Artículo de método

Disección cerebral e intestinal en poblaciones de peces de superficie y peces cavernícolas de Astyanax mexicanus

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DOI:

10.3791/70412

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24 de febrero de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, UPR- Medical Sciences Campus, 2Molecular Sciences Research Center

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para diseccionar y extraer componentes completos del cerebro e intestino de morfotipos adaptados a la superficie y a la cueva de Astyanax mexicanus. Este protocolo puede adaptarse para aplicaciones posteriores, incluyendo transcriptómica, metabolómica y análisis de microbiota intestinal.

Resumen

Los peces teleósteos se utilizan para responder a una amplia gama de preguntas de investigación que abarcan desde el desarrollo hasta la genética y la neurociencia, y más recientemente, para comprender las complejidades del eje intestino-cerebro, e incluso, en un contexto más amplio, del eje intestino-cerebro-hígado. El tetra mexicano, Astyanax mexicanus, se ha utilizado cada vez más en marcos evolutivos comparativos y de desarrollo debido a la disponibilidad de morfotipos morfológica y fisiológicamente distintos, incluyendo peces de superficie que viven en los ríos y peces cavernicas ciegos adaptados a cuevas. La adaptación a hábitats de cueva está asociada con cambios en los rasgos morfológicos, los rasgos conductuales y la diversidad de la microbiota intestinal que también se encuentran en condiciones de laboratorio. Esto ha abierto la posibilidad de plantear preguntas sobre las interacciones entre el microbioma, la actividad metabólica, la adaptación neuronal y los complejos resultados conductuales. Estas interacciones pueden abordarse ahora mediante estudios de mapeo cerebral completo con cerebros despejados y secuenciación de microbiota intestinal para detectar diversidad bacteriana asociada a fenotipos adaptados a superficies y cuevas. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se beneficiarían de órganos y tejidos completos intactos, cuidadosamente diseccionados y preservados, lo que permite el posprocesamiento en aplicaciones posteriores. Este protocolo describe un método paso a paso para la disección cerebral e intestinal, en el que se extraen y aíslan todo el cerebro y órganos abdominales para morfotipos tanto de peces superficiales como de peces de las cavernas.

Introducción

Los modelos animales, incluidos los peces vertebrados, son herramientas fundamentales para modelar fenómenos biológicos y patologías complejas en sistemas relativamente más simples y accesibles. Por ejemplo, el pez cebra, Danio rerio, es uno de los modelos de peces teleósteos más utilizados, con una gran variedad de métodos aplicados para estudiar su desarrollo, genética, fisiología y comportamiento, con un impacto significativo en las ciencias biomédicas y neuroconductuales.. Una gran ventaja de usar pez cebra en la actualidad es la disponibilidad de varios métodos para estudiar la histologia y patología de órganos y tejidos en líneas mutantes con pérdida de función, para los cuales existen protocolos de disección pasoa paso 3,9,10.

Sin embargo, en las últimas décadas han ido en aumento varios otros modelos de peces teleósteos que son adecuados para plantear otros tipos de preguntas, incluyendo los campos de la biologíaevolutiva 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, mecanismos biológicos subyacentes al envejecimiento 2,22, toxicología23,24 y otros25,26. Un ejemplo de esto es el caso del tetra mexicano, Astyanax mexicanus, un pez teleósteo originario del noreste de México, con poblaciones ancestrales de peces de superficie que viven en los ríos y más de 30 poblaciones de peces caverna-cavernas ciegos que habitan en cuevas (Figura 1)12.

Los peces caverna han adoptado un conjunto de características morfológicas, incluyendo pérdida ocular12,27, pérdida depigmentación 28, expansión de sistemassensoriales 17,29,30 y aumento del almacenamiento de grasa 12,31, que les han permitido sobrevivir en hábitats cuevales hostiles. Estos peces también adoptaron un conjunto de rasgos conductuales, incluyendo reducciones en el sueño19,20, ansiedad32, cardumen33 y agresividad 13,18,19,20,29,34,35,36,37, en comparación con sus peces ancestrales de superficie. La adaptación de la mayoría de estos rasgos probablemente se debió a una combinación de variación genética y presiones ambientales 35,36,28, que incluyen diferencias de hábitat entre los ríos y las cuevas. Un modelo cada vez más útil para plantear preguntas sobre el impacto de la variación genética en la adaptación morfológico y conductualde rasgos 16,18,19,20,35,38,39 y más recientemente, en la diversidad microbiota intestinal 14,15, preguntas que pueden requerir la recopilación de órganos como el cerebro, intestinos, hígado y otros, es necesario un protocolo estandarizado de disección anatómica macroscópica que pueda ser utilizado por la comunidad en general. Aunque las disecciones cerebrales enteras y las disecciones de órganos en A. mexicanus se han realizado antes, falta un método integral y integral que permita entender cómo realizar este tipo de disecciones de manera eficiente en tiempo, lo cual es fundamental para muchos tipos de proyectos, incluidos aquellos que requieren la recogida de muestras para metabolómica40, metagenómica41. o imagen de órganocompleto 16,38. Nuestro objetivo es eliminar la barrera para la resolución de problemas que permite acceder a órganos en este modelo para su postprocesamiento, permitiendo que los usuarios de la comunidad se centren sin problemas en su investigación.

En este protocolo, exponemos un método paso a paso para la disección cerebral y gastrointestinal en peces adultos de superficie y peces cueva Pachón de la especie Astyanax mexicanus. Esta metodología puede adaptarse a una variedad de protocolos posteriores, incluyendo aquellos asociados con el microbioma intestinal, la metabolómica tisular y el aclaramiento cerebral para la imagen cerebral completa en un microscopio de lámina. Esta técnica también es adaptable para su aplicación simultánea al mismo espécimen.

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Protocolo

Este protocolo se lleva a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por IACUC 2024-0004 y A790125 en el Centro de Ciencias Moleculares y el Campus de Ciencias Médicas de la Universidad de Puerto Rico.

1. Montaje previo a la disección

  1. Si usas una placa de Petri Sylgard (SP) para diseccionar, asegúrate de que estén preparados antes del procedimiento, teniendo en cuenta que puede tardar unos días en fijarse.
  2. Para preparar un plato SP, usa Sylgard 184 y Elastomer 184 en una proporción de 10:1. Mezcla 200 g de base Sylgard 184 con 20 g de elastómero en un vaso desechable. Vierte en placas de Petri hasta aproximadamente un tercio o medio de profundidad. Golpea el plato para quitar las burbujas y tapa. Asegúrate de que los platos estén llenos y dejados en una superficie nivelada. Deja curar al menos 1 semana42.
    NOTA: Si se recogen muestras para secuenciación de ARNr 16s o metagenómica, absténgase de usar platos SP. En su lugar, utiliza placas de Petri esterilizadas de un solo uso y sigue la técnica aséptica bajo una campana de flujo laminar. Si se sigue la técnica aséptica, se recomienda limpiar la campana laminar con etanol al 70%, un detergente germicida y, idealmente, exponer la campana a una lámpara C ultravioleta germicida durante 15 minutos. Esto debe hacerse antes de colocar materiales o herramientas desinfectadas y autoclavadas dentro de la campana de flujo laminar.
  3. Instala un microscopio de disección con papel de cocina a ambos lados. Designa un lado para el almacenamiento de residuos (por ejemplo, exceso de tejido orgánico) y el otro para colocar herramientas de disección esterilizadas. Corta pequeños trozos de papel de cocina para limpiar las herramientas entre disecciones.
  4. Prepara 1 PBS y guárdalo en una suspensión fría de hielo y a mano por si es necesario limpiar áreas o muestras y así mejorar la visibilidad. Dependiendo del protocolo, elige no usar 1PBS.
    NOTA: Se recomienda, por ejemplo, no utilizarlo al recoger muestras para la secuenciación metagenómica43. Si se utiliza 1PBS en este tipo de método, se recomienda recoger una muestra de 1PBS para secuenciar y detectar posibles contaminaciones.
  5. Coloca la SP (o una placa de Petri esterilizada de un solo uso) bajo el microscopio y asegúrate de tener todas las herramientas a mano (kit de disección, tubos de microcentrífuga para recoger tejido sobre hielo, etc.).
  6. Coloca 1 tubo de microcentrífuga PBS y etiquetado en un cubo de hielo cercano. Ten un cuentagotas de plástico en la mano para 1 PBS.
  7. Monta una estación de eutanasia de peces cerca. Prepara un baño de hielo colocando una mezcla de hielo en un acuario con una rejilla de plástico dentro, y luego llénalo con agua del sistema para peces (de su sistema o acuario doméstico).
    NOTA: MS-222 también puede utilizarse, dependiendo de los protocolos posteriores (necesidades de postprocesamiento de ejemplos).

2. Disección cerebral en peces adultos de superficie y peces de las cavernas

  1. Eutanasia a los peces en una suspensión de hielo. Asegúrate de que no haya movimiento y que el pez se hunde en el fondo, sin movimiento opercular. El tiempo depende del tamaño. Los peces más grandes tardarán más en dejar de moverse en la opercular.
    NOTA: Los peces juveniles tardan aproximadamente 2-5 minutos en dejar de moverse opercular (eutanasia), mientras que los peces adultos y grandes pueden tardar unos 10-15 minutos. Existen diferencias basadas en los morfosipos. Algunas poblaciones de peces cueva pueden tardar más que los peces de superficie en ser anestesiados/eutanasiados. Los protocolos de manejo y experimentales recomiendan la validación de procedimientos de anestesia y eutanasia entre poblaciones, ya que las respuestas pueden variar entre morfos ypoblaciones 11.
  2. Transfiere el pescado a una placa de Petri esterilizada de un solo uso dentro de la capucha) y, con un cuentagotas, báñalo con PBS 1x bien frío (Figura 1).
  3. Desprende la cabeza del cuerpo cortando con un bisturí a unos 2 mm detrás de las branquias (Figura 2). Esto protege parte del mesencéfalo y permite manipular el cerebro una vez disecado, sin causar daños. Retira el cuerpo hacia la zona de residuos usando una toalla de papel y luego colócalo en una bolsa de residuos biológicos dentro del contenedor para su eliminación.
  4. Con pinzas finas o un hemostato, agarra bien la parte posterior de la cabeza del pez. Con unas microtijeras, corta los bordes de la boca hacia la parte posterior de la cabeza y las branquias (Figura 3).
  5. Repite al otro lado. Quita la mandíbula y luego limpia bien la parte inferior con un segundo par de pinzas finas o ultrafinas.
    NOTA: Sigue el contorno interior de las branquias.
  6. A estas alturas, sigue sujetando firmemente la cabeza del pez con un hemostático o sujeta con un alfiler en T al SP (si lo usas), con cuidado por la punta de la boca.
  7. Desconecta ambos ojos con pinzas o tijeras ultrafinas. Inserta la punta en el borde del ojo y luego tira o corta suavemente el ojo (Figura 4).
    NOTA: No aplicable a peces caverna (raspa la piel de la zona del ojo).
  8. Rasca una línea sagital en la parte superior de la cabeza que pasa entre los ojos de adelante hacia atrás y divide la cabeza en izquierda y derecha. Después, utiliza las microtijeras para cortar la línea de forma superficial (Figura 5).
  9. Con pinzas finas, comienza a tirar cuidadosamente de los dos lados de la cabeza, teniendo especial cuidado de no romper el cerebro que está incrustado bajo el tejido conectivo. Una vez visible el cerebro, con la punta de pinzas superfinas, se desprende el cerebro del cráneo (Figura 6).
    1. Evita aplastar el cerebro sacándola con fórceps. En su lugar, sujétalo por el cerebro posterior o la médula espinal si aún queda un resto de ella para preservar su integridad.
    2. Si el cerebro sigue en un lado de la cabeza, utiliza las pinzas ultrafinas para separarlo cuidadosamente del cráneo de la cama insertando suavemente las puntas detrás del cerebro y levantándolo suavemente. Evita tirar en todo momento, ya que podría romperlo.
  10. Una vez extraído el cerebro, limpia suavemente con pinzas ultrafinas, eliminando cualquier grasa o tejido circundante. Coloca en un tubo de microcentrífuga o en un almacenamiento adecuado para el protocolo aguas abajo. En este punto, preservar todo el cerebro o recoger subregiones del cerebro (por ejemplo, telencéfalo, tectum óptico, bulbos olfativos) (Figura 7).
  11. Aislamiento de telencéfalo: Para extraer el telencéfalo, aprieta la base entre el telencéfalo y el tectum óptico con pinzas ultrafinas y separa el telencéfalo del resto del cerebro. Transfiere al tubo de almacenamiento correspondiente.
  12. Si se utiliza para metagenómica, se recolectan muestras en nitrógeno líquido y se conservan a -80 °C. Haz esto sumergiendo el tubo de la microcentrífuga en nitrógeno líquido durante 5 segundos.

Figura 1
Figura 1: Morfotipos de Astyanax mexicanus . (A) Peces de superficie. (B) Pez cueva Pachón. Barra de escala: 10 mm Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Desprendimiento de la cabeza. (A) Pez de superficie. (B) Pez cueva Pachón. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3
Figura 3: Extracción de la mandíbula de una cabeza de pez desprendida. (A) Pez de superficie. (B) Pez cueva Pachón. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Extracción del ojo de una cabeza de pez separada. En peces cueva, se puede realizar raspado del área para adelgazar el tejido. (A) Peces de superficie. (B) Pez cueva Pachón. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Corte sagital a través de la parte superior de la cabeza del pez. (A) Pez de superficie. (B) Pez cueva Pachón. Barra a escala: 5 mm Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6
Figura 6: Separación de las porciones laterales de la cabeza y exposición del cerebro dentro de la cavidad craneal. (A) Pez de superficie. (B) Pez cueva Pachón. (C,D) Extirpación del cerebro de la cama craneal. Barra a escala: 5 mm Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7
Figura 7: Anatomía cerebral regional de A. mexicanus . (A) Peces de superficie. (B) Pez cueva Pachón. Barra a escala: 5 mm Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Disección intestinal en peces adultos de superficie y peces de las cavernas

  1. Sigue el método de eutanasia descrito anteriormente.
  2. Seca el pescado con una toallita sin pelusa antes de colocarlo sobre una capa de protección limpia y cúbrelo con un PBS bien frío (o agua del sistema, según la aplicación posterior) con el cuentagotas para mantener el tejido húmedo.
  3. Asegura el pez en la SP (si lo usas) con pasadores en T.
    1. Si no usas un paralisi del sueño, un hemostático para agarrar con fuerza hacia adelante desde la boca mientras se hace cortes es suficiente. Coloca el pasador hacia delante dentro de la cuenca ocular (también cierto para peces cueva), asegurándote de que llegue a la SP.
    2. Pasar por la parte posterior a través de la cola hasta la placa. Asegúrate de que el pez permanezca quieto durante el procedimiento.
      NOTA: Si realizas una disección gastrointestinal en el mismo espécimen que la disección cerebral, decapita rápidamente con un bisturí antes de iniciar la disección y sujetar el pez a la superficie de la placa. Haz un corte diagonal anterior detrás del opérculo que preserve la parte superior de la cabeza y evite el intestino. Idealmente, divide la cabeza y el cuerpo y haz que dos disecadores experimentados trabajen en cada uno para ahorrar tiempo. El alfiler anterior puede colocarse en la parte anterior más alta del cuerpo tras la decapitación, mientras que el alfiler posterior permanece en la misma ubicación (Figura 8).
  4. Con microtijeras de disección, corta la piel y el músculo subyacente a lo largo de la línea media ventral desde la aleta anal/ano hacia el opérculo (la cubierta dura sobre las branquias) en una línea semicircular siguiendo la curva inferior del pez (Figura 9).
  5. Retira el opérculo y la aleta pectoral con las microtijeras y pinzas finas.
    NOTA: Este paso ayuda a que la extracción de la piel sea más eficiente, pero puede ralentizar la disección y puede saltarse según las necesidades.
  6. Cortar la piel y el músculo subyacente por encima de la aleta anal y luego cortar hacia adelante, hacia las branquias, extendiendo la incisión ventral según sea necesario (Figura 10). Esto, en última instancia, crea una ventana.
  7. Abre la incisión con pinzas finas para exponer la cavidad corporal. Utiliza las pinzas finas para sujetar la piel y levántala suavemente para retirarla (Figura 11).
  8. Corta tanto las inserciones anteriores como posteriores del intestino y retira cuidadosamente todos los órganos internos: retira el sistema gastrointestinal del cuerpo y colócalo en una zona limpia de la parálisis del sistema de ánimo (o placa de Petri esterilizada de un solo uso) (Figura 12 y Figura 13).
  9. Primero, separa el hígado del resto de los órganos abdominales con la pinza ultrafina. Si aislas el hígado, colócalo en un tubo de microcentrífuga o utiliza un método de almacenamiento adecuado según el protocolo o necesidad posterior. Estira cuidadosamente el intestino e identifica las partes del abdomen y del intestino medio/posterior (Figura 14).
  10. Desprende el abdomen del intestino medio/posterior.
  11. Sujeta los extremos anterior y posterior del intestino medio/posterior con pinzas finas y estira suavemente la zona para extenderla hasta su longitud total.
  12. Recoge tejido en un tubo de microcentrífuga y guárdalo adecuadamente.
  13. Si se utiliza para metagenómica, se recolectan muestras en nitrógeno líquido y se conservan a -80 °C. Esto se hace sumergiendo el tubo de la microcentrífuga en nitrógeno líquido durante 5 segundos.

Figura 8
Figura 8: Colocación de alfileres para disección gastrointestinal. (A) Peces de superficie. (B) Pez cueva Pachón. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 9
Figura 9: Corte inferior a la predisecación. (A) Peces de superficie. (B) Pez cueva Pachón. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 10
Figura 10: Extracción del opérculo y creación de una ventana. (A) Peces de superficie. (B) Pez cueva Pachón. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 11
Figura 11: Eliminación de piel lateral superficial y músculo. (A) Pez de superficie. (B) Pez cueva Pachón. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 12
Figura 12: Órganos in situ en la cavidad corporal del pez adulto tras la extirpación de músculo y piel. (A) Pez de superficie hembra con la cavidad abdominal expuesta y huevos retirados para exponer órganos. (B) Macho de pez superficial con cavidad abdominal y órganos expuestos. (C) Hembra de pez cueva Pachón con cavidad abdominal expuesta y huevos extraídos para exponer órganos. (D) Macho de pez cueva Pachón con cavidad abdominal y órganos. Las flechas negras señalan la región donde se encuentra el haz gastrointestinal. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 13
Figura 13: Haz gastrointestinal retirado de la cavidad corporal del pez. (A) Pez de superficie. (B) Pez cueva Pachón. Barra de escala: 10 mm Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 14
Figura 14: Órganos gastrointestinales aislados de peces de superficie y peces de cueva. (A) Peces de superficie. (B) Pez cueva Pachón. Barra de escala: 10 mm Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Resultados

Siguiendo este protocolo, se extrajeron contenidos cerebrales e intestinales, y se tomaron mediciones de la longitud del intestino completo, telencéfalo y tectum óptico, que se compararon entre morfotipos de peces de superficie y peces de cueva de Pachón (Figura 15). Utilizamos pruebas t de Welch de muestra independiente para comparaciones estadísticas, con un tamaño de muestra de n = 6 peces de superficie y n = 6 peces de cueva de Pachón. Los peces de superficie tenían dimensiones ...

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Discusión

La creciente relevancia de A. mexicanus como modelo de investigación en varios campos, que van desde la evolución hasta la neurociencia biomédica y la microbiología, exige un método estandarizado de disección y recogida de órganos. Aunque se han estudiado y documentado previamente estructuras aisladas, incluyendo el tectum óptico16,38, el corazónadulto 11 yotros 11,44<...

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Divulgaciones

No hay conflicto de intereses. Todos los procedimientos siguen el protocolo aprobado por IACUC 2024-0004.

Agradecimientos

Este trabajo está financiado por la subvención NIH 5R16EY037336-02, la subvención RCMI U54 MD007600 y la subvención NIH 1P20GM156713-01 (COBRE Centro Puerto Rico para Ciencias del Microbioma).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Acuario de cría de pez cebra de 1,0 litroTecniplasthttps://shop.tecniplastusa.com/products/1-0-liter-zebrafish-breeding-tankPara preparar la suspensión de hielo para la eutanasia. El tanque está medio lleno de hielo y luego el tanque interno perforado se coloca encima. Luego se llena de agua hasta arriba.
Bandeja de hielo de poliuretano de 4LUSA ScientificÍtem #2328-7242
Bolsas de residuos de riesgo biológicoFisherbrand14-828-244
Calbiochem OmniPur PBS 10x Concentrado líquido, grado de biología molecular, estérilMilliporeSigma65074L
Microscopio Disecador Olympus SZ51Olympus OLSZ51NPS-LED/R
Pinzas de tejido disecableFisherbrand08-953G
Brocas de disección, paquete de 100Herramientas de Ciencias del Hogarhttps://www.homesciencetools.com/product/dissection-pins-100-pack/?srsltid=AfmBOoofk8r6_hd4nx_7bjjP2
GzkNBlnOJ3vUKor5
rFCJvVxPN9xRlpc
Pinzas, delicados, puntas extra finas y afiladas MOPECAB132
Pinzas, tejido, punta delicada y súper finaMOPECAB047
Hemostato, 12,5 cm, rectoInstrumentos de precisión mundialhttps://wpiinc.com/products/var-15920-halsted-mosquito-hemostatic-forceps
Pinzas de joyeros, Dumont nº 5MilliporeSigmahttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f6521
Kimwipes EX-LKimberly-Clark34155
Nitrógeno líquidoProporcionado por la institución
Tijeras Micro Noyes, 12 cmInstrumentos de precisión mundial500228
Papel de cocinaProporcionado por la institución
Placas de Petri con tapa transparente, 95 mm, 15 mm, redondasFisherbrandFB0875714G
Bisturí de cuchillas, #22, pack de 10Herramientas de Ciencias para el Hogarhttps://www.homesciencetools.com/product/scalpel-blades-22-10-pack/
Empuñadura de bisturí #4Surtexhttps://surtex-instruments.com/product/scalpel-handle-no-4/
Tijeras, disección de irisMOPECAA146
Tijeras, Micro SuperfinoMOPECAA152
Pipetas de transferencia desechables estándarTermo Científica13-711-9D
Microcentrífuga Eppendorf estéril 1.5 y micro; Tubos LEppendorf05-402-25
Sylgard 184Ciencias de la Microscopía Electrónica24236-10
Termo-FrascoLab-Line Instruments Inc.2119
Tijeras ultra finasInstrumentos NEWMEDNM-DI-206023
Agua adecuada para electroforesis, PCRSigma-AldrichW4502-1L

Referencias

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