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Artículo de método

In Vivo Imagen de calcio con microscopio miniaturizado en el hipotálamo para comprender los comportamientos sociales en ratones

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DOI:

10.3791/70401

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20 de marzo de 2026

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1School of Life Sciences, Westlake University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

En este artículo

Resumen

Este protocolo detalla la imagen in vivo de calcio de neuronas hipotalámicas utilizando un microscopio miniaturizado (miniscopio) en ratones que se comportan libremente durante la manipulación del estado social (aislamiento social y reencuentro social). Este método permite la obtención de imágenes a resolución neuronal única de la actividad hipotálmica que representa la necesidad social y la saciedad social, facilitando estudios mecanicistas de la homeostasis social.

Resumen

El comportamiento social en los vertebrados está estrictamente regulado a través de circuitos hipotalámicos. Recientemente se ha identificado que tipos de neuronas hipotalámicas definidos molecularmente codifican la necesidad social de manera homeostática. Aquí describimos un protocolo paso a paso para realizar imágenes de calcio in vivo en el núcleo preóptico medial hipotalámico (MPN) utilizando un microscopio miniaturizado montado en la cabeza (miniscopio) en ratones que se comportan libremente. Este método permite registros longitudinales de la dinámica de poblaciones neuronales durante el aislamiento y la reunión social, facilitando así estudios mecanicistas de la necesidad y la saciedad social a resolución neuronal única. Específicamente, los ratones adultos reciben inyecciones estereotaxicas de un virus adeno-asociado (AAV) que expresa un indicador de calcio codificado genéticamente en el MPN, seguidas de la implantación de una lente de índice de gradiente (GRIN) y una placa base de miniscopio. Tras la recuperación, los ratones se acostumbran al sistema de imagen por miniscopio y se les somete a un aislamiento social programado y a la reunión, durante los cuales se toman imágenes de las actividades neuronales. Las señales de calcio se sincronizan con el comportamiento animal para su análisis posterior. Este protocolo ofrece una guía completa para la imagen in vivo de calcio con miniscopio en el hipotálamo del ratón durante conductas sociales. Puede adaptarse fácilmente para obtener imágenes en otras regiones profundas del cerebro y en diferentes contextos conductuales. Este enfoque conecta la actividad neuronal a nivel celular y el comportamiento social, avanzando en nuestra comprensión de la base neural del comportamiento complejo en animales en movimiento libre.

Introducción

La capacidad de mantener lazos sociales es fundamental para la supervivencia animal 1,2,3. El aislamiento social prolongado induce ansiedad, déficits cognitivos y cambios metabólicos, mientras que la reunión restaura el compromiso social y las necesidadessociales 4,5,6. El rebote observado en el comportamiento social tras un aislamiento social a corto plazo sugiere la presencia de un mecanismohomeostático 7, análogo a la regulación del hambre 8,9 o de la sed 10,11,12. Sin embargo, los sustratos neuronales que median la homeostasis social siguen siendo poco comprendidos.

Trabajos recientes han revelado que poblaciones neuronales hipotalámicas distintas codifican la necesidad social y la saciedad social,respectivamente 7. La imagen calciosa in vivo ha demostrado que una población de neuronas glutamatérgicas genéticamente definidas en el núcleo preóptico medial (MPN) se activa durante el aislamiento (neuronasde aislamiento MPN), mientras que otra población de neuronas GABAérgicas se activa tras la reunión (neuronas dereunión MPN). La activación optogenética de las neuronasde aislamiento MPN imita un estado de aislamiento social, y la activación optogenética de las neuronasde reunión MPN atenúa el rebote social, sugiriendo sus roles opuestos en la regulación de la necesidad social. Estas poblaciones interactúan recíprocamente y se conectan con circuitos neuronales cerebrales, formando un bucle de retroalimentación que modula dinámicamente la necesidad social.

Aquí presentamos un protocolo detallado con el objetivo general de permitir a los investigadores registrar la dinámica del calcio en el cerebro profundo a resolución neuronal única en ratones que se desplazan libremente durante comportamientos sociales etológicamente relevantes, como el aislamiento social y la reunión13. La combinación de esta técnica de imagen con paradigmas sociales etológicas relevantes ofrece una oportunidad sin precedentes para investigar la representación neural de estados sociales distintos. La razón para desarrollar este método adaptado proviene de la necesidad de visualizar cómo la necesidad social y la saciedad se representan dinámicamente en estructuras cerebrales profundas como la MPN. Aunque el uso del microscopio ya se ha descrito14, 15 y 16, su uso durante interacciones sociales sin restricciones, especialmente aquellas que implican transiciones entre aislamiento y reencuentro, requiere adaptaciones técnicas y conductuales específicas para mantener la estabilidad óptica, minimizar artefactos de movimiento y asegurar una expresión conductual naturalista.

En comparación con la fotometría de fibra, el enfoque basado en miniscopio ofrece resolución celular, permitiendo la discriminación de distintos tipos de neuronas funcionales dentro de la misma región. Permite grabaciones a largo plazo de animales que interactúan libremente, lo cual es esencial para estudiar la dinámica neuronal impulsada socialmente. Estudios previos con microendoscopía de un solo fotón se han centrado principalmente en la corteza o hipocampo dorsal durante tareas espacialeso sensoriales 14,15,16. Nuestro protocolo extiende estos avances a regiones subcorticales más profundas durante conductas sociales complejas, proporcionando una plantilla para investigar circuitos de estados afectivos bajo condiciones naturalistas.

El protocolo está optimizado para regiones cerebrales de hasta ~5 mm de profundidad, utilizando implantación de lente GRIN e indicadores de calcio codificados genéticamente. Las consideraciones clave incluyen la precisión quirúrgica, la colocación de lentes, el diseño de paradigmas conductuales y el análisis de datos relacionados. Este método puede adaptarse a otras áreas profundas del cerebro y contextos conductuales. Este protocolo guía a los usuarios en todas las etapas críticas: preparación quirúrgica, administración viral, implantación de lente, diseño conductual, fijación de miniscopio, imagen y análisis de datos (Figura 1A-E). Prevemos que este flujo de trabajo accesible y detallado permitirá el estudio de poblaciones neuronales profundas del cerebro a lo largo de una amplia gama de comportamientos naturalistas.

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Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad Westlake con el protocolo animal #25-076-LD-9. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de los Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad Westlake. Todo el equipo y materiales utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cirugía de inyección de virus

  1. Coloca al ratón en una cámara de inducción anestesica con isoflurano al 2-3%.
    NOTA: Una inducción exitosa de anestesia se confirma por la ausencia de reflejo de pellizco en el dedo del pie y la presencia de una respiración profunda y constante.
  2. Tras 2-3 minutos, o una vez que se pierda el reflejo de enderezamiento, transfiere rápidamente al animal al instrumento estereotaxico. Asegurar la nariz en el cono nasal de anestesia y mantener la anestesia con isoflurano al 1-1,5% durante toda la cirugía (Figura 1B). El caudal de oxígeno suele estar entre 0,8 y 1,2 L/min.
    NOTA: Monitoriza la frecuencia respiratoria del animal y otros signos fisiológicos. Si la frecuencia respiratoria del animal aumenta y muestra bigotes y otros signos de despertar, aumenta la concentración de isoflurano al 2-3%.
  3. Asegura los dientes incisivos del ratón a través de la barra incisiva del instrumento estereotáxico. Aprieta la pinza del morro para fijar la cabeza.
  4. Inserta cuidadosamente dos barras auriculares en los conductos auditivos externos hasta que descansen bien, asegurando una fijación estable y rígida de la cabeza (Figura 1B).
    NOTA: (1) Una colocación incorrecta que comprime los tejidos del cuello podría causar dificultad respiratoria o fijación inestable. (2) Si el animal muestra signos de dificultad respiratoria o dificultad durante la fijación, liberar y reposicionar inmediatamente las barras de los oídos, ya que esto indica una posible compresión de las vías respiratorias. (3) Asegurarse de que ambas barras para los oídos estén a la misma altura. Esto es esencial para un nivelado preciso posterior del cráneo.
  5. Aplica pomada oftálmica en ambos ojos del ratón para evitar que se sequen.
  6. Elimina el pelo de la cabeza usando crema depilatoria. Limpia bien la zona con toallitas de etanol al 75% para eliminar los restos de crema y pelo.
  7. Desinfecta la piel expuesta con toallitas de etanol al 75% y betadina. Utilizar tijeras quirúrgicas finas para realizar una incisión sagital en la línea media a través del cuero cabelludo. Retrae la piel para exponer completamente el cráneo sobre la región cerebral objetivo. Limpia suavemente la superficie del cráneo con un hisopo de algodón para eliminar el periostio.
    NOTA: Exponer una zona suficientemente grande del cráneo es necesario para proporcionar un anclaje robusto al cemento dental, asegurando la estabilidad a largo plazo del implante.
  8. Monta una pipeta de cristal en el soporte estereotáxico para medir la superficie del cráneo. Bajo un estereomicroscopio, localiza la punta de la pipeta en el bregma (la intersección de las suturas sagital y coronal) y fijala como origen (X = 0, Y = 0, Z = 0, Figura 1C).
  9. Mueve la punta de la pipeta a posiciones ±2 mm laterales respecto al bregma y ajusta el nivel del cráneo hasta que la diferencia de altura entre estos dos puntos sea de ±0,03 mm.
  10. Después, mueve la pipeta hacia la lambda (la intersección de las suturas sagital y lambdoida) y ajusta la inclinación anteroposterior hasta que la diferencia de altura entre bregma y lambda esté dentro de ±0,03 mm (Figura 1C).
    NOTA: (1) Una evaluación visual previa y un ajuste del cráneo podrían agilizar significativamente el proceso de nivelación fina. (2) Secar la superficie del cráneo con aire comprimido antes de nivelarlo mejora la visibilidad de las suturas craneales.
  11. Utiliza un taladro de mano con cabeza de 0,8 mm para hacer una craneotomía sobre la región cerebral objetivo (por ejemplo, en ratones C57BL6/J). Las coordenadas son en anteroposterior-posterior (AP) 0 mm, medial-lateral (ML) 0,3 mm y dorso-ventral (DV) -4,8 mm para dirigirse a la región MPN; para ratones FVB/NJ, la craneotomía se realiza en AP +0,4 mm-+0,5 mm, ML 0,3 mm y DV -4,8 mm) (Figura 1C).
    NOTA: En caso de sangrado, aumentar temporalmente la concentración de isoflurano al 2-2,5%. Utiliza una punta de algodón estéril o una esponja hemostática para absorber la sangre, y luego aplica inmediatamente solución fisiológica estéril. Devuelve el isoflurano al nivel de mantenimiento (1-1,5%) tras la hemostasia y elimina el exceso de líquido.
  12. Tras la craneotomía, realizar una inyección estereotáxica del virus que expresa el indicador de calcio en la región cerebral objetivo.
  13. Diluir el AAV-hSyn-jGCaMP7f, un virus adenoasociado que se utiliza para expresar un indicador de calcio codificado genéticamente en las neuronas y para permitir la imagen de la actividad neuronal mediante señales de calcio, hasta un título final de aproximadamente 5 × 10¹² genomas virales por mililitro antes de la inyección.
  14. Llena primero una pipeta de cristal con aceite mineral y luego con la solución viral, asegurando la ausencia de burbujas de aire. Coloca la pipeta en las coordenadas del objetivo en la superficie del cráneo y baja lentamente hasta la profundidad del objetivo.
  15. Inyectar el virus unilateralmente a una velocidad lenta y constante (por ejemplo, 30 nL/min), con un volumen total de 400 nL7, para asegurar la infección de suficientes neuronas en la región MPN. Esta cantidad puede ajustarse según el tamaño específico de las regiones cerebrales y si existen restricciones adicionales, como el sistema Cre-loxP.
  16. Al finalizar, deja la pipeta en su lugar durante 10-15 minutos para facilitar una difusión viral adecuada y minimizar el reflujo a lo largo de la vía de inyección, antes de retirarla lentamente.
    NOTA: (1) Las alicuotas virales con títulos apropiados y consistentes son fundamentales para una expresión exitosa y constante en animales. Un título excesivamente alto puede causar neurotoxicidad, mientras que un título insuficiente conduce a una expresión débil y una mala relación señal-ruido para la imagen. (2) La lentitud de la inyección y el tiempo de espera suficiente antes de retirar la pipeta son fundamentales para minimizar el daño tisular y prevenir el reflujo viral, asegurando una expresión viral precisa y robusta en la zona objetivo.
  17. Tras la inyección del virus, cose la piel por encima del cráneo con suturas absorbibles.
  18. Inyectar carprofeno (5 mg/kg) de forma subcutánea inmediatamente después de la cirugía para analgesia, con monitorización continua y administración adicional según sea necesario durante los siguientes 3 días.
  19. Aloja al ratón individualmente tras la cirugía de inyección viral durante al menos 2-3 semanas para permitir una recuperación adecuada del animal y expresión viral.
    NOTA: La implantación de lente GRIN (Sección 2) puede realizarse el mismo día de la inyección viral o 2-3 semanas después de la inyección viral. En este protocolo, describimos el método de dos pasos, que permite al experimentador evaluar la expresión viral durante la implantación del cristalino GRIN.

2. Implantación de lentes GRIN

  1. Repite los pasos 1.1-1.10 para reabrir la craneotomía. Rasca la superficie del cráneo con un bisturí para que el cemento dental se agarre mejor en el paso 2.8. Para la nueva craneotomía, el diámetro debe ser ligeramente mayor que el de la lente GRIN (normalmente ~1 mm) para permitir una implantación suave. Limpia meticulosamente todos los restos óseos tras perforar.
  2. Para mitigar la compresión tisular durante la implantación del cristalino GRIN, introduce una pipeta de cristal en la región cerebral objetivo y mueve lentamente la pipeta mediolateralmente para crear una incisión. Este microcorte mide ~1 mm de largo para crear espacio para implantar la lente GRIN (Figura 2A).
    NOTA: Este paso es fundamental para el éxito de todo el protocolo.
  3. Antes de implantar la lente GRIN, desinfecta la lente con etanol al 75%, luego lávala con suero fisiológico estéril y límpiala suavemente con tejido de lente.
  4. Sujeta el objetivo GRIN con un soporte y coloca el miniscopio en la parte superior del objetivo.
  5. Posiciona todo el conjunto en el bregma y pon todas las coordenadas en cero (es decir, X = 0, Y = 0, Z = 0). Luego, colócalo en las coordenadas objetivo X-Y por encima de la craneotomía.
  6. Humedecer la superficie del cráneo con solución salina estéril. Baja muy lentamente el cristalino GRIN hacia el tejido cerebral a una frecuencia de aproximadamente 100 μm/min hasta que alcance el objetivo (Figura 2B).
    NOTA: (1) Si la implantación del cristalino GRIN se realiza 2-3 semanas después de la inyección viral, durante la inserción del cristalino, enciende el miniscopio para observar cambios de fluorescencia en tiempo real. A medida que la lente se acerca a la región objetivo, la señal fluorescente global en el campo de visión se vuelve más brillante, y este cambio puede leerse directamente del histograma de la señal en tiempo real usando el software de imagen (Figura 2C, D). (2) Ten cuidado de evitar el sangrado durante la implantación, ya que los coágulos de sangre degradan significativamente la calidad de la señal. (3) Si el sangrado es inevitable y severo, retira el cristalino GRIN, limpia el cristalino y vuelve a implantarlo una vez que termine el sangrado.
  7. Tras la implantación del cristalino, seca bien la superficie del cráneo absorbiendo el líquido residual y soplando con aire comprimido.
  8. Aplica cuidadosamente cemento dental para anclar la base de la lente GRIN al cráneo y construye una gorra completa que cubra el cráneo expuesto (Figura 2B). Ten cuidado de evitar que el cemento toque los tejidos musculares circundantes. Luego afloja cuidadosamente el portalentes y quítalo junto con el microscopio.
    NOTA: (1) Mezclar cemento dental en una losa fría sobre hielo para ralentizar el proceso de solidificación y proporcionar más tiempo de trabajo. (2) Se recomienda añadir una barra de cabeza detrás del objetivo para sujetar el ratón durante la conexión del microscopio. (3) Ten mucho cuidado de no aplicar el cemento al soporte de la lente o al microscopio.
  9. Prepara el adhesivo de silicona de dos partes mezclando sus dos líquidos. Aplícalo en la parte superior de la lente GRIN para formar un sellado protector contra el polvo y los arañazos durante el periodo de recuperación.
  10. Tras la implantación del cristal GRIN, aloja al ratón individualmente para evitar posibles daños en el cristalino por parte de sus compañeros de jaula durante la recuperación.

3. Instalación de la base

  1. Dos o tres semanas después de la implantación de la lente GRIN, se realiza la instalación de la placa base. Anestesiar y colocar al ratón en el instrumento estereotáxico como se ha descrito antes.
  2. Quita el sello de silicona de la parte superior de la lente GRIN y limpia suavemente la superficie de la lente con un trozo de papel higiénico.
  3. Coloca la base al microscopio. Monta todo el conjunto microscopio-placa base en el brazo manipulador estereotáxico mediante un soporte.
  4. Conecta el miniscopio a la caja de adquisición de datos y enciende la imagen en directo.
  5. Alinea el objetivo del miniscopio y el objetivo GRIN implantado ajustando finamente el manipulador para lograr una alineación óptica coaxial precisa entre el miniscopio y la lente GRIN.
  6. Coloca el objetivo del miniscopio paralelo a la superficie superior de la lente GRIN y asegúrate de que el borde de toda la lente GRIN esté incluido en la ventana de imagen con un aspecto circular perfecto, y que el centro de la lente esté en el centro de la ventana de imagen.
  7. Reduce el miniscopio a una distancia óptima de trabajo para obtener imágenes claras de las neuronas en el plano focal objetivo.
  8. Utiliza cemento dental para unir y encapsular la placa base sobre la capa de cemento existente (Figura 2B).
    NOTA: (1) Un paso crítico es elevar el miniscopio en una pequeña distancia empíricamente determinada (aproximadamente 50-100 μm) antes de la fijación final para compensar el posible desplazamiento del plano focal causado por la contracción del cemento durante la solidificación. (2) Ten mucha precaución para evitar que el cemento dental toque cualquier parte del miniscopio que vaya a desprenderse tras la instalación de la placa base.
  9. Una vez que el cemento dental esté completamente solidificado, afloja el portadientes, desconecta cuidadosamente el microscopio de la placa base y enrosca inmediatamente una tapa a la placa base para proteger la interfaz óptica.
  10. Aloja individualmente al ratón durante 3-5 días tras la instalación de la placa base y luego reúne al ratón con sus compañeros de jaula durante al menos 1 semana antes de manipular el estado social (por ejemplo, aislamiento social).

4. Configuración de parámetros de habituación e imagen

  1. Habituar a los ratones implantados a un reposacabezas temporal para la fijación del miniscopio y al sistema de imagen durante 2-3 veces antes de las sesiones formales de imagen.
  2. Para montar el miniscopio en la placa base, sujetar la cabeza de los ratones implantados, retirar la tapa de la placa base y acoplar el miniscopio a la placa base mediante una interfaz magnética. Luego, aprieta el tornillo lateral para asegurar el microscopio. Realiza imágenes de calcio durante 10 minutos, durante los cuales el animal se mueve libremente en la arena de grabación o en la jaula.
  3. Introduce estímulos, como un toque suave y un ratón nuevo, durante esta sesión piloto de imagen. Analizar los datos (véanse los detalles en la Sección 6) para comprobar si se pueden extraer señales de una sola neurona. Durante la habituación, determina los ajustes óptimos de imagen ajustando el plano focal del miniscopio a lo largo de su distancia de trabajo para maximizar el número de neuronas observadas y la nitidez de la imagen.
  4. Ajusta la potencia de iluminación a ~10% del valor máximo y la ganancia del sensor a ~10-20% del valor máximo para obtener señales claras sin saturación. Imagen a la resolución espacial de 1280 x 800 con una frecuencia de muestreo de 20 Hz. Guarda estos ajustes para cada animal y reutiliza los ajustes durante las siguientes sesiones de imagen.

5. Ensayos sociales conductuales para imágenes de calcio en miniscopio

  1. Ensayo de reencuentro social (Figura 3A)
    1. Aislar el ratón implantado en el miniscopio durante 1, 3 o 5 días antes de la imagen. Realizar imágenes de calcio durante la línea basal, la reunión y el nuevo aislamiento.
    2. Línea base: Conecta el ratón al microscopio y graba durante 10 minutos, durante los cuales el ratón permanece aislado.
    3. Reencuentro: Añadir a un antiguo compañero de la sala de grabación y grabar durante 10 minutos.
    4. Reaislamiento: Retira al compañero de cage tras la reunión de 10 minutos y haz la imagen durante otros 10 minutos durante el aislamiento de nuevo.
  2. Ensayo de aislamiento social (Figura 3B)
    1. Aísla al ratón implantado en el miniscopio durante 6 horas y registra señales de calcio al inicio de cada hora durante 15 minutos.
    2. Añadir un antiguo compañero de cagema a la cámara de registro y grabar durante 10 minutos al final de toda la sesión de imagen para identificar neuronas que estén significativamente moduladas por la reunión social (véanse detalles en las secciones 6 y 7).
      NOTA: (1) Este programa específico de imágenes se emplea para minimizar el fotoblanqueo de señales y permitir el monitoreo de la actividad neuronal durante las primeras 6 horas de aislamiento social. (2) El miniscopio está conectado durante todo el procedimiento. (3) Este enfoque permite el seguimiento del mismo conjunto neuronal durante toda la sesión de imagen. (4) Durante la imagen se proporcionan alimentos e hidrogel.

6. Preprocesamiento de datos

  1. Importa vídeos de imagen en bruto al software de procesamiento de datos.
  2. Reducir el muestreo espacial y temporal del vídeo original cuando sea necesario para reducir la carga computacional de análisis de los datos.
    NOTA: Para este análisis, los datos de imagen en bruto se capturan a una resolución espacial de 1280 x 800 a 20 Hz; Reducir el muestreo espacial del vídeo por un factor de 4 y reducirlo temporalmente por un factor de 2.
  3. Aplicar un filtro pasa banda espacial con la resta media global para reducir el ruido de alta frecuencia y la deriva de fondo en bajas frecuencias.
  4. Corrige artefactos de movimiento usando el algoritmo de corrección de movimiento en el software de procesamiento de datos. Inspecciona visualmente la película corregida por movimiento para asegurar la estabilidad neuronal de la somata y el mínimo de artefactos residuales de movimiento.
  5. Haz clic en el botón "Identificar células" y elige "CNMFe" en la lista para extraer trazas de actividad calcicística de neuronas individuales con el algoritmo CNMF-E17 (Factorización de Matriz No Negativa Restringida para datos microendoscópicos).
  6. Haz clic en el botón de regla en el software de procesamiento de datos y mide los diámetros de los soma (en píxeles) de neuronas representativas. Introduce el tamaño medio en la caja "Diámetro medio de celda (píxeles)". Luego haz clic en el botón Aplicar para ejecutar CNMF-E.
  7. Ajusta la configuración de inicialización de CNMF-E cuando la detección de celdas es insuficiente, aparecen excesos componentes no celulares o ocurre una sobresegmentación.
  8. Inspecciona todos los componentes extraídos y acéptalos/rechaza basándote en la morfología celular y la dinámica biológicamente plausible del calcio. Excluye los componentes con formas irregulares y puntiagudas. Excluye las trazas dominadas por ruido o artefactos de movimiento.
    NOTA: (1) Las figuras 2E y 2F muestran dos neuronas aceptadas con morfología neuronal clara, así como los típicos transitorios de calcio. (2) Las figuras 2G y 2H muestran dos neuronas rechazadas con fluctuaciones basales pronunciadas y carentes de transitorios típicos de calcio.
  9. Exportar trazas de fluorescencia de neuronas aceptadas desde el software de procesamiento de datos para la identificación posterior de neuronas moduladas por el estado social (Sección 7).

7. Identificar neuronas moduladas por estados sociales

  1. Utiliza MATLAB o Python para analizar más a fondo los datos preprocesados.
  2. Alinea las trazas de actividad calcictica de las neuronas aceptadas con marcas temporales de comportamiento.
  3. Encuentra el momento de la reunión social en el vídeo de comportamiento. Para cada neurona, la actividad segmentada se integra en un periodo de aislamiento social previo a la reunión de 300 s y un periodo de reunión social de 300 s.
  4. Para cada neurona, cuantifica la distribución de la actividad del calcio durante los periodos de aislamiento y reunión.
  5. Realizar el análisis de la Característica Operativa del Receptor (ROC)18 para evaluar la capacidad de la actividad neuronal para discriminar entre estados de aislamiento y de reunión, lo que produce un valor de AUC que calcula el área bajo la curva ROC.
  6. Evalúa la significación estadística mediante una prueba de permutación. Para cada neurona, los valores de actividad calcica se distribuyen circularmente entre estados conductuales en bins temporales de 1 s durante 1.000 veces para generar una distribución nula de valores AUC. Las neuronas cuyos valores observados de AUC superan el percentil 95 de su distribución nula barajada se consideran significativamente moduladas por el estado social.
  7. Clasifica las neuronas significativamente moduladas según la dirección de la modulación. Clasificar las neuronas inhibidas por la reunión como las Neuronas de Aislamiento y activadas por la reunión como las Neuronas de la Reunión (Figura 4).

8. Verificación posterior al experimento

  1. Perfundir los ratones y realizar una histología estándar para verificar la trayectoria del cristalino GRIN y la expresión viral (véase un ejemplo de imágenes histológicas en la Figura 2I).
  2. Usa el 4% de PFA para fijar toda la cabeza del ratón junto con el implante, luego quita la lente GRIN para visualizar una trayectoria clara de la lente.
    NOTA: Incluye solo los datos de los animales con la selección correcta.

9. Resolución de problemas y consejos prácticos

  1. Fija una barra de cabeza con cemento dental detrás del microscopio para facilitar su montaje y retirada.
    NOTA: La barra de cabeza no debe ser demasiado larga y podría colocarse en un ángulo ligeramente inclinado para evitar interferencias con el comportamiento social.
  2. Aloja individualmente a los ratones implantados durante el periodo de recuperación posterior a la cirugía durante al menos una semana. Esto proporciona tiempo suficiente para que los ratones se recuperen y evita el daño del implante por otros ratones.
  3. Reunir a los ratones implantados con sus compañeros de cage anteriores una vez que estén completamente recuperados. Revisa y aprieta regularmente las tapas de la tapa. Prepara algunas tapas extra y colócalas cuando se pierdan durante el mantenimiento del animal.
  4. Revisa las señales de calcio 3-4 semanas después de inyectarse el virus GCaMP. Si las señales son demasiado débiles o poco claras, un periodo de recuperación más largo a veces mejora la calidad de las señales.
  5. Ten cuidado con las superficies de los objetivos tanto en el lado del objetivo GRIN como en el lado del microscopio. Mantén las lentes limpias y libres de arañazos. Cubre el objetivo cuando no lo uses.
  6. Antes de hacer la imagen, ajusta la longitud del cable de señal para que sea lo suficientemente larga para que el animal llegue a las esquinas de la arena de imagen y lo suficientemente corta para permitir interacciones sociales fluidas.
  7. Protege el cable con una capa de material resistente cuando sea necesario para evitar que otros ratones muerdan durante las interacciones sociales. Revisa el cable de señal regularmente para vigilar si está torcido por una interacción social intensa.
  8. Para identificar el mismo conjunto neuronal a partir de sesiones de imagen consecutivas (por ejemplo, en la Figura 3B), los vídeos de imagen en bruto podrían concatenarse para extraer trazas de calcio.
  9. Para sincronizar múltiples señales, por ejemplo, los vídeos de comportamiento y las señales de calcio, normalmente se utilizan entradas TTL comunes y linternas sincronizadas para alinear diferentes archivos de grabación.

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Resultados

Identificación de poblaciones neuronales
Expresamos el virus GCaMP e implantamos una lente GRIN en el MPN de un ratón C57BL/6J. Tras la cirugía, el ratón se recuperó individualmente y se reunió con sus compañeros de jaula durante al menos una semana. Luego, el ratón fue alojado solo durante 3 días antes de la sesión de imagen de calcio. Durante la imagen, primero se registró un punto base de aislamiento de 10 minutos, seguido de una reunión social de 10 minutos con un...

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Discusión

Este protocolo detalla un enfoque integrado que combina imágenes de calcio in vivo en un microscopio con paradigmas sociales de comportamiento para evaluar el perfil de actividad de las neuronas hipotalámicas. Permite la imagen de calcio a largo plazo y de resolución celular procedente de estructuras cerebrales profundas durante interacciones sociales naturales. Las siguientes secciones analizan los pasos críticos, la importancia metodológica, las limitaciones y el potencial fut...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no hay intereses financieros en competencia ni conflictos de intereses. ChatGPT se utilizó en el proceso de edición de manuscritos, con una revisión cuidadosa y detallada por parte de todos los autores.

Agradecimientos

Queremos agradecer a la profesora Catherine Dulac su apoyo en la formación inicial de experimentos con miniscopios y a Yang Sun por su ayuda en la realización de la cirugía. Este trabajo fue apoyado por la financiación inicial de la Universidad Westlake y la financiación de la Fundación NOMIS, el Tan-Yang Center for Autism Research de la Universidad de Harvard, la Beca Jane Coffin Childs de Investigación Médica para D.L. y la beca postdoctoral Charles A. King Trust para D.L. Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio Liu sus comentarios sobre el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AAV2/9-hSyn-jGCaMP7f-WPRE-pATaitoolS0587-9Vectores virales, cirugía
Esponja hemostática gelatinosa absirbableFUKANGSENFKS-ACirugía
Solución de betadina (10% yodada Povidona) 500mLHYNAUTQ13702855HNW002Cirugía
Cámara para vídeo conductualDAHENGMER2-160-227-U3CComportamiento
CarprofenoMCEHY-B1227Cirugía
Instrumentos estereotaxicos digitalesRWD68803Cirugía
Etanol (75%)Reactivo químico Sinopharm Co., Ld801769610Cirugía
Ungüento para ojosFODUH37022025Cirugía
Software de Procesamiento de Datos Inscopix (IDPS)Inscopix1000-006551Análisis de datos
IsofluranoRWDR510-22-10Cirugía
Pack adhesivo Kwik-Sil de 2Instrumentos de Precisión MundialKWIK-SILCirugía
MicrodrillRWD78001Cirugía
Extractor de micropipetas MP-1000RWDMP-1000Cirugía
Soluciones de anestesia animal multifunciónRWDTAIJI-IECirugía
Bomba de microinyección de nanolitrosRWDR-480Cirugía
Miniscopio nVista 3.0Inscopix1000-004323Imagen
Pinza oftálmicaRWDF12006-10Cirugía
Tijeras de OperaciónRWDS14001-15Cirugía
Kit de implantes ProViewInscopix1000-004238Cirugía e Imagen
Cemento de resina (Superbond)Sun MedicalSuper bono C y BCirugía
Juego de 5 cubiertas de placa baseInscopix1050-004639Imagen
Conjunto de 5 placas baseInscopix1050-004638Imagen
Juego de 5 objetivos GRIN, 0,6 mm de diámetro, 7,3 mm de longitudInscopix1050-004626Cirugía e Imagen
Microscopio EstereotaxiMurziderMSD205ACirugía
Suero fisiológico estérilQIDUKELINR1B25071902Cirugía

Referencias

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