Generación de cultivos organoides tumorales a partir de la línea celular de adenocarcinoma pulmonar

Resumen

Aquí presentamos un método rápido, puro y rentable para establecer organoides tumorales a partir de la línea celular A549, adecuados para pruebas preliminares y fines educativos.

Resumen

Aquí describimos un protocolo para generar organoides tumorales derivados de líneas celulares (CDTOs) a partir de la línea celular de adenocarcinoma pulmonar humano A549. El protocolo consiste en incrustar células A549 expandidas en 2D en Matrigel y mantenerlas en un medio de cultivo 3D para cultivos a largo plazo. Se determinó que la densidad de siembra recomendada de 500 celdas/μL apoyaba la formación consistente de organoides. Los CDTO resultantes se caracterizaron por tinción de hematoxilina y eosina (H&E) e inmunofluorescencia (IF). Los organoides mantuvieron una alta expresión de los marcadores de adenocarcinoma pulmonar Factor de Transcripción Tiroidea 1 (TTF-1), proteína de adhesión E-Cadherina (ECAD) y proteína del citoesqueleto Queratina 7 (KRT7). Además, la expresión de la proteína de unión estrecha Zona Occludens 1 (ZO-1) mostró una polaridad desregulada de los organoides tumorales. Este protocolo ofrece una plataforma técnicamente sencilla, rentable y puramente tumoral para la investigación de adenocarcinomas pulmonares. Su simplicidad y reproducibilidad también la hacen adecuada para la enseñanza de laboratorio de grado, donde puede ayudar a los estudiantes a adquirir técnicas fundamentales de cultivo de organoides tumorales en 3D dentro de un calendario de laboratorio limitado.

Introducción

Los organoides son in vitro. estructuras tridimensionales autoorganizadas (3D) que se originan en células madre y son capaces de recapitular complejidades biológicas de órganos reales en gran^{medida 1}. Las células que constituyen organoides pueden derivar de células madre pluripotentes inducidas o de células derivadas de tejidos, estas últimas incluyendo células madre normales/progenitoras, células diferenciadas y células^{tumorales 2}. En comparación con los sistemas tradicionales de cultivo bidimensional y los modelos animales, los organoides pueden imitar más fielmente las características fisiológicas del cuerpo humano ofreciendo una mayor flexibilidad experimental. En consecuencia, la tecnología organoide se ha aplicado ampliamente en el desarrollo de^{fármacos 3}, medicina^{personalizada 4} y modelización de^{enfermedades 5}.

Numerosos estudios han establecido modelos organoides para un amplio espectro de cánceres, incluyendo^{colorrectal 6},^{próstata 7}, páncreas⁸,^{gástrico 9}, hepático¹⁰,^{biliar 11},^{mama 12} y tumores neuroendocrinos. Sin embargo, uno de los principales retos en la investigación de organoides tumorales radica en mantener la pureza. Por ejemplo, un estudio sobre cáncer de pulmón no de células pequeñas reveló que solo el 17% de los organoides establecidos eran puramente tumorales, ya que las muestras tumorales suelen contener una mezcla de células normales y malignas que son difíciles de separar completamente antes del^{cultivo 13}. Este problema de impurezas puede provocar la eliminación de células tumorales por el crecimiento de células no tumorales, interferir con las lecturas de las pruebas de susceptibilidad a fármacos y conducir a análisis moleculares inexactos, como RT-qPCR o Western blot, donde ARN y proteínas de células tumorales se diluyen por proporciones incontrolables de células contaminantes.

Para abordar este problema, los investigadores han explorado el diseño de medios de cultivo selectivos que aprovechan la reducción de la dependencia de las células tumorales a ciertos factores de crecimiento, inhibiendo así el crecimiento celular normal mientras promueven la expansión de las células^{tumorales 14}. Además, se están desarrollando estrategias como la clasificación celular o la identificación monoclonal para construir organoides tumorales puros.

Este protocolo describe la generación de organoides tumorales derivados de líneas celulares (CDTOs) utilizando la línea celular de adenocarcinoma pulmonar humano A549, que se ha informado que presenta parcialmente propiedades similares a células madre cancerosas, así como una clonogenicidad mejorada, potencial proliferativo y tumorigenicidad in vitro.¹⁵. Los CDTO resultantes mantuvieron la expresión de biomarcadores específicos de linaje Factor de Transcripción Tiroidea 1 (TTF-1)¹⁶, proteína de adhesión E-Cadherina (ECAD)¹⁷ y proteína del citoesqueleto Queratina 7 (KRT7)¹⁶ , y mostraron características fisiológicas características de los organoides tumorales. Este modelo es fácil de establecer y contiene componentes definidos de las células cancerosas, lo que lo hace adecuado para investigadores nuevos en el campo organoide tumoral o para quienes sufren problemas por pérdida de identidad tumoral en cultivos organoides tumorales primarios. Las aplicaciones potenciales incluyen pruebas preliminares de susceptibilidad a^{fármacos 18}, estudios de microambientes^{tumorales 19} y formación educativa en técnicas de cultivo 3D.

Protocolo

La temperatura ambiente en el laboratorio es de 22–24 °C y se denomina RT. Se recomienda usar una centrífuga de cubo oscilante. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Establecimiento de organoides primarios A549

1. Preparación y extracción de células A549
   1. Prepara un plato de 6 cm que contenga células A549 al 70% de confluencia. Precalenta TrypLE y PBS a 37 °C. Calcular la cantidad de celdas y el volumen de Matrigel según el diseño experimental y la Tabla 1.
      1. El deshielo requirió alicuotas Matrigel con redundancia para al menos dos pozos en hielo durante al menos 60 minutos. Preparar placas tratadas con poliestireno y TC para que las cúpulas permanezcan hemisféricas.
      2. Prepara un medio 2D fresco (Medio Modificado de Águila de Dulbecco que contiene un 10% de suero bovino fetal) y medio 3D (Medio organoide para adenocarcinoma pulmonar humano). El medio 3D puede generarse a partir de kits comerciales o, según los trabajos de Sachs, N. et al., del laboratorio²⁰ de Hans Clever.
         NOTA: Un plato de 6 cm suele producir unas 5.000.000 de células tras la digestión. Reducir el número de celdas de entrada para el diseño experimental. Las placas diseñadas para imágenes confocales con fondo de cristal no son adecuadas para que Matrigel forme una forma 3D adecuada.
   2. Aspira el medio 2D gastado y lava las células una vez con 1 mL de PBS para eliminar el suero residual. Aspira PBS, añade 1 mL de TrypLE precalentado y incuba la placa a 37 °C durante 4 minutos.
   3. Observa las células bajo un microscopio. Cuando el citoplasma se retrae y las células pierden conexiones intercelulares, se añade un volumen igual (1 mL) de medio 2D fresco para terminar la reacción enzimática.
   4. Pipetea suavemente para desprender y volver a suspender las células adheridas de la superficie del cultivo. Transfiere la suspensión de la celda a tubos centrífugos de 1,5 mL y centrifuga a 300 × g durante 3 minutos en RT para pelletar las celdas.
   5. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender la célula en un medio 2D de 1 mL. Diluir la suspensión de 10 μL de células a 100 μL y contar los números celulares con un hemocitómetro. Calcular el volumen requerido según el paso 1.1.1 y aspirar a un tubo centrífuga de 1,5 mL con puntas preenjuagadas.
2. Siembra de células cosechadas en Matrigel
   1. Prepara hielo y enfría las puntas de la pipeta en la nevera a -20 °C durante 1 minuto y usa puntas de baja retención si es posible. Asegúrate de que no queden cristales en las alicuotas de Matrigel y que no se formen burbujas cuando la punta entre en la solución.
   2. Centrifugar el tubo que contiene las células extraídas a 300 × g . en RT y descartar el sobrenadante. Pon el tubo sobre hielo. Utiliza puntas de pipeta preenfriadas para aspirar lentamente el volumen requerido de Matrigel y añádelo al pellet sobre hielo. Resuspende lentamente usando solo el primer registro de la pipeta. Por favor, no dejes hielo más de 10 segundos si es necesario observar.
   3. Usa puntas de pipeta preenfriadas y mantén la mezcla en hielo. Dispensa una alicuota de la mezcla en el centro de cada pozo. Retira la pipeta lentamente mientras dispensas, usando solo el primer tope para evitar la formación de burbujas.
      NOTA: La mezcla debe formar una estructura 3D en forma de cúpula en el centro. Suspende la mezcla antes de pasar al siguiente pozo. Si es posible, evita usar los pozos de borde y añade PBS a estos pozos.
   4. Incubar la placa a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂ durante 40 minutos para permitir la polimerización en gel. Una vez solidificado el Matrigel, añadir cuidadosamente un medio 3D a lo largo de la pared del pozo y continuar el cultivo a 37 °C.
      NOTA: Evita generar burbujas durante la dispensación. Si se generan burbujas, evita usar esa parte de la mezcla.
   5. Durante el cultivo, se sustituye el medio 3D cada 3 días o siempre que se observe un cambio de color (de rosa a amarillo). Examinar el crecimiento de organoides bajo un microscopio invertido en cada cambio de medio y documentar la morfología fotográficamente para monitorizar el desarrollo estructural.
      NOTA: Los organoides deben ser densos y enrevesados con diámetros superiores a 30 μm en lugar de desintegrados o fragmentados, como indica 5000 celdas/μL (Figura 1D).

2. Fijación, incrustación y seccionamiento de organoides

1. Preparar cultivos organoides en los días 6–9. Retira el medio de cultivo de la placa de cultivo celular. Desconecta suavemente los organoides pipeteando con 1 mL de PBS frío y transfiere a un tubo de 1,5 mL previamente enjuagado con 5% de BSA para evitar la adhesión. Permite que los organoides se asienten de forma natural por gravedad sobre el hielo y retira cuidadosamente el sobrenadante.
2. Añade 1 mL de PBS frío para volver a suspender el pellet. Deja que los organoides se asienten de forma natural por gravedad durante al menos 5 minutos y retira cuidadosamente el sobrenadante. Si algunos organoides no sedimentan, centrifugar brevemente a 200 × g durante 1 minuto a 4 °C para recogerlos. Este paso se realizará varias veces y se denominará 'lavado pequeño'.
3. Realiza el lavado pequeño dos veces para eliminar los residuos de Matrigel. Si persiste el residuo de Matrigel, añade una concentración final de 10 mM de EDTA a PBS frío durante el lavado.
   PRECAUCIÓN: Transfiere las muestras a la campana extractora. Añade un 4% de paraformaldehído (PFA) suficiente para cubrir los organoides y fija sobre hielo durante 1 hora en una campana extractora. Descarta el fijador y realiza el lavado pequeño dos veces. Procede con el paso 4.1 para la mancha de IF.
4. Después de que los organoides se asienten en el fondo del tubo, descarta el sobrenadante y precalienta las muestras en un baño metálico a 70–75 °C durante 5 minutos para evitar una solidificación rápida de agarosa durante el paso 2.7.
5. Prepara 3% (p/v) de agarosa en 1× PBS y calienta la mezcla en un baño de agua en microondas hasta que esté completamente disuelta y transparente. Evita hervir para evitar pérdida de volumen o cambios en la concentración de agarosa.
6. Suspender rápidamente los organoides fijos en 30–50 μL de agarosa al 3%, asegurando una distribución uniforme, y enfriar sobre hielo durante 20–30 minutos hasta solidificarse, evitando la formación de burbujas.
7. Una vez que la mezcla de agarosa y organoide se ha solidificado, retira cuidadosamente el bloque de agarosa del tubo usando una aguja y transfiere a un casete de tejido marcado que incrusta.
8. Sumergir secuencialmente el casete que contiene el bloque de agarosa en soluciones de etanol clasificadas (30%, 50%, 70% [puede almacenarse durante la noche a 4 °C], 80%, 90%, 95%, 100% y 100%) para la deshidratación. Incuba cada paso en una plataforma agitadora a 20 rpm durante 30 minutos.
9. Derrite los bloques de cera de parafina en un horno antes de usarlos a 65 °C. Transfiere los organoides deshidratados incrustados en agarosa al xileno para su limpieza. Sumergir dos veces, cada una durante 15–20 minutos, para eliminar el etanol residual.
10. Transfiere los casetes de tejido secuencialmente al baño de parafina 1 durante 45 minutos, y luego al baño 2 de parafina durante otros 45 minutos.
11. Coloca los casetes de tejido y los moldes metálicos en la cámara de parafina fundida de la estación de incrustación. Retira el organoide o la muestra de tejido del casete y colócala en el centro del molde metálico. Coloca el molde sobre una placa fría para fijar la orientación de la muestra.
12. Coloca el casete de tejido sobre el molde metálico, llénalo con parafina fundida adicional y déjalo enfriar en la placa fría durante al menos 60 minutos. Una vez que el bloque de parafina está completamente solidificado, retirar el molde metálico y almacenar el bloque organoide incrustado en parafina a 4 °C hasta la sección.
13. Seccionar los bloques organoides incrustados en parafina usando un microtomo. Asegúrate de que el grosor de cada sección sea uniforme para facilitar la tinción y la obtención de imágenes posteriores.
14. Deja que las secciones cortadas floten en un baño maria mantenido a 40 °C para permitir la expansión completa de las cintas de parafina. Asegúrate de que cada sección se extienda como una sola capa sin arrugas; Descarta cualquier sección doblada o superpuesta.
15. Monta las secciones expandidas sobre portaobjetos adhesivos de microscopio sumergiendo el portaobjetos en un ángulo ligeramente bajo la sección y levantándolo verticalmente para capturar el tejido. Etiqueta las láminas con un lápiz para preservar la identificación de la muestra durante el procesamiento posterior.

3. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

1. Hornea las láminas que contienen secciones de tejido o organoides en un horno a 60 °C durante 1–2 horas para asegurar una correcta adherencia y eliminar la parafina residual.
2. Dewax las secciones secuencialmente sumergiéndolas en xileno I durante 15 minutos, xileno II durante 15 minutos, y luego rehidrata a través de una serie graduada de etanol de 100%, 100%, 95%, 90%, 80% y 70%, cada una durante 5 minutos. Luego, enjuaga los portaobjetos en agua doble destilada (ddH₂O) dos veces, cada una durante 5 minutos.
3. Tiñe las secciones con hematoxilina durante 5 minutos, enjuaga con agua del grifo corriente durante 1–2 minutos y luego diferencia en alcohol ácido al 1% durante 2 segundos. Lava de nuevo con agua del grifo durante 1–2 minutos, luego blanquea los núcleos en agua al 1% de amoníaco durante 5 segundos, y después un último enjuague con agua del grifo durante 1–2 minutos.
4. Deshidrata las secciones a través de una serie graduada de etanol del 70%, 80%, 90% y 95% cada una durante 3 minutos, y luego contra-teñe con eosina en una solución de eosina a base de alcohol durante 10 minutos.
5. Enjuaga las secciones dos veces con etanol absoluto, cada una durante 5 minutos.
   NOTA: Para la eosina a base de alcohol, asegúrate de deshidratar hasta un 95% de etanol antes de teñir. Para la eosina soluble en agua, realiza la tinción antes de la deshidratación.
6. Limpia las secciones sumergiéndolas dos veces en xileno, cada una durante 5 minutos, y mantenlas en xileno hasta que las monten.
7. Monta las láminas inmediatamente después de retirarlas del xileno usando un medio de montaje de resina neutra, evitando cuidadosamente las burbujas de aire.
8. Seca al aire las láminas montadas en RT durante 30–60 minutos y luego observa bajo un microscopio óptico.
   NOTA: El montaje inmediato tras la limpieza del xileno previene la oxidación y garantiza la claridad óptica.

4. Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo

1. Continúa desde el paso 2.4. Añadir 1 mL de solución de bloqueo y permeabilización (5% BSA + 0,3% Triton X-100) al pellet e incubar en RT durante 60 minutos o a 4 °C como punto de parada durante 1–2 días.
2. Diluir los anticuerpos primarios y secundarios siguiendo la proporción recomendada por el fabricante en la solución de bloqueo y permeabilización. Lava una vez y añade 200 μL de anticuerpos primarios diluidos al pellet. Incuba a 4 °C durante la noche.
3. Realiza el lavado pequeño 3 veces y añade 200 μL de anticuerpos secundarios diluidos al pellet. Incubar en RT durante 60 minutos.
4. Después, realiza el lavado pequeño 3 veces. Añadir 15 μL de medio de montaje para resuspender el pellet y dejar caer el medio que contiene organoides sobre una lámina de vidrio. Aplica poco a poco una capa de cobertura sobre el medio y sella la capa con esmalte de uñas. No comprimas manualmente el deslizamiento de la tapa y permitas que el medio de montaje se disperse por la tensión superficial.

Resultados

El proceso general de este protocolo incluye la expansión de las células A549 2D hacia la etapa exponencial (Figura suplementaria 1A) y el paso a la matriz 3D para formar organoides (Figura 1A). Tras la encapsulación en Matrigel, las células proliferaron y se autoensamblaron, formando predominantemente organoides monoclonales (Figura 1B). Su morfología densa y enrevesada fue uniforme a lo largo del paso (Figura suplementaria 1C)...

Discusión

Este protocolo describe un método para generar organoides tumorales derivados de líneas celulares de adenocarcinoma pulmonar A549, optimizados para la simplicidad técnica, la reproducibilidad y el uso educativo. Tres parámetros determinan críticamente el éxito: estado celular inicial, formulación del medio y composición de la matriz. Además, no se recomienda que la duración del cultivo supere los 14 días. A continuación se enumeran los parámetros clave y la resolución de problemas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1.5 mL Micro Centrifuge tube	Biofil	CFT003015
A549 [A-549]human non-small cell lung cancer cells	ZQXZbio	ZQ0003	STR: Amelogenin: X,Y; CSF1PO: 10,12; D13S317: 11; D16S539: 11,12; D5S818: 11; D7S820: 8,11; TH01: 8,9.3; TPOX: 8,11; vWA: 14. Mycoplasma was negetive when purchased was tested every 2 weeks. Passage number within 10 passages from the P1 aliquots of the purchased batch was used.
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Anti-E Cadherin antibody	Abcam	ab231303
Anti-Fade Mounting Medium	YEASEN	36307ES08
Anti-HIF-1 alpha antibody	Abcam	ab51608
Biological Safety Cabinet	Nuaire LABGARD	NU-540
Biological Tissue Embedding Machine	KEDEE	KD-BM
BSA	Sigma	A1933
Cell-Grade BSA	Sigma	A1933-100G
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5702 R	Swing bucket; Mild to low speed.
Centrifuge tube	Biofil	CFT920150
Citrate Antigen Retrieval Solution (pH 6.0)	ZSGB-BIO	ZLI-9065
Cryostage	KEDEE	KD-BL
Cytation 5 Cell Imaging Multimode  Reader	Biotek	Cytation 5
Cytokeratin 7 (KRT7) Rabbit mAb	Abclonal	A4357
DMEM	Gibco	11965092
DMSO	Solarbio	D8371
Donkey Serum	Solarbio	SL050
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11965118
Eclipse Ts2 Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ts2
Eosin Staining Solution (Alcohol-Soluble)	Servicebio	G1001
FBS	Nobimpex	B118-500
Forma Steri-Cycle i160 CO2 Incubator	Thermo Scientific	i60
Hematoxylin Bluing Solution	Servicebio	G1040
Hematoxylin Differentiation Solution	Servicebio	G1040
Hematoxylin Staining Solution	Servicebio	G1004
Hemocytometer	Solarbio	YA0810
Human Lung Adenocarcinoma Organoid Medium (3D medium)	PMO Bio	HC1001
Immunohistochemistry (IHC) Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305	Store in 4°C
Laser Confocal Microscope  FV3000	Olympus	FV3000	Usual parameter range: PMT Voltage: 500 ± 200 V; Laser Transmissivity: 5 ± 3%; Offset: 3 %
Manual Rotary Microtome	Leica	RM2235
Metal Bath	ALLSHENG	MK-3000
Microwave Oven	Galanz
Nail Polish	Lete
Neutral Balsam (Mounting Medium for Microscopy)	Beyotime	C0173
Organoid-Specific Extracellular Matrix Gel	PMO Bio	BM1001
PBS	WISENT	311-010-CL
Peroxidase Blocking Solution	Beyotime	P0100A
Pipettes	Eppendorf	312300063/312300020/312400083
Pipettes tips	Axygen	14-222-692/14-222-723/14-222-869	Consider using low retention tips if possible.
Three-Dimensional Shaker	SCILOGEX	SK-D3309-Pro	Low speed.
Tissue Flotation Water Bath	KEDEE	KD-P
Triton X-100	VWR	92046-34-9
Trypan Blue	Gibco	15250061
TryPLE	Gibco	12605028
TTF1 Recombinant Monoclonal Antibody	HUABIO	HA720067