación con control de temperatura
Electrophoresis Apparatus TrophoresisLIUYIDYCP-31BNElectroforesis en gel de agarosa
Gel Imaging analysis systemShanghHai JiaPengZF-258Visualización y análisis de gel
GenCRISPR SpCas9GenScriptZ03624-GMP-2.5Núcleasa Cas9 para la edición genómica
Genomic DNA extraction kitTIANGENYDP304Aislamiento de ADN genómico
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNEBE2040STranscripción in vitro de sgRNA
MiniAmp ThermocyclerThermo Scientific A37834Amplificación PCR
NanoDrop 2000c SpectrophotometerThermo Scientific 2000cCuantificación de ácidos nucleicos
Nucleic acid stain (e.g., GeneRed)TIANGENRT211Visualización de ADN en gel de agarosa
PCR Using Q5 Quick-Load High-Fidelity 2X Master MixNEBM0578Amplificación PCR de alta fidelidad
Primers (AF1, AF2, AF3, Tracr-R)GenScriptOligonucleótidos para el ensamblaje de plantillas de sgRNA
Tris-baseBioSharpBS083Reactivos para la preparación de la solución de tampón TAE
VAHTS RNA Clean BeadsVAHTSN412-01Purificación de ARN

Referencias

  1. Tamura, R., Kamiyama, D. CRISPR-Cas9-mediated knock-in approach to insert the GFP(11) tag into the genome of a human cell line. Methods Mol Biol. 2564, 185-201 (2023).
  2. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Graf, R., Li, X., Chu, V. T., Rajewsky, K. sgRNA sequence motifs blocking efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Cell Rep. 26 (5), 1098 (2019).
  7. Hendel, A., et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 985-989 (2015).
  8. Brunetti, L., et al. Highly efficient gene disruption of murine and human hematopoietic progenitor cells by CRISPR/Cas9. J Vis Exp. (134), e57278 (2018).
  9. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  10. Bien, H. . Qiagen QIAquick gel extraction kit (28704 and 28706), centrifuge processing. , (2015).
  11. MalagodaPathiranage, K., Banerjee, R., Martin, C. T. A new approach to RNA synthesis: immobilization of stably and functionally co-tethered promoter DNA and T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 52 (17), 10607-10618 (2024).
  12. Xiao, G., et al. Direct detection from sputum for drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using a CRISPR-Cas14a-based approach. BMC Microbiol. 25 (1), 188 (2025).
  13. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
  14. Hu, Z., et al. Customized one-step preparation of sgRNA transcription templates via overlapping PCR using short primers and their application in vitro and in vivo gene editing. Cell Biosci. 9 (1), 25 (2019).
  15. Pan, C., et al. A new method to synthesize multiple gRNA libraries and functional mapping of mammalian H3K4me3 regions. Nucleic Acids Res. 51 (9), e52 (2023).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR guide RNA cloning for mammalian systems. J Vis Exp. (140), e57998 (2018).
  19. Basila, M., Kelley, M. L., Smith, A. V. B. Minimal 2'-O-methyl phosphorothioate linkage modification pattern of synthetic guide RNAs for increased stability and efficient CRISPR-Cas9 gene editing avoiding cellular toxicity. PLoS One. 12 (11), e0188593 (2017).
  20. Kratschmer, C., Levy, M. Effect of chemical modifications on aptamer stability in serum. Nucleic Acid Ther. 27 (6), 335-344 (2017).
  21. Maio, G., et al. Systematic optimization and modification of a DNA aptamer with 2'-O-methyl RNA analogues. ChemistrySelect. 2 (7), 2335-2340 (2017).
  22. Pasternak, A., et al. A chemical synthesis of LNA-2,6-diaminopurine riboside, and the influence of 2'-O-methyl-2,6-diaminopurine and LNA-2,6-diaminopurine ribosides on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 35 (12), 4055-4063 (2007).
  23. Shang, Z., et al. CRISPR/Cas12a with Universal crRNA for Indiscriminate Virus Detection. Molecules. 29 (24), 5842 (2024).
  24. Wang, Z., et al. crRNA scaffold remodeling controls CRISPR–Cas12a activity for enhanced performance. Nucleic Acids Res. 54 (5), 2310-2325 (2026).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

S ntesis del molde de ADNtranscripci n in vitrooptimizaci n de cebadoreselectroforesis en gel de agarosacomplejo ribonucleoproteicoelectroporaci nedici n gen mica

Artículos relacionados