Artículo de método

Mapeo de la morfología de las células estrelladas hepáticas en modelos murinos de fibrosis hepática

DOI:

10.3791/70396

⸱

13 de febrero de 2026

 , 
1Division of Liver Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo presenta una cadena de imagen completa para visualizar y modelar la morfología de las células estrelladas hepáticas en tejido hepático intacto. Este enfoque combina marcaje fluorescente de fibroblastos usando genética de ratón, preparación tisular in situ basada en perfusión hepática y un método modificado de limpieza de tejidos iDISCO para lograr transparencia óptica.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los fibroblastos residentes en los tejidos son los motores celulares de la fibrosis en los tejidos. Dentro del hígado, las células estrelladas hepáticas (HSCs), los pericitos residentes con su morfología "similar a una estrella", se activan en miofibroblastos fibrogénicos durante la lesión para producir la cicatriz hepática. Aunque décadas de trabajo han aclarado las principales vías de señalización subyacentes a la activación del HSC, la importancia funcional de su morfología dendrítica distintiva sigue siendo esquiva debido a limitaciones técnicas en la imagen y el análisis. Este protocolo presenta una amplia cadena de imágenes para visualizar y modelar la morfología de los HSC en tejido hepático intacto. Este enfoque combina marcaje fluorescente de HSCs usando genética de ratón, preparación tisular in situ basada en perfusión hepática y un método modificado de limpieza de tejidos iDISCO para lograr transparencia óptica en muestras de tejido que pueden tener varios centímetros de grosor. Las muestras autorizadas se visualizan utilizando plataformas optimizadas de microscopía confocal, y los conjuntos de datos de imágenes se procesan mediante un flujo de trabajo de análisis personalizado para la reconstrucción tridimensional de HSCs individuales a resolución de célula única. En conjunto, esta canalización permite el mapeo reproducible de la morfología de los HSC dentro del complejo microambiente hepático, incluyendo sus procesos dendríticos y relaciones espaciales con las células vecinas. Más allá del hígado, el flujo de trabajo es adaptable a fibroblastos en otros órganos, como el pulmón, el riñón, el intestino y el corazón, donde las células mesenquimales residentes presentan roles fibrogénicos similares en la enfermedad. Por tanto, el marco propuesto establece una base metodológica para estudios comparativos entre órganos que exploren las relaciones estructura-función de los fibroblastos y las vulnerabilidades terapéuticas en enfermedades fibróticas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fibrosis, o cicatrización patológica del tejido, es la vía común final para casi todas las enfermedades crónicas de órganos y contribuye aproximadamente al 40% de las muertes en paísesindustrializados. En el hígado, la fibrosis surge de insultos crónicos como la hepatitis viral, el consumo de alcohol o, cada vez más, la enfermedad hepática esteatosiva asociada a disfunciones metabólicas (MASLD), que actualmente afecta al 30-40% de los adultos en EE. UU. Los insultos crónicos al hígado y la fibrosis progresiva resultante aumentan drásticamente el riesgo de enfermedades hepáticas terminales como cirrosis, insuficiencia hepática y carcinomahepatocelular 2. 3,4,5.

Las células estrelladas hepáticas (HSCs) son fundamentales para la homeostasis hepática y la fibrogénesis. En hígados sanos, los HSC existen en estado de reposo, almacenando vitamina A, y contribuyen a la homeostasis de los hepatocitos y, en general, de todo elhígado 6,7. Esto queda claramente demostrado por estudios de agotamiento de HSC, donde la eliminación de casi todas las HSC en hígado sano disminuye la masa hepática y limita severamente la regeneraciónhepática 7,8. Tras la lesión, los HSC se activan en células similares a miofibroblastos que proliferan, migran a las zonas dañadas y producen una matriz extracelular (ECM) excesiva, formando cicatrices fibróticas. Los HSC activados en hígado fibrótico también son la fuente de fibroblastos asociados al cáncer y desempeñan un papel promotor tumoral en el carcinomahepatocelular 9,10,11,12. Los HSC en quiescente poseen una morfología única similar a la neurona, con pequeños cuerpos celulares desde los que se extienden proyecciones a largo alcance. Los HSC adoptan una forma plana y en forma de lámina de miofibroblastos cuando se activan en lafibrosis 13. Aunque décadas de trabajo han esclarecido las vías de señalización que controlan la producción de ECM por parte de los HSC, la importancia funcional de su morfología neuronal distintiva, cómo se regula, si podría facilitar interacciones dentro del nicho de los HSC y contribuir a la fibrogenicidad y enfermedad del HSC siguen siendoesquivas 14,15.

Los métodos actuales para visualizar la morfología de los HSC se limitan a imágenes bidimensionales (2D) de células cultivadas in vitro o secciones de tejido in vivo , y rara vez capturan la morfología completa de los HSC con proyecciones que extienden varias longitudes de cuerpo celular en todas las direcciones. Además, el marcador de HSC más comúnmente utilizado, la desmina, no puede capturar completamente la morfología única tipo neurona de los HSCs en la tinción por inmunofluorescencia, ya que la desmina es una proteína del citoesqueleto que solo marca filamentos intermedios dentro de losHSCs 16. Estos desafíos metodológicos hasta ahora dificultaban la capacidad de captar completamente la morfología de los HSC y sus interacciones celulares de forma tridimensional (3D) en su contexto natural con resolución de una sola célula. Como resultado, han permanecido sin resolver cuestiones fundamentales sobre cómo la morfología de los HSC se relaciona con su estado funcional y sus interacciones con tipos celulares vecinos.

Este artículo presenta una innovadora y completa cadena de imágenes y análisis para visualizar y modelar la morfología de los HSC en tejido hepático intacto. Este método integra varias innovaciones clave: (1) marcado fluorescente de HSCs usando modelos genéticos de ratón reportero, (2) perfusión y fijación hepática optimizada in situ para preservar la arquitectura tisular intacta y las relaciones celulares, (3) un protocolo modificado de limpieza tisular basado en iDISCO para lograr transparenciaóptica 17, (4) microscopía confocal de alta resolución para la captura de imágenes de tejido profundo, y (5) un flujo de trabajo computacional personalizado para la reconstrucción de imágenes 3D y cuantitativa análisis de HSCs individuales. El protocolo impone ciertas restricciones sobre el tamaño del tejido y el compromiso de tiempo que deben tenerse en cuenta. En conjunto, este protocolo proporciona un marco robusto y reproducible para capturar la compleja estructura 3D de los HSCs y para mapear sus relaciones espaciales con células vasculares, inmunitarias y parenquimales vecinas. Las estrategias y canales presentados aquí para el hígado también son fácilmente adaptables a otrosórganos 17,18,19.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos con ratones utilizados en este estudio han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina Icahn de Mount Sinai. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Generación de ratones con HSCs etiquetados con tdTomato (TdT)

  1. Establecer criadores de Tg(lox-stop-lox-TdTomato) x Tg(Lrat:Cre) (la cepa #00791420 de Jackson Laboratories y la cepa MMRRC #06959521-JAX de Mutant Mouse Resource and Research Centers (MMRRC), respectivamente).
    NOTA: Espera arena después de 3 semanas. Utiliza hembras de LratCre para la reproducción, ya que se ha detectado cierta expresión de Cre en la línea germinal masculina.
  2. Recoger colas y la camada del genotipo F1 para identificar Tg(Lrat:Cre); Ratones Tg(LSL-TdT) que expresan selectivamente el fluoróforo TdTomato en células estrelladas hepáticas.

2. Perfusión hepática in situ y fijación

  1. Montaje previo a la cirugía
    1. Prepara una mezcla de ketamina/xilazina para anestesia de ratones mezclando 2 mL de ketamina, 1 mL de xilazina y 7 mL de agua.
      NOTA: La ketamina es una sustancia controlada y requiere una licencia y regulación adecuadas para su uso en laboratorio.
    2. Prepara la solución de perfusión de paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    3. Configura la bomba peristáltica dejando que 1 PBS fluya a través del tubo y ajusta el caudal a 2 mL/min.
      NOTA: Asegúrate de que no haya burbujas de aire en el tubo.
  2. Pesa al ratón para determinar la cantidad de la mezcla de ketamina/xilazina a inyectar.
  3. Inyecta la mezcla de ketamina/xilazina intraperitonealmente en el ratón.
    NOTA: Inyectar 200 μL de la mezcla por cada 20 g de peso del ratón.
  4. Coloca al ratón en un recipiente con tapa y espera aproximadamente 20 minutos a que esté completamente anestesiado.
    NOTA: Pellizca el dedo del ratón para comprobar la ausencia de reflejos. Asegúrate de que el ratón siga vivo cuando inicie la perfusión.
  5. Transfiere al ratón del recipiente de cristal a la plataforma quirúrgica en posición supina.
    PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico y volátil; Por lo tanto, realiza el procedimiento de perfusión en una capucha química. Recoger y eliminar correctamente el flujo de PFA conforme a las directrices institucionales de bioseguridad.
  6. Pellizca las palmas del pie del ratón con pinzas para asegurarte de que el ratón no tenga movimientos de reflejos o espasmos.
  7. Apuñala 4 palmas con agujas para separar el abdomen del ratón.
  8. Rocía el abdomen con etanol al 70% para mojar el pelo.
  9. Utiliza pinzas para levantar la piel en el centro del abdomen, alinear con las patas traseras y empezar a cortar la piel (ambas capas) para revelar el abdomen.
  10. Utiliza hisopos de algodón húmedos con PBS para mover los intestinos y otros órganos hacia un lado y levantar el lóbulo izquierdo.
  11. Corta cuidadosamente la membrana unida entre el lóbulo izquierdo y el lóbulo caudado.
  12. Usa una sutura para atar en la base superior del lóbulo izquierdo.
  13. Corta el lóbulo izquierdo por debajo del nudo de sutura y reserva el lóbulo izquierdo para la recogida y procesamiento de muestras de tejido, dependiendo de las necesidades experimentales (como congelación directa en nitrógeno líquido, incrustación en compuesto de temperatura óptica de corte (OCT) o fijación de formalina).
  14. Utiliza bastoncillos de algodón húmedos con PBS para mover el hígado y revelar la vena porta.
  15. Inserta cuidadosamente la aguja del catéter en la vena porta, aproximadamente a mitad de la longitud de la vena porta.
    NOTA: Para ayudar con la inserción del catéter, levanta el cuerpo del ratón colocando una pinza bajo el cuerpo para asegurar una superficie más plana. Alinea cuidadosamente la aguja del catéter lo más paralela posible con la vena porta antes de la inserción.
  16. Quita la aguja del catéter.
    NOTA: Asegúrese de que haya un flujo de sangre a través del catéter para indicar la inserción exitosa.
  17. Arranca la bomba de perfusión a un caudal de 2 mL/min, conecta el tubo con el catéter y perfunde el hígado con 20 mL de PBS 1x.
    NOTA: Asegúrese de que el catéter esté completamente lleno de sangre y que el tubo esté completamente lleno con el buffer de perfusión antes de conectarlos para asegurarse de que no se introduzcan burbujas de aire en el sistema.
  18. Pinza la arteria pulmonar por encima del hígado con un hemostat para evitar que el PBS 1x atraviese el corazón.
  19. Corta la vena cava inferior para liberar la acumulación de presión.
  20. Ajusta la velocidad de la bomba a 5 mL/min.
    NOTA: Deja aproximadamente 15 minutos para terminar la perfusión.
  21. Para la bomba para cambiar el depósito al 4% de PFA.
    NOTA: Asegúrate de no introducir burbujas de aire en el tubo deteniendo la bomba cuando aún haya líquido en el depósito.
  22. Perfunda el hígado con 25 mL de PFA al 4%.
  23. Una vez completada la perfusión, se extrae el hígado de los órganos circundantes cortando los tejidos conectados.
  24. Coloca el hígado en un tubo cónico de 50 mL, lleno con 25 mL de PFA al 4%.
  25. Coloca el tubo horizontalmente sobre una plataforma de mecedor durante 1 hora a temperatura ambiente a 1,5 rpm, para asegurar el movimiento de la solución.
  26. Lava el hígado 3 veces en 1x PBS sobre una plataforma de mecedora durante 30 minutos cada una a temperatura ambiente a 1,5 rpm.
  27. Guarda el hígado en 20 mL 1x PBS con 0,02% deNaN 3 a 4 °C.
    NOTA: Almacena el hígado a largo plazo en esta etapa, al menos hasta un año.

3. Limpieza de tejidos basada en iDISCO+

NOTA: La descripción original del protocolo iDISCO+ está disponible en el 17

Día 1: Deshidratación de muestra

  1. Corta las muestras de hígado en trozos de aproximadamente 0,5-1cm 3.
    NOTA: Corta diferentes muestras en distintas formas para facilitar la detección durante los pasos de imagen.
  2. Prepara diluciones de metanol al 20% (vol/vol), 40%, 60% y 80% en agua en botellas de cristal separadas.
  3. Coloca muestras de hígado en frascos de vidrio con tapas roscadas (por ejemplo, 4-7 mL).
    NOTA: Coloca hasta 6 trozos de muestra de hígado en un vial de cristal de 7 mL.
  4. Deshidrata la muestra usando la dilución de metanol en la serieH2O, 20% (vol/vol), 40%, 60% y 80% durante 1 h cada uno a temperatura ambiente en un rotador de rueda a 8 rpm, sin que se produzca centrifugación.
  5. Lava la muestra con otro metanol al 100% en un rotador de rueda a 8 rpm, sin centrifugación durante 1 hora a temperatura ambiente.
  6. Enfría la muestra a 4 °C durante 30 minutos a 1 hora.
  7. Preparar diluciones DCM al 66% (vol/vol) en metanol en una botella de cristal.
    NOTA: Prepara nuevas diluciones cada vez. Utiliza cilindros de vidrio para preparar la solución, ya que la DCM puede disolver plástico, como el poliestireno.
  8. Incubar muestras en solución de DCM/metanol al 66% durante la noche en un rotador de rueda a 8 rpm a temperatura ambiente, sin centrifugación.
    NOTA: Cuidado con las muestras que flotan hacia la superficie una vez que se añade la solución.

Día 2: Muestreo de blanqueamiento

  1. Lava la muestra dos veces con metanol al 100% en un rotador de rueda a 8 rpm, sin centrifugación durante 1 hora cada vez a temperatura ambiente.
  2. Enfría la muestra a 4 °C durante 30 minutos a 1 hora.
  3. Blanquear la muestra en 5% de H2O2 refrigerado en metanol (1 volumen de 30%H 2O 2 a 5 volúmenes de metanol), sobre un rotador de rueda a 8 rpm, sin centrifugación, a 4 °C durante la noche.
    NOTA: Prepara una solución nueva cada vez.

Días 3-5: Permeabilización de la muestra

  1. Rehidratar con metanol/Hserie 2O: 80%, 60%, 40%, 20%, 1x PBS durante 1 hora a temperatura ambiente en un rotador de rueda a 8 rpm, sin que se produzca centrifugación.
  2. Lavar la muestra dos veces en PTx.2 (Tabla 1) durante 1 hora cada uno a temperatura ambiente en un rotador de rueda a 8 rpm, sin que se produzca centrifugación.
  3. Incubar las muestras en la Solución de Permeabilización (Tabla 1) a 37 °C durante 2 días.

Días 5-17: Inmunomarcaje

  1. Bloquea las muestras en la solución bloqueante (Tabla 1) durante 2 días a 37 °C.
    NOTA: Prepara una solución de bloqueo nueva cada vez debido a la inestabilidad del suero de burro. Guarda la solución bloqueadora sobrante a 4°C hasta un mes.
  2. Incubar las muestras en anticuerpos primarios diluidos en PTwH (Tabla 1) con 5% de DMSO y 3% de suero de burro a 37 °C sobre un rotador de rueda a 5 rpm, sin que se produzca centrifugación durante 4 días.
    NOTA: Empieza con una dilución primaria de anticuerpos a 1:500.
  3. Lava las muestras en PTwH 4-5 veces durante 1 hora cada una a temperatura ambiente en un rotador de rueda a 8 rpm, sin que se produzca centrifugación.
    NOTA: Opcionalmente, deja las muestras lavadas toda la noche.
  4. Incubar las muestras en anticuerpos secundarios y yoduro de propidio diluido en PTwH con suero de burro al 3% a 37 °C en un rotador de rueda a 5 rpm, sin centrifugación durante 4 días.
    NOTA: Empieza con una dilución secundaria de anticuerpos a 1:500. Utiliza una dilución de yoduro de propidio 1:250 a partir de una solución de yoduro de propidio de 5 mg/mL.
  5. Lava las muestras en PTwH 4-5 veces durante 1 hora cada una a temperatura ambiente en un rotador de rueda a 8 rpm, sin que se produzca centrifugación.
  6. Deja la muestra lavada en PTwH toda la noche, a temperatura ambiente en un rotador de rueda a 8 rpm, sin que se produzca centrifugación.

Día 18: Despeje

  1. Deshidrata la muestra usando la dilución de metanol en la serieH2O, 20% (vol/vol), 40%, 60%, 80% durante 1 hora cada uno a temperatura ambiente en un rotador de rueda a 8 rpm, sin que se produzca centrifugación.
  2. Lava la muestra dos veces con metanol 100% en rotación durante 1 hora a temperatura ambiente en un rotador de rueda a 8 rpm, sin centrifugación.
  3. Incubar la muestra en diluciones DCM al 66% (vol/vol) en metanol durante 3 horas a temperatura ambiente en un rotador de rueda a 8 rpm, sin que se produzca centrifugación.
  4. Lava la muestra dos veces en DCM 100% durante 15 minutos a temperatura ambiente en un rotador de rueda a 8 rpm, sin que se produzca centrifugación.
  5. Incubar la muestra en DBE durante la noche a temperatura ambiente antes de la imagen.
  6. Almacena las muestras a largo plazo en DBE hasta 1 año sin afectar la señal de tinción.

4. Imagen por microscopía confocal

  1. Coloca la muestra despejada en un recipiente de fondo de cristal de 35 mm con fondo de cristal #1.5.
  2. Rellena el plato con etílica caninato para sumergir completamente la muestra.
  3. Coloca el plato en el confocal y ajusta el enfoque para identificar el mejor plano que da la señal más brillante.
  4. Adquirir una imagen de mosaico en el plano más brillante para capturar una gran área de la muestra, usando formato 1024 x 1024 y velocidad 600.
    NOTA: Utiliza un objetivo más bajo (10x o 20x) para la imagen del mosaico y así reducir el tiempo de imagen y el tamaño del archivo.
  5. En función de la imagen de mosaico, selecciona las regiones de interés para obtener un z-escaneo de mayor resolución.
  6. Captura una z-scan a través del tejido despejado, cubriendo toda la profundidad del tejido con la mejor resolución del microscopio, usando formato 1024 x 1024 y velocidad 600.
    NOTA: Usa un objetivo de 40x en inmersión en aceite para conseguir la mejor resolución para HSC.
  7. Guarda archivos de imagen en formato LIF y visualiza archivos usando Fiji o ImarisViewer 11.0.0.

5. Análisis de imágenes para reconstrucción 3D y análisis cuantitativo de HSCs individuales

  1. Convierte archivos de imagen a formato IMS usando ImarisFileConverter 10.2.0.
  2. Utiliza el modelo Surface en Imaris 10.2.0 para detectar el objeto en las imágenes.
  3. Utiliza el asistente de Creación para realizar análisis de una región 3D seleccionada de interés y luego aplícalo a toda la imagen.
    NOTA: Utiliza esto para acelerar el proceso de análisis.
  4. Selecciona el canal de origen, la intensidad absoluta y desmarca el botón de suavizado para definir el umbral de intensidad de toda la imagen.
  5. Modifica el umbral para capturar todos los objetos de la imagen.
  6. Utiliza el número de vóxeles para filtrar los objetos de resto.
  7. Finaliza el asistente, pulsa el botón estadístico para obtener todas las mediciones estadísticas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La perfusión y fijación exitosas del hígado del ratón se representan por un color uniforme pálido y beige-amarillo del hígado, reflejando una eliminación eficiente de sangre y la penetración del fijador (Figura 1A,B). Una perfusión incorrecta provoca coágulos de sangre rojo oscuro o marrón, lo que reduce la claridad óptica y conduce a una alta señal de fondo en estas regiones de la muestra (Figura 1C).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe una cadena de preparación de muestras reproducible y adaptable que conduce a la visualización tridimensional y al análisis cuantitativo de la morfología de los HSC en tejido hepático intacto. La integración del marcaje genético de células fluorescentes, la perfusión hepática in situ y un método modificado de limpieza iDISCO+ permite la obtención de imágenes de grandes volúmenes tisulares a resolución unicelular, preservando la arquitectura espacial del mi...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo cuenta con el apoyo de 1R01 DK136016-01 y 5P30CA196521 (subvención del centro NCI). La microscopía y/o el análisis de imágenes se realizaron en el Microscopy and Advanced Bioimaging CoRE de la Icahn School of Medicine en Mount Sinai. Esta investigación fue apoyada en parte por el Instituto del Cáncer Tisch en Mount Sinai, P30 CA196521 - Cancer Center Support Grant.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo RFP, conejo, preadsorbidoRockland600-401-379
Antena inferior de vidrio de 4 cámaras de 35 mm con micropozo de 20 mm, vidrio cubierto #1.5CellvisD35C4201.5N
Inyección de AnaSed (inyección de xilazina)Akorn, Inc.NDC 593990110-2020 mg/mL
Tubos cónicos de centrifugadora: 50 ml y nbsp;Halcón352098
Hisopos de algodónMedlineMDS202000
Bloqueo curvo   HemostatsFisher Scientific16-100-117
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG conjugado con Cy3 (H+L)Jackson ImmunoResearch712-165-153
Tijeras de operación delicadas de 4,75" curvas afiladas/romasInstrumento Quirúrgico Roboz
728501
Éter dibenzílico (DBE), 98%Sigma Aldrich108014
Diclorometano (DCM),   ≥ 99.8%Sigma Aldrich270997
Dimetilsulfóxido (DMSO), ≥ 99.9%Sigma AldrichD8418
Anticuerpo secundario adsorbido cruzado de Bunkey anti Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA31573
Suero de burroEMD MilliporeS30
Etil-cinnamato, 99%Sigma Aldrich112372
Tijeras Microdiseccionadoras Extra Finas; Hoja de 24 mmFisher ScientificNC9232515
Rata de anticuerpos monoclonales F4/80ThermoFisher Scientific14-4801-82
FiyiNIH
PinzasFisher ScientificNC9214139
GlicinaBio-Rad1610718
Heparina Sal SódicaChem-Impex29984
Horno de hibridación de hibaidesTriad ScientificMaxi 14
Peróxido de hidrógeno, 30 %Sigma Aldrich31642
Software Imaris 10.2.0Oxford Instruments
Software ImarisFileConverter 10.2.0Oxford Instruments
ImarisViewer 11.0.0Oxford Instruments
Catéter IVExel International Inc.EXE 26751
Ketamina, inyección de cloruroDechraB8U4100 mg/mL
Software LAS X 4.4.0.24861Leica
Microscopio Confocal Leica Stellaris 8Leica
Metanol, grado HPLCFisherA452-2
Rotador multiusosIndustrias Científicas, Inc.Modelo 151
Agujas (27G x 1/2'')BD305109
Paraformadehilo, polvo, 95%Sigma Aldrich158127
Bomba peristálticaGilsonModelo Minipuls 3
Tubo de bomba peristáltica, MasterFlexTermo Científica96400-16Tubo de bomba de silicona curado con peróxido de 3,1 mm diámetro diámetro diametral x 7,6 m L/S, tamaño L/s 16, espiga de manguera de 1/8 pulgada
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)CytivaSH30256.01Estéril, pH 7,0 - 7,2, sin calcio, magnesio
Propidium yoduro, ≥ 94,0% (HPLC)Sigma AldrichP4170
Cuchillas de afeitarAmerican Line66-0362
Plataforma de mecedorVWRModelo 200
Azida de sodio, ≥ 99.5%Sigma AldrichS2002
SuturaEthiconJ109T
Jeringuilla (1 mL)BD309628
TritonX-100SigmaT9284
Preadolescente-20Termo CientíficaJ20605-AP
Viales, tapa de rosca con tapa sólida y revestimiento de aluminio, preensambladosSigma Aldrich27470-Uvolumen 7 mL, vial de vidrio ámbar, O.D. y tiempos; H 17 mm y tiempos; 60 mm, rosca para 15-425

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Henderson, N. C., Rieder, F., Wynn, T. A. Fibrosis: from mechanisms to medicines. Nature. 587 (7835), 555-566 (2020).
  2. Wang, S., Friedman, S. L. Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).
  3. Amini-Salehi, E., et al. Global prevalence of nonalcoholic fatty liver disease: An updated review meta-analysis comprising a population of 78 million from 38 countries. Arch Med Res. 55 (6), 103043(2024).
  4. Ekstedt, M., et al. Fibrosis stage is the strongest predictor for disease-specific mortality in NAFLD after up to 33 years of follow-up. Hepatology. 61 (5), 1547-1554 (2015).
  5. Hagström, H., et al. Fibrosis stage but not NASH predicts mortality and time to development of severe liver disease in biopsy-proven NAFLD. J Hepatol. 67 (6), 1265-1273 (2017).
  6. Geng, Y., Schwabe, R. F. Hepatic stellate cell heterogeneity: Functional aspects and therapeutic implications. Hepatology. , (2025).
  7. Trinh, V. Q. -H., et al. Hepatic stellate cells maintain liver homeostasis through paracrine neurotrophin-3 signaling that induces hepatocyte proliferation. Sci Signal. 16 (787), eadf6696(2023).
  8. Sugimoto, A., et al. Hepatic stellate cells control liver zonation, size and functions via R-spondin 3. Nature. 640 (8059), 752-761 (2025).
  9. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  10. Gäbele, E., Brenner, D. A., Rippe, R. A. Liver fibrosis: Signals leading to the amplification of the fibrogenic hepatic stellate cell. Front Biosci. 8 (4), 69-77 (2003).
  11. Marra, F. Hepatic stellate cells and the regulation of liver inflammation. J Hepatol. 31 (6), 1106-1119 (1999).
  12. Milani, S., et al. Procollagen expression by nonparenchymal rat liver cells in experimental biliary fibrosis. Gastroenterology. 98 (1), 175-184 (1990).
  13. Sato, M., Suzuki, S., Senoo, H. Hepatic stellate cells: Unique characteristics in cell biology and phenotype. Cell Struct Funct. 28 (2), 105-112 (2003).
  14. Du, K., Jun, J. H., Dutta, R. K., Plasticity Diehl, A. M. heterogeneity, and multifunctionality of hepatic stellate cells in liver pathophysiology. Hepatol Commun. 8 (5), e0411(2024).
  15. Trivedi, P., Wang, S., Friedman, S. L. The power of plasticity-Metabolic regulation of hepatic stellate cells. Cell Metab. 33 (2), 242-257 (2021).
  16. Niki, T., et al. Comparison of glial fibrillary acidic protein and desmin staining in normal and CCl4-induced fibrotic rat livers. Hepatology. 23 (6), 1538-1545 (1996).
  17. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  18. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
  19. Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (1), 43-55 (2014).
  20. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  21. Mederacke, I., et al. Fate tracing reveals hepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independent of its aetiology. Nat Commun. 4, 2823(2013).
  22. Slater, T. F., Cheeseman, K. H., Ingold, K. U. Carbon tetrachloride toxicity as a model for studying free-radical mediated liver injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 311 (1152), 633-645 (1985).
  23. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387(2021).
  24. Shrirao, A. B., et al. Autofluorescence of blood and its application in biomedical and clinical research. Biotechnol Bioeng. 118 (12), 4550-4576 (2021).
  25. Croce, A. C., Bottiroli, G. Lipids: Evergreen autofluorescent biomarkers for the liver functional profiling. Eur J Histochem. 61 (2), 2808(2017).
  26. Jafree, D. J., Long, D. A., Scambler, P. J., Moulding, D. Tissue clearing and deep imaging of the kidney using confocal and two-photon microscopy. Methods Mol Biol. , 103-126 (2020).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

C lulas estrelladas hep ticasaclaramiento tisularmicroscop a confocalreconstrucci n tridimensionalim genes de tejido hep ticomiofibroblastos fibrog nicosmarcado fluorescentemodelos de h gado de rat n

Artículos relacionados