Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Producción rápida de ribonucleasa humana SLFN14 recombinante y análisis estequiométrico mediante fotometría de masas

961 visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/70393

⸱

20 de febrero de 2026

 ,  , 
1Department of Structural Biology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, SUNY, 2Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine, 3Therapeutic Innovation Center (THINC), Baylor College of Medicine

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la producción de ribonucleasa recombinante humana SLFN14 y su análisis estequiométrico mediante fotometría de masas.

Resumen

Las ribonucleasas son una clase especializada de proteínas de unión al ARN que catalizan la escisión del ARN y contribuyen a diversos procesos biológicos, incluida la regulación génica. No obstante, la estructura, función y regulación de muchas ribonucleasas humanas siguen estando poco caracterizadas debido a los desafíos de la producción de proteínas recombinantes. Este método describe un enfoque eficiente para la expresión transitoria, purificación y análisis estequiométrico de la ribonucleasa humana de Schlafen 14 (SLFN14). SLFN14 marcado con bandera recombinante se expresó en celdas de suspensión HEK293 y se aisló mediante un flujo de trabajo rápido de purificación en dos pasos que consistía en cromatografía de afinidad anti-Flag seguida de cromatografía de exclusión por tamaño de baja resolución. La fotometría de masas, una técnica sensible de molécula única, reveló que en condiciones fisiológicas de la sal SLFN14 forma un homodímero estable unido al ARN celular, mientras que la alta sal promueve la disociación del ARN mientras preserva la disposición del homodímero. La proteína humana recombinante resultante SLFN14 es adecuada para estudios estructurales posteriores y ensayos bioquímicos cualitativos. Este enfoque rápido para el aislamiento y caracterización de muestras de proteínas humanas recombinantes es ampliamente aplicable para la producción de otras ribonucleasas de mamíferos y proteínas de unión al ARN destinadas a la caracterización biofísica y bioquímica.

Introducción

Schlafen 14 (SLFN14) es una ribonucleasa poco estudiada y un factor de restricción de hospedador en mamíferos 1,2,3. La proteína humana SLFN14 pertenece a una familia de seis miembros reguladores genéticos SLFN, desempeñando funciones en la inmunidad, la actividad antiviral, la quimiosensibilidad y la diferenciacióncelular 4,5,6,7,8. La comprensión mecanicista del papel de los reguladores genéticos SLFN sigue siendo incompleta; sin embargo, muchos miembros albergan actividad ribonucleasa esencial para el controltraslacional 7,9. Las ribonucleasas SLFN se activan tras la homodimerización de proteínas, formando una hendidura compuesta de unión al ARN competente en la clivaganciadel sustrato. Para proteger las células de la escisión de ARN espurio, la mayoría de las ribonucleasas SLFN existen predominantemente como monómeros y esperan su activación mediante señales moleculares específicas de cada miembrode la familia 5,7,11,12.

La producción recombinante de SLFN14 humano ha permitido estudios moleculares exhaustivos de esta ribonucleasa hasta entonces poco estudiada, aportando nuevas perspectivas sobre su función y regulación 2,13,14. La proteína recombinante purificada SLFN14 ha acelerado la caracterización de su actividad de escisión de ARN de transferencia dependiente de la estructura utilizando ensayos in vitro de escisión. Los estudios de microscopía electrónica criogénica (cryoEM) de la proteína purificada SLFN14 también revelan una disposición de homodímeros SLFN14, donde el ARN duplado se carga en una hendiduracentral 2,13,14. El ensamblaje de orden superior de SLFN14 se caracterizó además por fotometría de masa, una técnica de molécula única para medir la masa molecular. De forma inesperada, esta técnica sensible demuestra que SLFN14 forma predominantemente un homodímero resistente a la sal, pero también puede formar un homotetramero sensible a la sal de funcióndesconocida 2,13,14. En conjunto, la capacidad de obtener proteína humana purificada de SLFN14 fue un hito crítico, que permitió obtener primeros conocimientos moleculares que sin duda impulsarán una nueva y emocionante fase de investigación sobre el control traslacional mediado por SLFN14.

La ribonucleasa SLFN14 recombinante ha sido históricamente difícil de adquirir utilizando estrategias estándar de producción de proteínas. El informe original que describía la actividad enzimática de SLFN14 señalaba su bajo rendimiento, disminución de estabilidad y bajasolubilidad 1. La proteína humana SLFN14 se caracteriza por una cadena polipeptídica larga, una hidrofobicidad pronunciada y citotoxicidad dependiente de ribonucleasa, que en conjunto dificultan en gran medida el uso de sistemas convencionales de expresiónbacteriana 1,13,14. Sin embargo, sofisticadas máquinas eucariotas de traducción y chaperona ofrecen una alternativa potente que produce eficazmente la proteína humana SLFN1415 de longitud completa. Se han empleado sistemas de expresión tanto de baculovirus-insectos como de mamíferos para obtener la proteína SLFN14 humana de longitud completa para estudios criogénicos y ensayosbioquímicos 2,13,14. Sin embargo, en algunos casos la proteína SLFN14 derivada de insectos requirió mutaciones estabilizadoras para evitar la agregación de lamuestra 2. La administración genética mediada por baculovirus también se asocia con un compromiso considerable de esfuerzo y un largo plazo de entrega que retrasa el progreso de lainvestigación 15,16. Por otro lado, la proteína recombinante SLFN14 aislada de un huésped de expresión mamífero ofrece la ventaja de la velocidad y evita la necesidad de ingeniería proteica en la optimización de muestras.

Este método está diseñado para proporcionar un enfoque relativamente rápido y de bajo esfuerzo para producir proteína SLFN14 recombinante de tipo salvaje adecuada para estudios moleculares posteriores. El uso de células de mamíferos proporciona un entorno casi nativo para preservar el plegamiento adecuado de proteínas sin necesidad de ingeniería de proteínas SLFN1413. Un método de entrega genética basado en químicos, en lugar de una estrategia de vectores virales, también acelera el calendario de producción de meses a días15. Para contrarrestar el coste relativamente alto del cultivo celular de mamíferos, este método utiliza el reactivo de transfección de polietilenimina (PEI) rentable y las células de riñón embrionario humano eficiente en transfección 293 (HEK293) cultivadas en suspensión17,18. Para minimizar la pérdida de proteínas durante el procesamiento de la muestra, este procedimiento también aprovecha estrategias de bajo consumo de muestras para la purificación de proteínas SLFN14 y el análisis estequiométrico para el control de calidad de la muestra. Este protocolo de cuatro días proporciona detalles específicos sobre cómo realizar 1) expresión génica transitoria en células HEK293, 2) un flujo de trabajo de cromatografía en dos pasos usando columnas de espín, y 3) determinación de la estequiometría de proteínas mediante fotometría de masas. El producto final de este procedimiento es una proteína humana tipo salvaje SLFN14 que alberga una etiqueta Myc-Flag doble C-terminal (SLFN14Myc-Flag) que puede utilizarse para estudios criogénicos posteriores y caracterización bioquímicacualitativa 13. Este enfoque versátil puede aplicarse para aislar y caracterizar otras proteínas de unión al ARN humano poco estudiadas, especialmente genes grandes y citotóxicos de ribonucleasa que a menudo son difíciles de sobreexpresar en sistemas de expresión heterólogos. Por lo tanto, este protocolo reduce la barrera para la caracterización molecular integral del proteoma humano.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Los experimentos que involucren cultivo celular de HEK293 deben realizarse bajo condiciones de Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2) de acuerdo con los protocolos institucionales aprobados de bioseguridad.

1. Expresión transitoria deMyc-Flag de SLFN14 en células de mamíferos

  1. Semillas de células de suspensión HEK293 de mamíferos a 0,5 x 106 células/mL en un medio de crecimiento precalentado y sin suero para un volumen final de 320 mL en un matraz ventilado y con deflector de 1 L.
  2. Incuba las células a 37 °C, 125 rpm, 8% de CO2, 75-80% de humedad durante 24-32 horas.
  3. Verifica que el recuento de células sea 1,2-1,8 x 106 células /mL y la viabilidad superior al 90% usando tinción azul de tripán y un contador celular19.
  4. Decante 40 mL de cultivo en ocho tubos cónicos.
  5. Cosechar las células por centrifugación a 400 x g durante 5 minutos a 20-25 °C.
  6. Descarta el medio de cultivo.
  7. Resuspende suavemente cada pellet celular en 38 mL de medio de transfección sin suero precalentado para un volumen final de 304 mL.
    NOTA: Los 16 mL restantes del volumen original de cultivo descrito en el paso 1.1 serán suministrados por la mezcla de transfección descrita en el paso 1.12.
  8. Transfiere las celdas a un nuevo matraz ventilado y con deflector de 1 L.
  9. En un tubo cónico, añadir 320 μg de ADN plasmídico purificado que codifica el genrecombinante SLFN14 Myc-Flag a 8 mL de medio de transfección libre de suero e incubar durante 5 minutos a 20-25 °C.
    NOTA: La concentración de plásmidos suele ser de 500 ng/μL a un volumen final de 640 μL.
  10. Simultáneamente con el paso 1.9, añadir 960 μg de PEI esterilizado con filtro de 0,22 μm a 8 mL de medio de transfección sin suero e incubar durante 5 minutos a 20-25 °C.
    NOTA: El material de trabajo suele ser de 1 mg/mL a un volumen final de 960 μL.
  11. Añadir lentamente la mezcla PEI (ver paso 1.10) gota a gota a la solución de ADN plasmídico recombinante (ver paso 1.9) e incubar 15 minutos a 20-25 °C.
  12. Añade lentamente 16 mL de la mezcla de ADN/PEI gota a gota a las células preparadas en el paso 1.8.
  13. Incuba las células a 37 °C, 125 rpm, 8% deCO2, 75-80% de humedad durante 48 horas.
  14. Decantar 40 mL de células transfectadas en ocho tubos cónicos.
  15. Cosechar las células transfectadas por centrifugación a 400 x g durante 5 minutos a 20-25 °C.
  16. Decantar el sobrenadante y almacenar los ocho pellets de celda a -80 °C.

2. Purificación recombinante SLFN14 en dos pasos conMyc-Flag

  1. Cromatografía de afinidad anti-bandera.
    Realizar el protocolo de cromatografía de afinidad anti-Flag en duplicado, usando cuatro bolitas celulares del paso 1.16 para cada preparación.
    1. Preparación de resina.
      1. Equilibrar la resina de agarosa anti-Flag a 20-25 °C durante 15 minutos.
      2. Resuspende suavemente la resina invirtiendo la botella justo antes de transferir 40 μL de suspensión de resina al 50% a un tubo microcentrífuga de 2 mL.
        NOTA: Corta el extremo de la punta de la pipeta para recoger fácilmente la mezcla viscosa.
      3. Resuspende la resina en 1 mL de tampón de lavado de alta sal (50 mM Tris pH 7,4, 600 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20).
      4. Incuba durante 45 minutos a 4 °C.
      5. Centrifuga la mezcla de resina a 8.000 x g durante 2 minutos a 4 °C.
      6. Aspira y descarta el buffer de alto contenido de sal con cuidado de no dañar la resina.
    2. Aclaración del lisado celular.
      1. Resuspender cada pellet de célula transfectada con 225 μL de tampón de resuspensión refrigerado (50 mM de Tris pH 7,4, 600 mM de NaCl, 5 mM deMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,5% de Triton-X-100, 1 mM de PMSF, 5 μg/mL de Leupeptina, 1 mM de Benzamidina, 0,7 μg/mL de Pepsistatina A, 0,25 U/mL de nucleasa Genius) para un volumen total de 900 μL en cuatro pellets celulares.
      2. Transfiere las células a un tubo microcentrífuga de 2 mL que ha sido preenfriado sobre hielo.
      3. Incuba el tubo de la microcentrífuga horizontalmente sobre un nutador durante 30 minutos a 4 °C.
        NOTA: Almacenar una alicuota de 20 μL de lisato total a -20 °C para solucionar problemas en caso de malos niveles de expresión proteica.
      4. Clarifica el lisato celular centrifugando a 21.300 x g durante 20 minutos a 4 °C.
    3. Captura de afinidad proteica y lavados.
      1. Combinar el lisato clarificado (véase el paso 2.1.2.4) con la resina anti-Flag equilibrada (véase el paso 2.1.1.6).
      2. Incubar la mezcla lisato-resina en un tubo microcentrífuga situado horizontalmente sobre un nutador durante 60 minutos a 4 °C.
      3. Centrifuga la mezcla lisato-resina a 8.000 x g durante 2 minutos a 4 °C para formar una pellet de resina.
      4. Descarte aproximadamente 700 μL de sobrenadante con cuidado de no dañar la pastilla de resina.
        NOTA: Almacenar una aliteracia de 20 μL de sobrenadante a -20 °C tras la unión de resina para la resolución de problemas en caso de baja eficiencia de captura.
      5. Resuspender la mezcla sobrinante de resina restante y transferir la solución a una columna de spin vacía de 800 μL que se insertó en un tubo vacío de microcentrífuga de 2 mL.
      6. Centrifuga la columna de centrifugación a 1.000 x g durante 2 minutos a 4 °C y descarta el flujo directo.
      7. Enjuaga el tubo vacío de la microcentrífuga del paso 2.1.3.5 con 500 μL de tampón de lavado de alta sal y transfiere la solución a la columna de spin.
        NOTA: Este paso ayuda a recuperar cualquier resina residual que quede en el tubo de la microcentrífuga.
      8. Centrifuga la columna de centrifugación a 1.000 x g durante 2 minutos a 4 °C y descarta el flujo directo.
      9. Añade 500 μL de tampón de lavado de alta sal a la columna de spin. Centrifuga la columna de centrifugación a 1.000 x g durante 2 minutos a 4 °C y descarta el flujo directo. Repite este paso para un total de cuatro lavados con alto contenido de sal.
      10. Añade 500 μL de tampón de lavado bajo en sal (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20) a la columna de spin. Centrifuga la columna de centrifugación a 1.000 x g durante 2 minutos a 4 °C y descarta el flujo directo. Repite este paso para un total de dos lavados bajos en sal.
      11. Añadir 500 μL de tampón de lavado ATP (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20, 10 mM ATP) a la columna de spin. Tapa la parte inferior de la columna de centrifugación e incuba durante 5 minutos a 4 °C. Desconecta la columna de centrifugación y la centrifugadora a 1.000 x g durante 2 minutos a 4 °C y descarta el flujo directo. Repite este paso para un total de cuatro lavados con ATP.
      12. Realiza un lavado final añadiendo 500 μL de tampón de lavado bajo en sal a la columna de spin. Centrifuga la columna de centrifugación a 1.000 x g durante 2 minutos a 4 °C y descarta el flujo directo.
    4. Elución de proteínas por 3xFlag Peptide.
      1. Seca la parte inferior de la columna de centrifugado con una pasada de pelusa baja para eliminar el exceso de líquido y tapa la parte inferior de la columna.
      2. Añade 55 μL de 3xFlag Elution Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20, 300 μg/mL 3xFlag peptide) directamente sobre la resina.
      3. Sella la abertura de la columna de spin con parafilm y coloca la columna en un tubo microcentrífuga de 1,7 mL.
      4. Incuba la columna de centrifugación verticalmente sobre un nutator durante 60 minutos a 4 °C.
        NOTA: Para mantener la columna de giro vertical, monta un soporte para tubos de microcentrífuga sobre el nutator con gomas elásticas.
      5. Quita el parafilm y el tapón de la columna de giro. Recoger la proteínaMyc-Flag recombinante eluída SLFN14 en un tubo microcentrífuga limpio de 1,7 mL mediante centrifugación a 1.000 x g durante 2 minutos a 4 °C.
      6. Conservar 50 μL de eluato de resina anti-Flag para cromatografía de exclusión de tamaño posterior y 5 μL para análisis SDS-PAGE.
  2. Cromatografía de exclusión de tamaño.
    Realizar el protocolo de cromatografía de exclusión de tamaño utilizando un Buffer de Desaltación de Baja Sal (150 mM NaCl) para el análisis estándar deproteínas Myc-Flag de SLFN14 o el Buffer de Desalinización de Alta Sal (500 mM NaCl) para la caracterización deMyc-Flag apo SLFN14.
    1. Combina dos eluados de resina anti-Flag de 50 μL del paso 2.1.4.6 para un total de 100 μL de muestra.
    2. Prepara una columna de desalación por spin de 0,5 mL con un corte de peso molecular de 40 kDa aflojando la tapa, retirando el cierre inferior e insertando la columna en un tubo microcentrífuga de 2 mL.
    3. Centrifuga la columna de desalación de centrifugación a 700 x g durante 1 minuto a 4 °C para eliminar la solución de almacenamiento de la columna. Descarta el flujo directo.
    4. Añade 300 μL de tampón de desalación de sal bajo o alto (20 mM Tris pH 7,4, 150/500 mM NaCl, 1 mMMgCl 2, 1 mM TCEP) a la columna de desalatura de spin. Centrifuga la columna de centrifugación a 700 x g durante 1-2 minutos a 4 °C y descarta el flujo directo. Realiza este paso tres veces para equilibrar completamente la columna.
    5. Seca la parte inferior de la columna de dessalado con una pasada de pelusa baja.
    6. Transfiere la columna de desalación de centrifugación a un tubo limpio de microcentrífuga de 1,7 mL.
    7. Añadir 100 μL de eluato combinado de resina anti-Flag (véase el paso 2.2.1) al centro del lecho de columna sin alterar la resina.
    8. Eluir la proteínaMyc-Flag recombinante SLFN14 centrifugando la columna de desalación de espín a 700 x g durante 2 minutos a 4 °C.
    9. Conservar 95 μL de proteína recombinante recuperada para caracterización molecular y 5 μL para análisis SDS-PAGE.
  3. Caracterizar la muestra purificada de proteínaMyc-flag de SLFN14 recombinante.
    1. Realizar electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE).
      1. Combinar 5 μL de 2 tampones de muestra de Laemmli con 5 μL de alicotas de muestra recogidas en distintas etapas a lo largo del protocolo de purificación.
      2. Calienta muestras a 95 °C durante 5 minutos.
      3. Resuelve una escalera proteica de amplio rango junto con 10 μL de mezcla de muestra y tampón de Laemmli mediante un 4-15% de SDS-PAGE a 200V durante 30 minutos.
      4. Visualiza las bandas proteicas teñiendo el gel con la solución de tinción Coomassie G-250 durante 30 minutos en un agitador orbital y destiende el gel con agua desionizada en un agitador orbital hasta que el fondo se despeje.
      5. Inspeccionar las bandas proteicas resultantes para asegurarse de que la muestra recuperada del paso 2.2.9 es una sola banda proteica que coincide con el peso molecular teóricode SLFN14 Myc-Flag de 107,5 kilodaltón (kDa).
    2. Cuantifica proteínas y ácidos nucleicos mediante espectrofotometría UV/vis.
      1. Dejar en blanco un espectrofotómetro de microvolumen con 2 μL de tampón de desalación de baja o alta sal, coincidiendo con el tampón de almacenamiento de proteínas.
      2. Mide la absorbancia a 260 nm y 280 nm a partir de 2 μL de proteína recombinante recuperada de la proteínaMyc-Flag de SLFN14 (véase el paso 2.2.9) utilizando un espectrofotómetro de microvolumen.
      3. Calcular la concentración de proteínarecombinante de la proteína Myc-Flag de SLFN14 usando la absorbancia registrada a 280 nm y su coeficiente de extinción (93330 M-1 cm-1) usando la Leyde Beer-Lambert 20.
      4. Calcular la relación de absorbancia de la muestra A260/280 dividiendo el valor de absorbancia registrado en 260 nm por el valor de absorbancia medido en 280 nm para determinar si el ácido nucleico está co-purificando con la proteínaMyc-Flag recombinante SLFN14.
        NOTA: Una proporción A260/280 superior a 0,7 probablemente indica la presencia de ácidonucleico 21.
    3. Cuantifica el ARN celular mediante fluorometría.
      1. Cuantifique el contenido de ARN utilizando 1-3 μL de proteína recombinante recuperada del paso 2.2.9 utilizando un colorante fluorescente específico deARN de alta sensibilidad 22.

3. Análisis de la masa molecularde Myc-Flag de SLFN14 mediante fotometría de masas

  1. Configuración de instrumentos de fotómetro de masa.
    1. Enciende el láser usando el interruptor en la parte trasera de la caja electrónica del fotómetro de masa.
    2. Enciende la cubierta de aislamiento y haz clic en el botón de "aislamiento" para minimizar las vibraciones del instrumento.
    3. Abre el software AcquireMP.
    4. Espera 1 hora a que el instrumento alcance el equilibrio térmico.
  2. Preparación de la diapositiva de cobertura.
    1. Sujeta una corredera de tapa de cristal en posición vertical usando pinzas de punta blanda.
    2. Enjuaga ambos lados de la lámina de la tapa de vidrio con agua ultrapura tipo I seguida de alcohol isopropílico. Repite este paso un total de tres veces.
    3. Enjuaga cada lado de la tapa de cristal una última vez con agua ultrapura tipo I durante 45 segundos.
    4. Retira suavemente el exceso de gotas de agua de la tapa de vidrio mediante aspiración usando una punta de pipeta limpia conectada a una línea de vacío.
    5. Guarda la portaobjetos de vidrio limpio en una caja de plástico forrada con papel de lente para transportarla al fotómetro de masa.
  3. Monta la corredera de la tapa en el instrumento.
    1. Coloca una junta de silicona de 6 pozos sobre la herramienta de alineación metálica usando pinzas de punta blanda.
    2. Coloca la tapa de cristal limpia del paso 3.2.5 encima de la junta de silicona y usa las pinzas de punta blanda para presionar suavemente alrededor de la junta de silicona.
      NOTA: No aplique presión sobre los pozos de muestra.
    3. Coloca una gota de aceite de inmersión sobre el óculo del fotómetro de masa.
    4. Gira la corredera de la tapa de cristal para que la junta de silicio apunte hacia arriba y coloca suavemente la corredera de la tapa de vidrio sobre el oculus usando pinzas de punta blanda.
    5. Asegura las esquinas superior izquierda e inferior derecha de la corredera de la tapa de cristal usando imanes.
    6. Bajo control lateral, selecciona el pozo superior izquierdo en el software AcquireMP para alinear el láser con el centro del pozo.
  4. Analiza los estándares de proteínas de amplio rango.
    1. Prepara una solución calibrante de 50x amplio rango (90 kDa a 1 MDa) diluyendo 1 μL de un material calibrante 500x en 9 μL de solución salina tamponada con fosfato.
    2. Prepara un material de trabajo calibrante 5x combinando 2 μL de la solución calibrante de rango amplio 50x del paso 3.4.1 en 18 μL de 1x solución salina tamponada con fosfato.
    3. Añade 10 μL de tampón de desalación de baja o alta salinidad filtrado de 0,22 μm en el pozo vacío.
      NOTA: Es importante comparar el búfer filtrado en este paso con el búfer utilizado para preparar la muestraMyc-Flag de SLFN14 en el paso 2.2.9.
    4. Cierra la tapa.
    5. En el foco Buscar, haz clic en "dilución de gotas" en el software AcquireMP para determinar el enfoque correcto del pozo de muestra.
    6. Añade 10 μL del material de trabajo calibrante 5x a la gota de tampón (ver paso 3.4.3) y haz un pipeteo suave arriba y abajo para mezclar la solución.
    7. Cierra la tapa.
    8. Examina la configuración del instrumento para confirmar que los valores de movimiento, señal, saturación y nitidez son estables y óptimos.
      NOTA: Los valores óptimos aparecerán azules y los valores atípicos de color naranja.
    9. Haz clic en "grabar" en el software AcquireMP para grabar un vídeo de 60 segundos.
    10. Guarda el archivo de resultados (.mpr) con un título descriptivo y una marca de tiempo.
  5. Crea una curva de calibración.
    1. Abre el software DiscoverMP.
    2. En la sección de medidas, haz clic en el botón "+ abrir" y ve al archivo de resultados del calibrante del paso 3.4.10.
    3. Haz doble clic en el archivo de estándares proteicos listados para ver los resultados.
    4. En configuración de gráficos, ajusta los límites de contraste a 0,00000 y -0,03000, respectivamente.
    5. Define manualmente una curva gaussiana para los primeros cuatro picos estándar de proteínas arrastrando el cursor a través de cada pico individual.
    6. Haz clic en "Crear" y selecciona "calibración de masa".
    7. Bajo el encabezado del calibrante, asigna cada pico calibrante ajustado del paso 3.5.5 a su masa molecular conocida de 86, 172, 258 y 344 kDa, respectivamente.
    8. Verifica que la curva de calibración tenga unR2 cercano a 1,0 y un error de masa máximo (MME) inferior al 2%.
    9. Haz clic en "confirmar calibración" y guarda el archivo de curva de calibración (.mc).
      NOTA: El fotómetro de masa debe recalibrarse cada hora.
  6. Analizar la proteínaMyc-flag recombinante SLFN14 en condiciones de baja y alta cantidad de sal.
    1. Preparar una solución de 50 μL de proteínaMyc-Flag recombinante SLFN14 de 50 nM (véase el paso 2.2.9) utilizando un tampón de desalación baja en sal para análisis estándar de muestras bajo condiciones fisiológicas de sal o un tampón de desalación alta de sal para la caracterización de muestras de proteínas apo.
    2. Centrifugar la mezcla proteica recombinante SLFN14Myc-Flag de 50 nM a 21.300 x g durante 10 minutos a 20-25 °C para eliminar el posible agregado proteico y el polvo.
    3. En control lateral, haz clic en "siguiente pozo" en el software AcquireMP.
    4. Carga 10 μL de tampón de desalación de sal filtrado de 0,22 μm en el pozo y cierra la tapa.
      NOTA: Es importante comparar el buffer filtrado en este paso con el buffer utilizado para preparar la dilución de la muestraMyc-Flag de SLFN14 en el paso 3.6.1.
    5. En el foco de buscar foco, haz clic en "dilución de gotas" para determinar el enfoque correcto del nuevo pozo de muestra.
    6. Carga 10 μL de la solución proteica recombinante SLFN14Myc-Flag de 50 nM desde el paso 3.6.2 hasta la gota tampón y haz una pipete suave para mezclar la muestra.
    7. Cierra la tapa y asegura los ajustes óptimos del instrumento según se describe en el paso 3.4.8.
    8. Haz clic en "grabar" en el software AcquireMP para grabar un vídeo de 60 segundos.
      NOTA: La resolución óptima de masa se logra a partir de un vídeo de 60 segundos con aproximadamente entre 1.000 y 4.000 conteos totales.
    9. Guarda el archivo de resultados (.mpr) con un título descriptivo y una marca de tiempo.
  7. Calcula la masa molecular y la estequiometría de la proteínaMyc-Flag recombinante SLFN14.
    1. En la sección de mediciones dentro del software DiscoverMP, haz clic en el botón "+ abrir" para seleccionar el archivo de resultados del paso 3.6.9.
    2. En calibraciones, haz doble clic en el archivo de curva de calibración creado en el paso 3.5.9 para aplicar la calibración.
    3. Define manualmente una curva Gaussiana para cada especie observada de SLFN14Myc-Flag arrastrando el cursor por cada pico para obtener un valor calculado de masa molecular.
    4. Calcular la masa molecular media de cada especie oligómera a partir de tres mediciones independientes, junto con su correspondiente desviación estándar.
    5. Determinar la estequiometría de la proteínaMyc-Flag recombinante SLFN14 evaluando la masa molecular media calculada con enteros del valor masico teórico del protómeroMyc-Flag de SLFN14.
      NOTA: La masa teórica de un monómeroMyc-Flag de SLFN14 es de 107,5 kDa, un dímero es de 215 kDa, un trímero de 322,5 kDa y un tetramérito de 430 kDa.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Un vector mamífero diseñado para la expresión génica transitoria de la proteínaMyc-Flag humana recombinante SLFN14 de longitud completa se ilustra en la Figura 1. Un flujo de trabajo de purificación en dos pasos muestra el aislamiento de la proteínaMyc-Flag de SLFN14 de células HEK293 (Figura 2A). Un gel desnaturalizante representativo exitoso de la proteínaMyc-Flag de SLFN14 purificada se muestr...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Varios pasos críticos subrayan el rendimiento y la versatilidad de este protocolo de producción de proteínas. Para maximizar el rendimiento de proteínas recombinantes, utilizamos células HEK293, que tienen una alta absorción de ADN plásmido extranjero y pueden cultivarse en suspensión para maximizar la densidad celular en todo el volumen23 del medio. El reactivo de transfección PEI se utiliza en este protocolo de entrega de transgenes a gran escala porque puede lo...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del laboratorio Pillon su lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo contó con el apoyo del Programa de Investigación Extramuros del Instituto Nacional de Salud de EE. UU., del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS; R35GM147123 a M.C.P.) fue asignado al Baylor College of Medicine y transferido a la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-mercaptoetanol (b-Me)SigmaM3148-500ML14.3 M soluciones tack
AcquireMP 2024 R2Refeyn/Software de adquisición de datos
Adenosina-5'-trifosfato sal disódica trihidrato (ATP)Chem-Impex International00015-100Gajustar la solución a pH 7,0
Gel de afinidad anti-bandera M2MilliporeA2220Resina de afinidad anti-bandera
Hidrato de clorhidrato de benzamidinaSigmaB6506-25GInhibidor de la proteasa
Estándares de proteínas de amplio rango (10-250 kDa)Bio-RadP7719SEstándares de proteínas prestainadas
Condesa 3InvitrogenA49862Contador de celdas automatizado
DiscoverMP v2024 R2Refeyn/Software de análisis de datos
Solución salina tamponada con fosfato de DulbeccoCorning21-031-CVCulata solución 1x
Péptido DYKDDDDKThermo Fisher ScientificA36805Péptido 3xFlag
Celdas FreeStyle 293-FThermo Fisher ScientificR79007Células de suspensión de mamíferos
Nucleasa Geniust M DMF archivadaSanta CruzSC-391121BNucleasa universal
HyClone CDM4HEK293 mediosCytivaSH3085802Medio de crecimiento sin suero
Medios HyClone SFM4Transfx-293CytivaSH3086002Medio de transfección transitorio
Immersol 518FZeiss4Y00-R0DY-1007-3BF3Aceite de inmersión
Alcohol isopropílicoMacron Fine Chemicals3032-02
Búfer de muestras de LaemmliBio-Rad1610737Culata solución 2x
LeupeptinaVWRJ580-25MGInhibidor de la proteasa
Cloruro de magnesio hexahidrato (MgCl2)Fisher ScientificM33-500
MassFerence P1 RefeynMP-CON-41033Culata calibrante 500x
Kit de preparación de muestras UC de MassGlassRefeynMP-CON-21022Corredera y junta
Columna micro bio-espínBio-Rad7326204columna de espín de polipropileno vacía
Sistema Milli-Q IQ 7000MilliporeZIQ7000T0CAgua ultrapura tipo I
Geles Mini-Protean TGX libres de tintesBio-Rad45680864-15% SDS-PAGE
Minitron con humedad, refrigeración y CO2Infors72175Agitador incubador
Kit de alineación MPRefeynMP-CON-21019herramienta de alineación, pinza de punta blanda, imán
NanofotómetroImplícitoNP80Espectrofotómetro de visión ultravioleta
NutatorClay Adams Brand421105
Pepstatina ASanta CruzSC-45036BInhibidor de la proteasa
Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)Productos de Investigación InternacionalP20270-25.0Inhibidor de la proteasa
Matraz de batido de policarbonato Duran Wheaton KimbleWPFBC1000SMatraz de base ventilado y con deflector
Polietilenimina (PEI) MW 40.000Policiencias24765Reactivo de transfección
Fluorómetro Qubit 4Thermo Fisher ScientificP33226
Kit de ensayo de alta sensibilidad para ARN de qubitsThermo Fisher ScientificP32852cuantificación usando colorante específico de ARN
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6065Coomassie G-250
ADN plasmídico de expresión de SLFN14OrígenesRC226257clon ORF etiquetado como humano
Cloruro de sodio (NaCl)Millipore1.37017
Tris, pH 7,4Thermo Fisher ScientificJ60202. K21 M de solución bufferizada
Tris (2-carboxietil) fosfina cloruro (TCEP)Biotecnología del OroTCEP10TCEP
Triton X-100VWRM143-1Ldetergente
Tinte azul de tripánThermo Fisher ScientificT10282Acciones de solución al 0,4%
Preadolescentes 20VWR0777-1Ldetergente
TwoMPRefeynMP-PRO-00001Fotómetro de masa
Columna Zeba 40K DesaltinThermo Fisher ScientificA57759Cromatografía de exclusión por tamaño

Referencias

  1. Pisareva, V. P., Muslimov, I. A., Tcherepanov, A., Pisarev, A. V. Characterization of novel ribosome-associated endoribonuclease slfn14 from rabbit reticulocytes. Biochemistry. 54 (21), 3286-3301 (2015).
  2. Li, M., et al. Human schlafen 14 cleavage of short double-stranded rnas underpins its antiviral activity. Adv Sci (Weinh). 12 (37), e01727(2025).
  3. Seong, R. K., et al. Schlafen 14 (slfn14) is a novel antiviral factor involved in the control of viral replication. Immunobiology. 222 (11), 979-988 (2017).
  4. Jo, U., Pommier, Y. Structural, molecular, and functional insights into schlafen proteins. Exp Mol Med. 54 (6), 730-738 (2022).
  5. Lee, S., et al. Velcrin-induced selective cleavage of trna(leu)(taa) by slfn12 causes cancer cell death. Nat Chem Biol. 19 (3), 301-310 (2023).
  6. Murai, J., Thomas, A., Miettinen, M., Pommier, Y. Schlafen 11 (slfn11), a restriction factor for replicative stress induced by DNA-targeting anti-cancer therapies. Pharmacol Ther. 201, 94-102 (2019).
  7. Zhang, P., et al. Schlafen 11 triggers innate immune responses through its ribonuclease activity upon detection of single-stranded DNA. Sci Immunol. 9 (96), eadj5465(2024).
  8. Li, M., et al. Codon-usage-based inhibition of hiv protein synthesis by human schlafen 11. Nature. 491 (7422), 125-128 (2012).
  9. Valenzuela, C., Saucedo, S., Llano, M. Schlafen14 impairs hiv-1 expression in a codon usage-dependent manner. Viruses. 16 (4), (2024).
  10. Metzner, F. J., et al. Mechanistic understanding of human slfn11. Nat Commun. 13 (1), 5464(2022).
  11. Garvie, C. W., et al. Structure of pde3a-slfn12 complex reveals requirements for activation of slfn12 rnase. Nat Commun. 12 (1), 4375(2021).
  12. Kugler, M., Metzner, F. J., Witte, G., Hopfner, K. P., Lammens, K. Phosphorylation-mediated conformational change regulates human slfn11. Nat Commun. 15 (1), 10500(2024).
  13. Van Riper, J., et al. Cryoem structure of the slfn14 endoribonuclease reveals insight into rna binding and cleavage. Nat Commun. 16 (1), 5848(2025).
  14. Luo, M., et al. Structural and functional characterization of human slfn14. Nucleic Acids Res. 53 (10), (2025).
  15. Schellenberg, M. J., Maheshwari, S., Pillon, M. C. Encyclopedia of cell biology. Vol. 1, Elsevier. 57-73 (2022).
  16. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system. J Vis Exp. (173), e62510(2021).
  17. Ojha, R., Timin, E., Szirovicza, L., Xu, W., Hepojoki, J. A systematic comparison of in-house prepared transfection reagents in the delivery of mrna or DNA to a wide range of cultured cells. J Biol Chem. 301 (12), 110742(2025).
  18. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension. J Vis Exp. (106), e53568(2015).
  19. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell counting and viability assessment of 2d and 3d cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay. Biol Proced Online. 19, 8(2017).
  20. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4 (11), 2411-2423 (1995).
  21. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. Biotechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  22. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the qubittm rna hs assay using rna spike-in. BMC Mol Biol. 16, 9(2015).
  23. Swiech, K., et al. Transient transfection of serum-free suspension hek 293 cell culture for efficient production of human rfviii. BMC Biotechnol. 11, 114(2011).
  24. Gu, J., et al. Correction: Advances in the structures, mechanisms and targeting of molecular chaperones. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 117(2025).
  25. Bernhard, H., et al. Structural basis of spliced leader rna recognition by the trypanosoma brucei cap-binding complex. Nat Commun. 16 (1), 685(2025).
  26. Lai, S. H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211(2021).
  27. Liu, H., May, K. Disulfide bond structures of igg molecules: Structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function. MAbs. 4 (1), 17-23 (2012).
  28. Marenchino, M., Armbruster, D. W., Hennig, M. Rapid and efficient purification of rna-binding proteins: Application to hiv-1 rev. Protein Expr Purif. 63 (2), 112-119 (2009).
  29. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Sci Adv. 7 (46), eabk0734(2021).
  30. Carrasco-Zanini, J., et al. Mapping biological influences on the human plasma proteome beyond the genome. Nat Metab. 6 (10), 2010-2023 (2024).
  31. Adhikari, S., et al. A high-stringency blueprint of the human proteome. Nat Commun. 11 (1), 5301(2020).
  32. Liao, J. Y., et al. Rbpworld for exploring functions and disease associations of rna-binding proteins across species. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D220-D232 (2025).
  33. Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcarcel, J., Hentze, M. W. Rna-binding proteins in human genetic disease. Nat Rev Genet. 22 (3), 185-198 (2021).
  34. Poodts, J., et al. Improved expression of sars-cov-2 spike rbd using the insect cell-baculovirus system. Viruses. 14 (12), (2022).
  35. Mckenzie, E. A., Abbott, W. M. Expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Methods. 147, 40-49 (2018).
  36. Shi, X., Jarvis, D. L. Protein n-glycosylation in the baculovirus-insect cell system. Curr Drug Targets. 8 (10), 1116-1125 (2007).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Producción de proteínas recombinantesproteínas de unión al ARNcélulas HEK293 en suspensióncromatografía de afinidadcromatografía de exclusión molecularestequiometría proteicagel de SDS-PAGEcaracterización bioquímica
Producción rápida de ribonucleasa humana SLFN14 recombinante y análisis estequiométrico mediante fotometría de masas
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.