Se procesaron muestras de tejido de endarterectomía coronaria para aislar núcleos individuales utilizando un protocolo de disociación optimizado. La integridad de los núcleos aislados se validó mediante tres enfoques complementarios: tinción de exclusión con azul de tripán para evaluar la integridad de membrana, microscopía confocal basada en DAPI para confirmar la morfología nuclear y citometría de flujo para cuantificar el rendimiento y pureza nuclear.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aislamiento de núcleo único a partir de tejido endorerectomo coronario de pacientes con bypass de arteria coronaria
En este artículo
Resumen
Resumen
La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica y progresiva caracterizada por la acumulación de placa en las paredes de las arterias. Durante la progresión de la formación de placas, ciertas lesiones se vuelven inestables, denominadas placas de alto riesgo, y pueden causar infarto de miocardio (IM). Una placa aterosclerótica está compuesta por células musculares lisas, células endoteliales, células inmunitarias, células grasas y células necróticas, cualquiera de las cuales puede causar la ruptura de la placa. Es fundamental estudiar la heterogeneidad celular dentro de las placas ateroscleróticas para comprender mejor los mecanismos subyacentes a la inestabilidad de la placa. Presentamos un protocolo fácilmente reproducible para aislar y validar núcleos de tejido endarterectomo coronario humano obtenido de pacientes sometidos a cirugía de bypass de arteria coronaria (CABG). Todos los tejidos se mantienen sobre hielo húmedo en un medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) para preservar la integridad celular antes de la extracción. Las muestras de tejido se pican finamente y luego se interrumpen suavemente con un micro mortero en el tampón de lisis para lisar células y liberar núcleos. Los núcleos aislados se evalúan entonces para asegurar su integridad y rendimiento utilizando el ensayo de exclusión de azul de tripán en un microscopio invertido compuesto. La tinción DAPI permite la visualización de núcleos intactos mediante microscopía confocal, y la citometría de flujo proporciona cuantificación basada en fluorescencia para evaluar el rendimiento del aislamiento nuclear y validar la población nuclear. A diferencia de los métodos tradicionales de aislamiento mediante disociación unicelular, el aislamiento nuclear reduce el estrés celular y mantiene el entorno transcriptómico nativo, evitando así cambios en la expresión génica. La preparación nuclear de alta calidad obtenida mediante este método es compatible con aplicaciones posteriores como la secuenciación de ARN de núcleo único (snRNA-seq).
Introducción
La enfermedad cardiovascular aterosclerótica (ECCV) es la principal causa mundial de muerte y discapacidad y, a pesar de los importantes avances terapéuticos, su carga sigue sindisminuir. La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica de la pared arterial, impulsada por interacciones complejas y dinámicas entre diversas poblaciones celulares que, en conjunto, orquestan la progresión silenciosa desde la enfermedad subclínica temprana hasta eventos cardiovasculares (CV) que alteranla vida 2.
En arterias medianas y grandes, la acumulación de depósitos de colesterol dentro de los macrófagos es una característica distintiva de laaterosclerosis 3. La placa aterosclerótica está compuesta por ácidos grasos, colesterol, células inflamatorias, calcio, fibrina, células musculares lisas, células endoteliales y residuos celulares dentro delsubendotelio 4. Las placas ateroscleróticas se clasifican en dos tipos: de bajo riesgo y de alto riesgo. Las placas de alto riesgo se identifican por su tendencia a desencadenar un evento cardiovascular posterior, normalmente a través de mecanismos como la erosión o ruptura deplacas 5.
Las características de las placas de alto riesgo incluyen grandes núcleos lipídicos, varias células inflamatorias, menos células musculares lisas, una fina capa fibrosa, microcalcificación, hemorragia intraplaca, neovasos y un núcleonecrótico 6. La detección de placas de alto riesgo se realiza clínicamente utilizando modalidades de imagen no invasivas e invasivas, a saber, tomografía coronaria (CCTA) y tomografía de coherencia óptica (OCT), respectivamente 7,8. A pesar de los numerosos avances en la imagen cardiovascular, sigue siendo difícil predecir la ruptura de la placa aterosclerótica que causa el infarto de miocardio (IM), y no siempre es útil en entornosclínicos.
A pesar de décadas de investigación, seguimos careciendo de biomarcadores circulantes fiables que puedan identificar específicamente los fenotipos de placas de alto riesgo, dejando una laguna crítica en nuestro manejo clínico de la aterosclerosis. Esto subraya la necesidad de estrategias moleculares que puedan caracterizar estas placas a un nivel biológico másfundamental 7,10. En este contexto, los marcadores basados en ARN han ganado considerable atención, ya que pueden capturar la compleja actividad transcripcional que ocurre en el microambiente de la placa11. Los desarrollos recientes en secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) han demostrado ser especialmente potentes, ofreciendo una resolución sin precedentes para perfilar células individuales dentro de placas ateroscleróticas y descubrir poblaciones celulares distintas, patrones de expresión génica y vías moleculares que subyacen a la vulnerabilidad ala placa 12,13. A pesar de estos avances, existe poco conocimiento sobre los procesos reguladores, las interacciones e la importancia funcional de los distintos tipos celulares implicados en el desarrollo de laaterosclerosis.
Cuando la carga aterosclerótica es severa y difusa, la revascularización quirúrgica se convierte en la estrategia definitiva de tratamiento. La endarterectomía coronaria (EC) es un complemento quirúrgico a la cirugía de bypass de arteria coronaria (CABG) en la que la placa aterosclerótica se elimina mecánicamente de arterias coronarias difusamente enfermas para permitir el injerto de bypass y lograr la revascularización completadel miocardio 15,16. Las placas ateroscleróticas y las muestras de endarterectomia son especialmente difíciles de manejar porque contienen abundante tejido necrótico, depósitos lipídicos, fibrina y calcificaciones. Cuando estos tejidos se descomponen para su análisis, generan una cantidad considerable de residuos que obstruyen los filtros y los sistemas microfluídicos, haciendo que el aislamiento de células individuales viables sea extremadamentedifícil 17,18. De hecho, un estudio de placa carótida encontró que las células viables representaban menos del 1% de todas las partículas tras el procesamiento del tejido; El resto era simplemente escombrosde placa 18.
Para agravar aún más este desafío, las placas ateroscleróticas existen en un estado de estrés metabólico y oxidativo crónico, donde las células que sufren apoptosis, senescencia y otros procesos degenerativos hacen que las membranas celulares sean cada vez más frágiles y susceptibles a la alteración, haciendo que el aislamiento de células individuales viables sea extremadamentedifícil 18,19,20 . La digestión mecánica y enzimática necesaria para preparar las muestras para el scRNA-seq a menudo daña estas células ya comprometidas, reduciendo aún más la viabilidad y resultando en bajas tasas de captura celular. Este proceso también tiende a perder selectivamente poblaciones celulares frágiles o raras, lo que introduce un sesgo significativo tanto en los datos transcriptómicos como en los tipos celulares representados en los resultados finales. Este problema se agrava aún más en placas calcificadas o gravemente enfermas, donde las duras condiciones de procesamiento necesarias para descomponer el tejido causan daños adicionales a la viabilidadcelular 18,21,22.
En contraste, el núcleo permanece estructuralmente intacto incluso bajo estas condicionesadversas 23. Esto se debe principalmente a la envoltura nuclear, una doble capa lipídica reforzada por laminas nucleares (Lamin A/C y Lamin B), que proporciona rigidez mecánica y resistencia a las tensiones osmóticas, enzimáticas y físicas que alteran fácilmente la membranaplasmática 24,25. La lámina nuclear también preserva la morfología nuclear incluso cuando el citoplasma circundante está gravementecomprometido 26. Esto convierte la secuenciación de ARN de núcleo único (snRNA-seq) una alternativa más práctica y fiable a la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) para el perfilado de tejido aterosclerótico27. Al capturar información transcripcional de núcleos intactos en lugar de células enteras, snRNA-seq evita las limitaciones impuestas por la baja viabilidad celular y el alto contenido de residuos, permitiendo un perfil transcriptómico más preciso y completo del microambientede la placa 18.
Por ello, en este estudio, presentamos un protocolo optimizado de aislamiento de núcleos desarrollado específicamente para el tejido de endarterectomía coronaria, que incorpora lisis no iónica basada en detergentes y una duración de lisis ajustada empíricamente según el grado de calcificación tisular, para obtener consistentemente núcleos de alta calidad con integridad estructural y de ARN preservada, adecuada para el análisis posterior de snRNA-seq.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
El presente estudio se realizó con aprobación y conforme a las directrices del Comité de Ética Humana del Instituto de Cardiología y Centro de Investigación de la ONU Mehta (EC/Aprobación/26/Cardio/14/12/2024) y de la Universidad de Biotecnología de Gujarat (GBU_IHEC/2023/006). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes antes de la recogida de la muestra. Para el estudio actual se seleccionaron los pacientes sometidos a una cirugía de bypass de arteria coronaria con endarterectomía coronaria. Tras la extirpación quirúrgica, el tejido endoarterectomía se colocó inmediatamente en un medio RPMI sin suero, se mantuvo a 4 °C y se transportó al laboratorio en aproximadamente 12 horas mediante un criovial. Consulte la Tabla de Materiales para detalles sobre todos los materiales utilizados en el siguiente protocolo.
1. Aislamiento de núcleos
NOTA: Realiza todos los pasos sobre hielo y utiliza materiales estériles. Prepara todos los buffers frescos.
- Lava el pañuelo una o dos veces con medio RPMI sin suero para eliminar manchas y fragmentos de sangre. Usando pinzas estériles, transfiere el tejido a una placa de Petri estéril y anota el peso.
- Utilizando una cuchilla quirúrgica (nº 10), pica el tejido en pequeños trozos de ∼1mm 3 de tamaño.
- Prepara un tampón de lisis de 1 mL combinando 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM de NaCl, 3 mM de MgCl2 (usando soluciones estándar de 1 M para cada componente), 0,1% (v/v) de Nonidet P-40 en agua libre de nucleasa. Añadir los componentes secuencialmente en el siguiente orden: primero agua libre de nucleasa, luego Tris-HCl, NaCl, MgCl₂ y NP-40 por último, para evitar la formación de espuma.
NOTA: El buffer de lisis debe prepararse fresco el día de su uso y mantenerse siempre frío sobre hielo. No te congeles. - Añade un tampón de lisis frío de 1 mL al tejido en un tubo microcentrífuga de 5 mL.
- Lisa el papel sobre hielo usando un micromano aplicando una fuerza suave y constante y girando el micromano en sentido horario y antihorario alternativamente. Continúa la lisis durante aproximadamente 30 minutos, asegurando que la muestra permanezca fría durante todo el proceso.
NOTA: Lisa el tejido hasta que se vuelva turbio. Usa una punta de 1000 μL para mezclar suavemente pipeteando. - Filtra la solución usando un colador de tamaño poro de 100 μm en un tubo centrífuga de 15 mL para eliminar restos y trozos de tejido.
NOTA: El filtrado debe parecer menos turbio con restos visibles retenidos en el colador. - Centrifuga los núcleos a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C usando un rotor de cubo oscilante.
NOTA: Debe formarse un pellet visible en la parte inferior del tubo. - Retira el sobrenadante usando una punta de pipeta de calibre normal sin alterar el perdigón.
- Prepara el lavado y el tampón de resuspensión de núcleos combinando albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (usando el 10% de la solución original), inhibidor de RNasa de 0,2 U/μL (usando solución de stock de 20 U/μL) en la solución tampón fosfatada 1X de Dulbecco (DPBS). Añadir los componentes secuencialmente en el siguiente orden: primero DPBS, luego BSA y finalmente inhibidor RNasa.
NOTA: El buffer debe prepararse fresco el día de su uso y mantenerse refrigerado en hielo en todo momento. No te congeles. - Resuspende el pellet en lavado de núcleos y resuspensión de buffer. Enfría el buffer con hielo antes de usarlo.
- Evalúa la eficiencia de la lisis y la viabilidad celular tintiendo con 5 μL de azul de tripán y contando en un hemocitómetro.
NOTA: Si aún hay células viables, centrifugar a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C, y luego repetir las secciones 3-10. - Filtra la solución usando un colador de poro de 30 μm en un tubo centrífuga de 15 mL para eliminar restos y grumos.
- Centrifuga los núcleos a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C usando un rotor de cubo oscilante.
- Retira el sobrenadante usando una punta de pipeta de calibre normal, luego vuelve a suspender el pellet en 1 mL de lavado de núcleos y buffer de resuspensión.
2. Caracterización de núcleos aislados
- Tinción con azul de tripáns para evaluar la integridad de los núcleos.
- Toma 15 μL de la suspensión de núcleos aislados en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
- Añade 5 μL de tinte azul de tripáno (0,4% p/v) y mezcla suavemente pipeteando.
- Incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir un tinte adecuado.
- Carga 10 μL de la mezcla teñida sobre un hemocitómetro.
- Observa bajo un microscopio invertido compuesto para examinar la morfología y contar el número de núcleos.
- Análisis de citometría de flujo en suspensión de núcleos individuales
- Toma 1 mL de suspensión de núcleos aislados y centrifuga la suspensión de núcleos a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C usando un rotor de cubeta oscilante.
- Retira el sobrenadante usando una punta de pipeta de calibre normal y vuelve a suspender el pellet en un tampón FACS de 200 μL (1X PBS y 1% BSA).
- Divide 200 μL de núcleos resuspendidos en dos alicuotas: mantén 100 μL como control sin teñir y usa 100 μL como muestra teñida.
- Añadir 1 μL 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 mg/mL) a la muestra teñida para lograr una concentración final de 10 μg/mL. Mezcla suavemente e incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 5 minutos antes del análisis citométrico de flujo.
- En el citómetro de flujo utilizado para este estudio, utiliza el láser violeta a 405 nm y decíla usando 448/45 nm. Primero se analiza la muestra de control sin teñir y se obtén un mínimo de 10.000 eventos de la población total.
- Ajusta el voltaje a 183 V para dispersión directa (FSC), 300 V para dispersión lateral (SSC) y 400 V para V450 (láser DAPI). Establece el umbral en 10.000 para FSC.
NOTA: Todos los ajustes de voltaje y ganancia del instrumento son constantes entre las muestras para mantener la consistencia. - Grafica el área de dispersión hacia adelante (FSC-A) frente a la altura de dispersión hacia adelante (FSC-H) para distinguir singlets de dobletes y agregados. Dibuja una puerta alrededor de eventos que muestren una relación lineal para conservar solo núcleos singlete.
- Genera un gráfico bivariado de FSC-A frente al área de dispersión lateral (SSC-A). Aplicar una compuerta amplia que abarque toda la población dispersa, ya que los núcleos aislados suelen mostrar un perfil de dispersión heterogéneo sin subpoblaciones distintas.
- Crea un gráfico de densidad 2D (pseudo color) de SSC-A frente a Violeta 450 nm-área (V450-A). Utiliza el control sin teñir para definir la fluorescencia de fondo y guiar la colocación precisa de las puertas. Identificar y engatear la población DAPI⁺ distinta correspondiente a núcleos intactos.
NOTA: Como se utiliza un solo fluorocromo (DAPI), no se requiere compensación de fluorescencia.
- Imagen de los núcleos aislados mediante microscopía confocal
- Toma 50 μL de suspensión de núcleos y añade 1 μL de DAPI (1 mg/mL) a la muestra teñida para lograr una concentración final de 10 μg/mL, mezcla suavemente e incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad antes de la imagen confocal.
- Montar 5 μL de suspensión de núcleos teñidos sobre una lámina de cristal limpia y cúbrela con un deslizante de cobertura.
NOTA: Evitar la fijación para preservar la morfología nuclear. - Visualiza los núcleos usando un microscopio confocal invertido. Abre el software del microscopio confocal y observa primero en campo brillante 10X, luego cambia a campo brillante 40X.
- Adquirir imágenes confocales utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un detector espectral y objetivos PLAN APO λD 40X (NA 0,95, RI 1,0). Excita DAPI usando un láser de 405 nm y recoge la emisión entre 429 y 474 nm.
- Los parámetros de imagen fueron los siguientes:
- Modo detector: Multicanal (GaAsP)
- Escáner: Galvano unidireccional
- Modo de escaneo: Banda
- Promedia de línea: 2X
- Resolución: 1024 × 1024 píxeles
- Tiempo de permanencia: 2,0 μs
- Tamaño del orificio: 47,7 μm
- Potencia láser: 0,1-9,3% (dependiendo de la intensidad del campo)
- Ganancia del detector: 37,8-45,9%
- Zoom: 1.0X
- Calibración: 0,43-0,58 μm/píxel
- Obtén todas las imágenes con la cámara AX con modo de diafonia mínimo bajo configuraciones ópticas idénticas, y el sistema de enfoque perfecto (PFS) debe estar activo durante la imagen para mantener la estabilidad del plano z.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El tejido de endarterectomía coronaria humana se recogió de pacientes sometidos a cirugía de CABG. El tejido fue pesado y procesado para el aislamiento de núcleos, y se confirmaron núcleos aislados adicionales mediante citometría de flujo y microscopía confocal (Figura 1).
Evaluación de la calidad del aislamiento de núcleos con el azul de tripán
El tejido almacenado en medio RPMI se pesó y medía 247,8 mg. El tejido fue picado y luego homogeneiz...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Un flujo de trabajo optimizado para el aislamiento de núcleos del tejido endarterectomía coronario humano está descrito en el protocolo actual. El protocolo de aislamiento nuclear descrito aquí fue diseñado específicamente para superar las limitaciones críticas de obtener células viables e intactas a partir de placas ateroscleróticas coronarias avanzadas. A diferencia de los enfoques convencionales de scRNA-seq que se basan en digestión enzimática agresiva y disociación...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Consejo Indio de Investigación Médica (ICMR) (EM/Dev/SG/34/01106/2024) y por la colaboración del Instituto de Cardiología y Centro de Investigación de la ONU Mehta, Ahmedabad. Khushi Jani reconoce a la Comisión de Subvenciones Universitarias (UGC) y al Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR) del Gobierno de la India, por otorgar la Certificación Neta Conjunta CSIR-UGC (Referencia NTA nº: 241620143543).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 100 & mu; M colador | Miltenyi Biotech | 130-098-463 | |
| 30 & mu; M colador | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | |
| Albúmina sérica bovina | HiMedia | TC546-25G | |
| Centrifugadora | MPW | NA | https://mpw.pl/en/offer/mpw-352r |
| Microscopio compuesto | Nikon | NA | Microscopio invertido Nikon Eclipse Ts2 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2) |
| Microscopio Confocal | Nikon | NA | Microscopio confocal invertido Nikon Ti2-E (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series) |
| Cubiertas | HiMedia | BG011C | |
| Frasco de muestra de boca ancha CRYOCHIL | Tarsons | 883191 | |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | |
| DPBS | Gibco (Termofisador) | 10010-023 | |
| Tubo de centrífuga (15 mL) | Tarsons | 546021 | |
| Citómetro de flujo | BD Biociencias | 663029 | BD FACSLyric (CEIVD de Instrumentos 3L12C) |
| Hemocitometro | Axibio | CCB 100 | |
| Tubo microcentrífuga (1,5 mL) | Tarsons | 500010C | |
| Tubo microcentrífuga (5 mL) | Tarsons | 500050 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028-100ML | |
| Micro mortero | Tarsons | 160020 | |
| NaCl | Sigma | S9888-500G | |
| NP-40 | HiMedia | MB143-100ML | |
| Agua libre de nucleasas | Gibco (Termofisador) | W4502-1L | |
| Inhibidor de RNasa | Sigma | 333540201 | |
| RPMI 1640 | Gibco (Termofisador) | 11875093 | |
| Diapositiva | Riviera | 72910135 | |
| Tris-HCl | Sigma | T2194-100ML | |
| Trippan blue | Sigma | 302643-25G |
Referencias
- Roth, G. A., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risk factors- 1990-2019. J. Am. Coll. Cardiol. 76 (25), 2982-3021 (2020).
- de Winther, M. P. J., et al. Translational opportunities of single-cell biology in atherosclerosis. Eur. Heart J. 44 (14), 1216-1230 (2023).
- Mohebbati, R., Momeni-Moghaddam, M. A. The role of red blood cells in cholesterol accumulation and atherosclerotic plaque instability: a perspective on atherosclerosis. Curr. Cardiol. Rev. 21 (5), (2025).
- Ajoolabady, A., et al. Inflammation in atherosclerosis: pathophysiology and mechanisms. Cell Death Dis. 15 (11), 817(2024).
- Dawson, L. P., Layland, J. High-risk coronary plaque features: a narrative review. Cardiol. Ther. 11 (3), 319-335 (2022).
- Tong, W., et al. Highly sensitive magnetic particle imaging of vulnerable atherosclerotic plaque with active myeloperoxidase-targeted nanoparticles. Theranostics. 12 (17), 7641-7641 (2022).
- Lu, G., et al. Coronary computed tomography angiography assessment of high-risk plaques in predicting acute coronary syndrome. Front. Cardiovasc. Med. 8, (2021).
- Kinoshita, D., et al. High-risk plaques on coronary computed tomography angiography. JACC Cardiovasc. Imaging. 17 (4), 382-391 (2024).
- Canu, M., et al. Non-invasive multimodality imaging of coronary vulnerable patient. Front. Cardiovasc. Med. 9, (2022).
- Liu, X., et al. Assessment of coronary computed tomography angiography-derived plaque features in the diagnosis of optical coherence tomography-defined vulnerable plaques. Quant. Imaging Med. Surg. 15 (3), 2029-2041 (2025).
- Chiorescu, R. M., et al. Vulnerable atherosclerotic plaque: is there a molecular signature. Int. J. Mol. Sci. 23 (21), 13638(2022).
- The applications of single-cell RNA sequencing in atherosclerotic disease. Front. Cardiovasc. Med. Slenders, L., Tessels, D. E., van der Laan, S. W., Pasterkamp, G., Mokry, M. 9, (2022).
- Adam, C. A., et al. Novel biomarkers of atherosclerotic vascular disease-latest insights in the research field. Int. J. Mol. Sci. 23 (9), 4998(2022).
- Ye, W., Chen, Z., Xia, Z., Li, D. Single-cell RNA sequencing in human atherosclerotic plaques reveals a novel smooth muscle cell subtype that possesses multi differentiation potential and shapes the microenvironment. Clin. Exp. Med. 25 (1), 251(2025).
- Kelly, J. J., et al. Coronary endarterectomy: analysis of the society of thoracic surgeons adult cardiac surgery database. Ann. Thorac. Surg. 114 (3), 667-674 (2022).
- Ghatanatti, R. Coronary endarterectomy: recent trends. J. Clin. DIAGNOSTIC Res. , (2017).
- Li, Y., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic cell populations and differential gene expression patterns in control and aneurysmal human aortic tissue. Circulation. 142 (14), 1374-1388 (2020).
- Alsaigh, T., Evans, D., Frankel, D., Torkamani, A. Decoding the transcriptome of calcified atherosclerotic plaque at single-cell resolution. Commun. Biol. 5 (1), 1084(2022).
- Iqbal, F., Lupieri, A., Aikawa, M., Aikawa, E. Harnessing single-cell RNA sequencing to better understand how diseased cells behave the way they do in cardiovascular disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 41 (2), 585-600 (2021).
- Ahmad, H., et al. Single cell RNA sequencing of haematopoietic cells in fresh and frozen human atheroma tissue. Cardiovasc. Res. 121 (3), 396-404 (2025).
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circ. Res. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Williams, J. W., et al. Single cell RNA sequencing in atherosclerosis research. Circ. Res. 126 (9), 1112-1126 (2020).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J. Pathol. Transl. Med. 57 (1), 52-59 (2023).
- Gruenbaum, Y., Foisner, R. Lamins: Nuclear intermediate filament proteins with fundamental functions in nuclear mechanics and genome regulation. Annu. Rev. Biochem. 84 (1), 131-164 (2015).
- Zwerger, M., Ho, C. Y., Lammerding, J. Nuclear mechanics in disease. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13 (1), 397-428 (2011).
- Dechat, T., et al. Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin. Genes Dev. 22 (7), 832-853 (2008).
- Oh, J. -M., et al. Comparison of cell type distribution between single-cell and single-nucleus RNA sequencing: enrichment of adherent cell types in single-nucleus RNA sequencing. Exp. Mol. Med. 54 (12), 2128-2134 (2022).
- Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat. Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
- Gulko, A., et al. Protocol for flow cytometry-assisted single-nucleus RNA sequencing of human and mouse adipose tissue with sample multiplexing. STAR Protoc. 5 (1), 102893(2024).
- Fernandez, D. M., et al. Single-cell immune landscape of human atherosclerotic plaques. Nat. Med. 25 (10), 1576-1588 (2019).
- Galvis, A. E., Fisher, H., Camerini, D. NP-40 fractionation and nucleic acid extraction in mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (20), (2017).
- Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nat. Med. 25 (8), 1280-1289 (2019).
- Pan, H., et al. Single-cell genomics reveals a novel cell state during smooth muscle cell phenotypic switching and potential therapeutic targets for atherosclerosis in mouse and human. Circulation. 142 (21), 2060-2075 (2020).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
- Litviňuková, M., et al. Cells of the adult human heart. Nature. 588 (7838), 466-472 (2020).
- Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes Dev. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
- Rani, U., et al. Evaluation of use of RPMI Medium to preserve cell morphology for pleural/peritoneal fluid cytology. J. Cytol. 39 (1), 26-29 (2022).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends Cell Biol. 31 (11), 888-897 (2021).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat. Med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nat. Protoc. 11 (3), 499-524 (2016).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
