Artículo de método

Aislamiento y purificación de islotes pancreáticos a partir de ratas Lewis mediante digestión enzimática y separación por gradiente de densidad

DOI:

10.3791/70414

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3 de abril de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for BioNanoengineering, Houston Methodist Research Institute, 2School of Medicine and Health Sciences, Tecnologico de Monterrey, 3Department of Applied Science and Technology, Politecnico di Torino, 4Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Houston Methodist Hospital, 6Department of Radiation Oncology, Houston Methodist Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un método estandarizado para la extracción quirúrgica, la digestión enzimática y la purificación con gradiente de densidad de islotes pancreáticos de rata Lewis, permitiendo preparaciones de alto rendimiento y alta pureza para su uso directo en trasplantes o estudios in vitro .

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los islotes pancreáticos son esenciales tanto para el trasplante clínico de islotes como para los estudios preclínicos destinados a comprender los mecanismos y la progresión de la diabetes. Sin embargo, el progreso en estos campos suele estar limitado por la disponibilidad de islotes de alta calidad, ya que las estrategias terapéuticas emergentes requieren preparaciones más grandes, limpias y estandarizadas. Este artículo presenta un protocolo estandarizado y de alto rendimiento para la extracción quirúrgica, la digestión enzimática y la purificación por gradiente de densidad de islotes pancreáticos de ratas Lewis. El método combina la perfusión intraductal de páncreas con una mezcla enzimática definida, digestión agrupada de múltiples páncreas y separación basada en densidad para maximizar el rendimiento, minimizando la fragmentación y eliminando la necesidad de selección manual rutinaria. El rendimiento de islotes se cuantifica mediante dos enfoques complementarios: un método tradicional de conteo basado en alicuotas, comúnmente utilizado en entornos clínicos, y un método semiautomatizado basado en imágenes de preparación completa. En un aislamiento representativo de 12 páncreas, el conteo manual arrojó aproximadamente 3.300 equivalentes de islotes (IEQ) y 2.700 islotes absolutos por páncreas (~39.600 IEQ total), con una distribución de tamaño del 62% (50-100 μm), 17% (100-150 μm), 10% (150-200 μm), 5% (200-250 μm) y 6% (>250 μm). En comparación, el análisis automatizado de preparación completa reportó 16.350 IEQ totales (1.362 IEQ/páncreas), destacando la variabilidad inherente en la cuantificación basada en alicús. Las preparaciones tenían una pureza del 98% por tinción con ditizona, y la viabilidad del islote se mantuvo en un 98% in vitro en los días 3 y 7 tras el aislamiento. La evaluación funcional mediante secreción de insulina estimulada por glucosa estática demostró un aumento de 10 veces en la liberación de insulina tras una estimulación de 1 hora con 16,7 mM de glucosa. En conjunto, este protocolo proporciona un enfoque reproducible y eficiente para generar preparaciones de islotes de alta pureza y funcionalmente intactas que pueden usarse inmediatamente sin limpieza adicional. Los islotes mantienen una función robusta en cultivo durante hasta siete días, lo que permite flexibilidad tanto para ensayos in vitro a gran escala como para estudios de trasplante in vivo .

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El trasplante de islotes pancreáticos representa una estrategia viable para restaurar la producción endógena de insulina en personas con diabetes tipo 1 (T1D)1. Más allá de la diabetes tipo 1, la biología de los islotes es cada vez más relevante para la diabetes tipo 2 (T2D), una afección caracterizada por una disfunción progresiva y pérdida de células β, así como para pacientes sometidos a pancreatectomía parcial o total por pancreatitis crónica, tumores pancreáticos o lesiones traumáticas. En estos contextos, el acceso a islotes de alta calidad es esencial para avanzar en terapias celulares, modelar la insuficiencia β células, estudiar las interacciones inmunes islotes y islotes-estromales, y desarrollar enfoques regenerativosemergentes 2. Por ello, procedimientos robustos y reproducibles de aislamiento de islotes son fundamentales para apoyar tanto la investigación mecanicista como el desarrollo traslacional en una amplia gama de trastornos endocrinos pancreáticos.

Aunque los islotes constituyen menos del 2% de la masa pancreática, desempeñan un papel desproporcionadamente significativo en la homeostasis de la glucosa. Su vulnerabilidad intrínseca a la hipoxia, la sobredigestión enzimática, el estrés oxidativo y el cizalladura mecánica los hace especialmente sensibles a lesiones relacionadas con el aislamiento 3,4,5. Incluso desviaciones sutiles en la temperatura, oxigenación o manipulación de tejidos pueden afectar el acoplamiento estímulo-secreción β célula o desencadenar apoptosis, debido a las defensas antioxidantes limitadas y a la alta demandametabólica 6,7. Como resultado, la mayoría de los protocolos convencionales enfatizan el uso rápido aguas abajo, típicamente dentro de 24-48 horas previas a la cosecha, tanto en entornos clínicos como experimentales 8,9,10,11,12. Aunque este marco de "uso inmediato" minimiza el deterioro, restringe la flexibilidad experimental, dificulta los estudios longitudinales y complica los esfuerzos para acumular suficientes islotes para ensayos in vitro grandes o experimentos de trasplante in vivo.

Entre los modelos de roedores, las ratas Lewis son ampliamente utilizadas para la investigación de islotes debido a su origen genético endogámico, perfil inmunitario estable y características fisiológicasreproducibles. Las diferencias dependientes de la tensión en el rendimiento, la capacidad de respuesta y la resiliencia de los islotes están bien documentadas. De Groot et al. demostraron que los islotes de rata Lewis presentan una secreción superior de insulina estimulada por glucosa en comparación con otras cepas, subrayando su idoneidad para estudios funcionales, metabólicos y de trasplante15. Trabajos adicionales han confirmado su fiabilidad para la investigación inmunológica y de alo-/xenotrasplante 14,15,16. Sin embargo, en laboratorios, la variabilidad en el rendimiento, pureza y función de los islotes sigue siendo una barrera significativa. Gran parte de esta variabilidad surge de inconsistencias en la mezcla enzimática, técnicas de perfusión intraductal, manejo del páncreas, tiempo de digestión y estrategiade purificación 17.

Para abordar estas limitaciones, desarrollamos un protocolo reproducible paso a paso para la extracción quirúrgica, la digestión enzimática y la purificación por gradiente de densidad de islotes pancreáticos de ratas Lewis. Este flujo de trabajo está optimizado para maximizar el rendimiento, minimizar la fragmentación y preservar la viabilidad funcional. Es importante destacar que establece puntos de referencia claros, incluyendo equivalentes en islotes (IEQ), viabilidad a lo largo del tiempo, pureza y secreción de insulina estimulada por glucosa, que permiten a los investigadores distinguir de forma fiable los aislamientos exitosos de los subóptimos 18,19,20. Al mejorar tanto el rendimiento como la longevidad, el protocolo aumenta la flexibilidad experimental y puede reducir el número de animales donantes necesarios, apoyando un diseño experimental más ético y escalable.

A diferencia de muchos enfoques tradicionales, el método actual demuestra que los islotes de rata Lewis pueden mantenerse en cultivo hasta 7 días con viabilidad y función preservadas, ampliando su utilidad para estudios in vitro prolongados. El protocolo incorpora además una estrategia simplificada de procesamiento agrupado capaz de manejar hasta 30 páncreas en un solo lote, permitiendo una digestión uniforme y reduciendo la variabilidad entre muestras. Con una pureza endocrina que alcanza el 98%, el procedimiento elimina la necesidad de selección manual laboriosa y reduce las posibilidades de contaminación microbiana. En comparación con los métodos de digestión de paso único o a granel que producen frecuentemente preparaciones impuras o mecánicamentecomprometidas, este flujo de trabajo de alto rendimiento proporciona de forma fiable un gran número de islotes limpios de calidad de trasplante, adecuados para ensayos in vitro , perfilado metabólico y estudios de trasplante in vivo .

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de Houston Methodist (IACUC, protocolo #IS00007362) y se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y la Ley de Bienestar Animal.
NOTA: Los materiales e instrumentos utilizados a lo largo del protocolo pueden encontrarse en la Tabla de Materiales.

1. Preparación antes del día de la cosecha y aislamiento

  1. Preparar las siguientes soluciones en condiciones asépticas dentro de un armario de bioseguridad (véase la Tabla 1) y almacenar todas las soluciones a 4 °C hasta su uso.
    Solución de enjuague de penicilina y estreptomicina (Pen-Streptocópico).
    Material de lavado.
    Amortiguando el amortecedor.
    Medios de cultura isleta.
    Amortiguador de Krebs.
  2. Esteriliza herramientas y equipos mediante autoclave.
    1. Paquete quirúrgico para extracción de páncreas en autoclave: cortinas quirúrgicas, gasas, pinzas de tejido de diente de rata, pinzas planas, pinzas finas curvas, una tijera de piel, tijeras microdiseccionadoras, dos pequeños hemostatos y un hemostato curvo.
      NOTA: Autoclave para dos paquetes quirúrgicos de extracción de páncreas si habrá dos operadores quirúrgicos.
    2. Paquete quirúrgico de limpieza de páncreas en autoclave: pinzas finas y curvas y tijeras microdisecadoras.
    3. Autoclave una lámina de papel de aluminio de 30 cm x 30 cm.
    4. Autoclave 1-6 600 mL y 1 L de vasos de precipitados, según el número de páncreas a procesar (véase la Tabla 2).
    5. Autoclave uno tamiz de 500 μm.
    6. Autoclave de dos agujas espinales de 14 G, en caso de que alguna se obstruya con tejido pancreático sin digerir.
    7. Autoclave se requiere un tubo de jeringuilla por cada una de 50 mL (véase la Tabla 3).
  3. Prepara el baño maria para la digestión.
    1. Llena el baño maria equipado con un agitador orbital con agua ultrapura autoclavada hasta que esté a 3/4 de pulgada por encima del nivel de la plataforma.
    2. Añade 3 mL de solución antimicrobiana y mantén la tapa cerrada para minimizar la contaminación.

2. Preparativos para el día de la cosecha y el aislamiento

  1. Prepara jeringuillas de gradiente.
    1. Eliminar las soluciones de gradiente de islotes 1,108 g/cm³, 1,096 g/cm³ y 1,069 g/cm³ preparadas y utilizadas en los siguientes pasos y el paso 5.2 de "Purificación de islotes" de almacenamiento a 4 °C, y dejar que se equilibren a temperatura ambiente (aproximadamente 1 h).
      NOTA: El volumen de gradiente requerido variará según el número de páncreas a procesar; consulte la Tabla 3 para asegurar volúmenes descongelados adecuados de gradientes seleccionados.
    2. Precarga y etiqueta las jeringuillas de 50 mL con gradientes de 1,096 g/cm³ y 1,069 g/cm³.
      1. Mezclar vigorosamente las soluciones de gradiente de densidad de 1,069 y 1,096 g/cm³.
      2. Carga los volúmenes adecuados, según la Tabla 3, en jeringuillas de 50 mL equipadas con tubos quirúrgicos y una aguja de 16 G.
      3. Después de llenar, tapa las agujas para mantener la esterilidad y deja las jeringuillas a un lado para su uso posterior en el paso 5.5 de "Purificación de islotes".
    3. Mantén un gradiente de 1,108 g/cm 3 a temperatura ambiente hasta un uso posterior.
  2. Prepara una solución enzimática de medios de disociación (WDM) de trabajo, carga en jeringuillas para perfusión y vasos autoclavados.
    1. Trabaja en condiciones estériles en un armario de bioseguridad y mantén todas las soluciones en hielo.
    2. Descongelar alicotas de colagenosa, termolisina y DNasa I sobre hielo.
    3. Diluir reactivos enzimáticos en un vaso estéril de 1 L usando WDM para lograr las siguientes concentraciones finales: colagénasa 0,15 mg/mL, termolisina 5 μg/mL y DNasa I 0,1 mg/mL (Tabla 2).
    4. Mezcla el WDM suavemente usando un movimiento giratorio 10 veces. No mezcles con una pipeta; Conserva la actividad enzimática girando suavemente.
    5. Uno a uno, carga 10 mL de la solución enzimática WDM en cada jeringuilla de 10 mL usando una aguja de 16 g para el relleno rápido, y luego sustituye por una aguja tapada de 25 G x 1/2" pulgada para una posterior perfusión pancreática.
    6. Envuelve jeringuillas cargadas con papel de aluminio autoclavado y colócalas sobre hielo hasta que se usen.
    7. Distribuir el exceso de WDM por igual en vasos estériles de 600 mL para contener el páncreas cosechado según la Tabla 2. Cubre cada vaso con papel de aluminio estéril y déjalo en frío (Tabla 2).
  3. Prepara el espacio de cultivo celular.
    1. Enciende el agitador de baño maria orbital, ajustado a 130 rpm y 37 °C. Déjalo así durante la extracción del páncreas.
    2. Coloca los siguientes objetos bajo luz UV en el armario de bioseguridad durante 1 hora para una esterilización adicional.
      Tamiz estéril de 500 μm.
      Vaso estéril de 1 L.
      Bomba de jeringuilla.
    3. Asegúrese de que la incubadora de cultivos celulares esté ajustada a 25 °C 5% CO2.
    4. Ajusta la centrífuga a 4 °C, con aceleración y desaceleración a 9.
  4. Recoja materiales para la extracción y dirígete a la sala de operaciones.
    1. Limpiador de páncreas designado:
      1. Reúne un cubo grande de hielo para contener el número requerido de vasos de precipitados WDM de 600 mL y la solución de enjuague para páncreas (véase la Tabla 1 y la Tabla 2).
      2. Reúne 1 placa de Petri estéril por cada 6 páncreas que se van a procesar.
      3. Reúne 1 tijera microdisección estéril y 2 pinzas pequeñas y curvas y delicadas.
    2. Cosechadora de páncreas designada:
      1. Reúne un paquete quirúrgico estéril para la extracción.
      2. Reúne guantes quirúrgicos estériles.
      3. Reúne una bandeja de hielo con jeringuillas WDM de 10 mL precargadas selladas en papel de aluminio autoclavado.
  5. En la sala de operaciones, prepara la estación de extracción del páncreas.
    1. Enciende el esterilizador de perlas de cristal para esterilizar los instrumentos quirúrgicos sumergiéndolos durante 1 minuto en el esterilizador entre cada animal. Los instrumentos pueden enfriarse rápidamente mediante inmersión en un PBS estéril 1x.
    2. Coloque una almohadilla absorbente bajo el campo de visión del microscopio para detectar cualquier sangre o fuga de solución enzimática WDM.
    3. Ajusta el microscopio a una ampliación total de 6,3x entre las lentes ocular y objetiva.
    4. Abre el paquete quirúrgico y ponte guantes quirúrgicos estériles usando técnica aséptica.
    5. Procedan con la extracción quirúrgica.
  6. En la sala de operaciones, prepara la estación de limpieza del páncreas.
    1. Vierte suficiente solución de Pen-Strep para llenar la mitad de una placa de Petri de 100 mm (unos 6 mL) y sumergir el páncreas aislado y colocarla sobre hielo.
    2. Abre el paquete quirúrgico y ponte guantes quirúrgicos estériles usando técnica aséptica.
  7. En la sala de operaciones, prepara la cámara de eutanasia.
    1. Coloca las bandejas de depósito en una jaula para ratas vacía, limpia y que se pueda volver a sellar.
    2. Llena las bandejas hasta la mitad de isoflurano.
    3. Coloca la bandeja perforada sobre los depósitos para evitar derrames mientras las ratas están dentro.
    4. Sella la parte superior de la cámara con la tapa de la jaula.
  8. Procede a la extracción de páncreas.

3. Extracción de páncreas

  1. Coloca las ratas una a una en la cámara de eutanasia sobre la bandeja para una sobredosis rápida de isoflurano.
    NOTA: El tiempo de eutanasia necesario para la rata variará, especialmente a medida que el isoflurano se evapora.
  2. Confirma la ausencia de pulso y respiración en cada rata.
  3. Confirma la eutanasia con un método secundario que no altere la cavidad abdominal (por ejemplo, punción cardíaca).
    NOTA: Otros métodos principales de eutanasia son aceptables; Sin embargo, se prefiere la sobredosis de isoflurano, ya que la eutanasia rápida minimiza la hipoxia en los islotes.
  4. Rociar el pelaje abdominal de cada rata con un 70% de etanol para enmarañarse y evitar que el pelo suelto se produzca en el campo quirúrgico.
  5. Colocar la rata eutanasiada en posición supina bajo el microscopio con la cabeza distal al operador. Asegúrate de que la cavidad abdominal superior esté bajo el campo de visión del microscopio.

Figura 1
Figura 1: Exposición quirúrgica y perfusión intraductal del páncreas de la rata. Ilustración de los pasos clave en la exposición y perfusión del páncreas a través del esfínter de Oddi. (A) Eutanasié a una rata Lewis con la cavidad abdominal abierta. (Aa) Colocación de pinza del conducto biliar común y de la vena hepática. (B) Vista ampliada del duodeno que muestra hemostatos que marcan la región del esfínter de Oddi. (Bb) Aguja de perfusión situada dentro del conducto pancreático principal. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

  1. Cosecha del páncreas (rol del cosechador de páncreas):
    1. Realiza una incisión en forma de "V", usando tijeras para la piel, comenzando desde la sínfisis púbica hacia cada caja torácica lateral para acceder a la cavidad abdominal (véase la Figura 1A).
    2. Retrae el intestino delgado y grueso hacia el lado izquierdo del animal usando pinzas planas para despejar el "espacio de trabajo" de la cavidad abdominal.
    3. Despliega el duodeno usando las pinzas planas y los hemostáticos curvos. Asegúrese de que el conducto biliar común y la vena porta hepática estén en el campo visual del microscopio.
    4. Retrae el hígado cefálade y clampea el conducto biliar común y la vena hepática usando los hemostatos curvos. Pinza a 1-2 mm del hígado (véase la Figura 1Aa).
      NOTA: Los pasos 3.6.1-3.6.4 y 3.6.8 pueden realizarse mediante visualización directa. Utiliza el microscopio para todos los demás pasos y así asegurar una manipulación delicada del tejido.
    5. A la vista del microscopio, utilizando pinzas planas y hemostatos planos, moviliza suavemente el contenido del duodeno para eliminar el esfínter de Oddi.
      NOTA: Asegúrese de que el contenido del duodeno se desplaza del lugar de inserción previsto de la aguja.
    6. Aislar la región que rodea el esfínter de Oddi sujetando suavemente el duodeno con los hemostatos planos aproximadamente a 5 mm de cada lado del esfínter. Asegurar una compresión mínima para preservar la integridad tisular (véase la Figura 1B).
    7. Utilizando una jeringuilla estéril de WDM, inserta la aguja con cuidado a través de la pared duodenal, pásala por el esfínter de Oddi y avanza hacia el conducto pancreático principal para la perfusión (véase la Figura 1Bb).
      1. En cuanto la aguja atraviesa el esfínter de Oddi, manteniendo una presión constante, perfundir 7-10 mL de WDM en el páncreas a una velocidad de unos 500 μL/s hasta que el páncreas esté completamente distendido.
        NOTA: Asegúrate de que el bisel esté levantado y que la aguja esté paralela al conducto pancreático para minimizar el trauma. Comienza a inyectarte inmediatamente después de la inserción. Esto ayudará a dilatar el esfínter y el conducto, facilitando el avance de la aguja. El páncreas se considera completamente distendido cuando la cola del páncreas, situada cerca del bazo, se perfunde visiblemente.
    8. Extirpe el páncreas diseccionándolo suavemente para liberarlo de las estructuras circundantes en el siguiente orden: bazo, estómago, intestino grueso, duodeno y mesenterio.
      NOTA: Utiliza la disección roma para minimizar el daño en los tejidos. Proceder de forma secuencial para mantener la orientación anatómica y reducir la tensión en las conexiones vasculares y ductales.
      1. Retira ambos hemostatos planos del duodeno.
      2. Utiliza las pinzas planas para sujetar el ligamento esplénopancreático (que conecta el páncreas y el bazo) y aplica una tracción suave.
      3. Utilizando las pinzas finas y curvas de disección, moviliza cuidadosamente y separa el páncreas de las fijaciones esplénicas adyacentes.
      4. Despega el páncreas del estómago levantando el tejido pancreático con pinzas finas y curvas y aplicando una suave contratracción con pinzas planas.
      5. Luego, usando las pinzas planas, aplica una tracción firme para evacuar el intestino grueso del páncreas.
      6. Levanta el intestino delgado usando las pinzas planas y diseca el mesenterio del páncreas usando las pinzas finas y curvas.
      7. Levanta suavemente el páncreas perfundido con la pinza plana y utiliza las finas tijeras de disección para cortar cualquier unión restante al tejido conectivo.
    9. Transfiere inmediatamente el páncreas extirpado a una placa de Petri que contenga una solución de enjuague bien fría y proceda inmediatamente a extraer el siguiente páncreas, mientras el limpiador de páncreas comienza la limpieza del páncreas.
  2. Limpiar el páncreas (función del limpiador de páncreas):

Figura 2
Figura 2: Limpieza del páncreas de rata perfundido. Visualización secuencial del páncreas antes y después de la extracción de tejido no esencial. (A) Páncreas perfundido inmediatamente después de la disección, con tejido adiposo adyacente, ganglios linfáticos y estructuras conectivas visibles. (B) Páncreas perfundido con los principales hitos anatómicos etiquetados. (C) Páncreas limpio tras la extracción del exceso de tejido, mostrando el aspecto final antes de la digestión. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

  1. Utilice pinzas finas curvas y tijeras finas de disección para cortar cuidadosamente ganglios linfáticos, tejido adiposo, mesenterio y vasculatura grande del páncreas perfundido, si están presentes (véase la Figura 2).
  2. Transfiere el páncreas limpio a un vaso estéril de 600 mL que contenga 25 mL de WDM en frío. Cubre el vaso con papel de aluminio estéril para mantener la limpieza entre el traslado del espacio quirúrgico al de cultivo celular.
    1. Cambia la solución de enjuague en la placa de Petri cada 6 páncreas para evitar contaminaciones.
    2. Registra la hora en la que se coloca el primer páncreas sobre hielo. Esto se utilizará para documentar el tiempo de isquimía fría.
  1. Una vez que se hayan extraído y limpiado todos los páncreas, se procede rápidamente a la fase de digestión en el espacio de trabajo de cultivo celular.

4. Digestión del páncreas

  1. Pausa las revoluciones del agitador orbital y asegura el(los) vaso cubierto(s), que contiene páncreas, en los soportes designados del baño marea.
  2. Rápidamente, reinicia el agitador orbital configurado a 130 rpm y comienza un temporizador de 10 minutos para el tiempo de digestión (véase la Figura 3A).
    NOTA: Registra este punto como el final del periodo de isquemia fría. Registrar cada cosecha de islotes con su tiempo total correspondiente de isquemia fría en un registro de laboratorio.
  3. En el minuto 5, gira manualmente el vaso en sentido horario y luego en sentido antihorario para ayudar a la disociación del tejido.
  4. En el minuto 8, recuperar la solución de temple del almacenamiento en frío y transfiérrela al armario de bioseguridad para su uso inmediato posterior ( véase la Tabla 1).
  5. En el minuto 10, transfiere y sumerge rápidamente los vasos en hielo para ralentizar la actividad enzimática (véase la Figura 3B).
    NOTA: A partir de este punto, manipular todos los tejidos, células y soluciones sobre hielo para preservarlos hasta el paso 4.20 cuando se usan gradientes de densidad a temperatura ambiente.
  6. Transfiere el exterior del vaso y la bandeja a un armario de bioseguridad.
  7. Añade el tampón de temple en una proporción 1:1 con la solución en el vaso para detener la digestión (aproximadamente 75-100 mL por vaso de precipitados).
  8. Aspira y expulsa la suspensión tisular de forma suave y repetida utilizando una jeringuilla de 50 mL equipada con una aguja espinal de 14 g para disociar grandes fragmentos de tejido (véase la Figura 3C).
  9. Transfiere la suspensión a tubos cónicos de 200 mL.
  10. Enjuaga el vaso con 5 mL de medio de lavado y decanta en el tubo cónico de 200 mL que contiene la digestión del islote para recoger cualquier digestión restante.
  11. La centrífuga digiere a 200 × g durante 5 minutos a 4 °C. Asegúrate de usar adaptadores y cojines adecuados para la botella de centrifugadora por motivos de seguridad.
  12. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 100 mL de medio de lavado usando la misma aguja espinal de 14 g que antes.
  13. Filtra la suspensión a través de un tamiz estéril de 500 μm colocado sobre un vaso de precipitados estéril de 600 mL para eliminar cualquier tejido grande y no digerido.
    NOTA: Si la perfusión y limpieza del páncreas se realizaron de forma óptima, permanecerá un mínimo de tejido adiposo y ningún páncreas sin perfusionar sobre el tamiz.
  14. Enjuaga el colador con 10 mL de medio de lavado para recuperar el tejido atrapado.
  15. Transfiere el filtrado a nuevos tubos cónicos de 200 mL.
  16. Centrifugar a 200 × g durante 5 minutos a 4 °C.
  17. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en un medio de lavado de 100 mL usando una pipeta sorológica de 10 mL.
    NOTA: Asegura una pérdida mínima de células humedeciendo las puntas de la pipeta con un tampón que contenga FBS antes de la exposición a los islotes.
  18. Centrifugar a 600 × g durante 5 minutos a 4 °C.
  19. Aspira cuidadosamente el sobrenadante para obtener un pellet seco.
  20. Ajusta la temperatura de la centrífuga a 22 °C en preparación para la separación del gradiente.
    NOTA: Esto se puede acelerar haciendo funcionar la centrífuga a 2000 x g durante 15 minutos a 22 °C, sin muestras.

5. Purificación de islotes

  1. Consulte la Tabla 3 para determinar el número de tubos cónicos de 50 mL necesarios.
    NOTA: Consulte la Tabla 3 para distribuir el volumen total del pellet de forma uniforme, asegurando que aproximadamente 2-3 mL de digestión del pellet se dividan en cada tubo de gradiente. Si más adelante se observa una débil separación de bandas de islotes, se utilizan tubos de gradiente adicionales para mejorar la resolución de separación.
  2. Prehumedece una punta de pipeta serológica de 10 mL con la solución de gradiente de densidad de 1,108 g/cm³ para evitar que los islotes se adhieran a la superficie interna de la punta.
  3. Resuspender cada pellet de tejido en 15 mL de solución gradiente de 1,108 g/cm³ por cada 2 mL de volumen de pellet utilizando la pipeta serológica de 10 mL prehumedecida. A pesar de que el volumen total supera los 10 mL, el menor ancho de la pipeta facilita una mezcla más controlada y una disociación eficiente de los pellets. Mezcla suavemente hasta que quede uniforme.
  4. Dispensar cuidadosamente 15 mL de la suspensión de celda en la parte inferior de cada tubo cónico de 50 mL, evitando el contacto con las paredes del tubo para asegurar niveles limpios de gradiente.
  5. Utilizando jeringuillas de gradiente precargadas, superpon secuencialmente 10 mL de gradiente de 1,096 g/cm³, seguidos de 10 mL de gradiente de 1,069 g/cm³.
  6. Dispensar cada gradiente a una velocidad de 5 mL/min usando una bomba de jeringuilla, posicionando la punta de la aguja de 16 G contra la pared interna del tubo para evitar la mezcla de gradientes.
  7. Centrifuga los tubos a 700 × g durante 15 minutos a 22 °C, con la aceleración de la centrífuga en 3 y la desaceleración en 0 para evitar la mezcla de gradientes.
    NOTA: Dado el tiempo de desaceleración prolongado, todo el ciclo de centrifugación dura aproximadamente 45 minutos. Controla el tiempo de cerca, ya que los islotes deben recogerse rápidamente para evitar la mezcla de gradientes y posibles daños celulares. Si es necesario, prepara los tubos de contrapeso por peso, no por volumen, para tener en cuenta las diferencias de densidad. Tras retirar los tubos, reinicia la centrífuga a 4 °C y acelera y desacelera a 9 para los siguientes pasos.
  8. Tras la centrifugación, se identifica la capa de islote situada en las interfaces entre las capas de gradiente de 1,069-1,096 g/cm³ y 1,096-1,108 g/cm³ (véase la Figura 3D).
  9. Aspira y descarta cuidadosamente cualquier tejido recogido en la capa superior utilizando una pipeta Pasteur previamente humedecida con medio de lavado.
  10. Moja otra pipeta Pasteur, recoge la capa de islote y transfierela a un tubo cónico preenfriado de 200 mL que contiene 5 mL de medio de lavado.
  11. Sube el volumen del tubo cónico de 200 mL preenfriado a 200 mL con medio de lavado.
  12. Centrifuga a 600 × g durante 5 minutos y decanta el sobrenadante.
  13. Suspende el pellet en 30 mL de medio de lavado usando una punta serológica de 10 mL previamente humedecida.
  14. Transfiere la resuspensión a un nuevo tubo cónico de 50 mL usando una punta serológica prehumedecida de 10 mL para mejorar la granulación de islotes.
  15. Enjuaga el mismo tubo cónico de 200 mL con 20 mL de medio de lavado y transfiere al tubo cónico de 50 mL que contiene los islotes restantes.
  16. Centrifuga la cónica de 50 mL con islotes y material de lavado a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
  17. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de islote en 50 mL de medio de cultivo de islotes (véase Tabla 1).
    NOTA: Elimina las alicotas de 100 μL durante este paso si cuentas islotes con el método de cuantificación manual.
  18. Placar uniformemente los islotes en placas de Petri de 100 mm que no sean tratadas con cultivo de tejidos, usando una placa por cada cinco páncreas de rata Lewis procesadas.
    1. Calcula el volumen total de medios de islote requerido usando la fórmula (número de páncreas ÷ 5 × 10 mL).
    2. Resuspende el bolíto del islote a la mitad del volumen calculado del medio y luego distribuye la suspensión uniformemente entre el número determinado de placas.
    3. Enjuaga el tubo cónico de 50 mL que contiene islotes residuales con la mitad restante del medio calculado y pítee este lavado a través de las mismas placas para alcanzar un volumen final de 10 mL por plato (véase la Figura 3E).
  19. Incubar durante la noche a 25 °C con un 5% de CO₂. Añade 3 mL de medio de cultivo de islotes cada 24 horas al lado de cada placa de Petri y luego remueve suavemente para reponer el medio.
  20. Procede al conteo de islotes (paso 6).

Figura 3
Figura 3: Digestión y purificación del páncreas de islotes aislados. Imágenes representativas de los pasos secuenciales desde la digestión del páncreas agrupado hasta la purificación de islotes. (A) Agrupar páncreas perfundidos antes de la digestión enzimática. (B) Páncreas fragmentados tras la digestión enzimática. (C) Suspensión uniforme de tejido, post-mecánica. (D) Tubos de gradiente de densidad antes de la centrifugación (izquierda) y después de centrifugación (derecha), con la banda visible de islotes en la interfaz del gradiente rodeada. (E) Imagen de campo claro de los islotes del Día 0 inmediatamente después de la recogida. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

6. Conteo de islotes

  1. Recoge cuantificación manual de islotes.
    1. Durante el paso 5.16, retira tres alicuotas de 100 μL de la suspensión del islote usando una pipeta de 200 μL y puntas normales de 200 μL.
      NOTA: Asegúrese de que los islotes estén suspendidos de forma uniforme en medio mediante mezcla de pipetas cuando se tomen las alicuotas para medir.
    2. Transfiere cada alícuota a su propia placa de Petri cuadrículada de 2 mm × 2 mm que contenga 1 mL de 1× PBS.
    3. Cuenta los islotes bajo un microscopio invertido, catalogándolos por diámetro con un inserto de lente de retícula ocular.
      NOTA: No todos los islotes serán circulares; Sigue las mediciones horizontales o verticales durante el conteo.
    4. Calcular el número total de equivalentes de islotes de 150 μm utilizando la tabla de conversión estandarizada (véase la Tabla 4).
      NOTA: Compara el IEQ de cada muestra. Si el IEQ de las alicuotas difiere en más del 30%, procede con la media de las alicuotas más similares.

7. Precauciones de seguridad

  1. Realizar todos los procedimientos quirúrgicos y de manipulación de tejidos en condiciones asépticas dentro de un armario de bioseguridad cuando sea apropiado. Utiliza equipo de protección individual (EPP), incluyendo gafas de seguridad, batas de laboratorio, guantes y mascarillas quirúrgicas, durante el manejo de reactivos y tejidos.
  2. Realizar la extracción del páncreas en condiciones estériles con herramientas quirúrgicas y equipo de protección personal adecuados. Manejar el isoflurano y otros anestésicos conforme a las directrices de la institución para evitar la exposición por inhalación.
  3. Eliminar tejidos animales, objetos punzantes y residuos biológicos en cumplimiento de los protocolos institucionales de bioseguridad. Mantener reactivos enzimáticos y materiales biológicos sobre hielo salvo que se especifique lo contrario para preservar la actividad y la viabilidad.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los siguientes resultados representan un aislamiento típico de islotes realizado mediante el método descrito, con doce páncreas de rata Lewis procesadas en paralelo.

Distribución de rendimiento y tamaño

Conteo manual de alicotas y conversión IEQ

Se obtuvieron dos alicotas independientes de 100 μL de la suspensión mixta de islotes, como se describe en la sección "Conteo de islotes", Paso 6.1, y se contaron por compartimentos de diámetro (50-100 μm, 100-150 μm, 150-200 μm, 200-250 μm, 250-300 μm, 250-300 μm). Los conteos se convirtieron a equivalentes de islotes (IEQ; 150 μm de referencia) utilizando tablas estándar de equivalencia y se extrapolaron al volumen total de la suspensión (véase la Figura 4A). En el aislamiento de prueba (n = 12), el rendimiento fue de 3330 IEQ/páncreas con un diámetro mediano de islote en el bin de 50-100 μm. Replicar las alicuotas acordadas por un 18,8% por bin (coeficiente de variación), indicando una variación moderada pero esperada mediante métodos de conteo manual. En las 14 anteriores aislaciones de islotes, este método produjo una media de 1353 IEQ/páncreas (SD 607).

Cuantificación automatizada de placa completa

Para comparar la IEQ manual, se adquirieron imágenes de campo brillante en D1 usando un microscopio y se cosieron para generar composiciones de plato completo (4× objetivo; 1/100 s). Se realizaron tamaños automatizados y cuantificación de objetos usando Fiji y codificación con un umbral de tamaño predefinido de 50-600 μm. Las imágenes se preprocesaron primero para reducir la variación del fondo y mejorar la uniformidad del contraste. Las estructuras de islotes se identificaron en función de diferencias de intensidad respecto al tejido circundante, generando máscaras binarias de objetos. Los islotes adyacentes o parcialmente en contacto se separaron para evitar la subestimación del número de objetos. Se excluyeron los objetos fuera del rango de tamaño especificado para eliminar escombros y tejido no islote. Para cada objeto retenido, se extrajeron parámetros morfométricos incluyendo el área y los diámetros de los ejes x y y. Los islotes se agruparon por diámetro, y el IEQ se calculó multiplicando el número de islotes en cada compartimento de tamaño por el factor de conversión correspondiente. El tamaño automatizado produjo un total de 98.832 objetos, con diámetros medios en los ejes x y y de 117 μm y 116 μm, respectivamente, y un total estimado de 16.350 IEQ, que se correlacionó fuertemente con IEQ manual medida en D0 (Spearman r = 0,937, p = 0,0048; véase la Figura 4A-C).

Desprendimiento celular de islotes

Las imágenes de la placa completa se adquirieron 2 horas después de la purificación y de nuevo en el Día 1 (D1), utilizando la misma metodología en la "Cuantificación automatizada de placa completa" para evaluar la estabilización temprana del islote ("shedding"). El número de objetos cambió un 0,9% y el IEQ en -6,11% de 2 h a D1 (véase la Figura 4D). La comparación por pares de diámetros de islotes entre D0 y D1 mostró una disminución mediana estadísticamente significativa de 2 μm (prueba de Wilcoxon con rango de signos, p = 0,0136, n = 2820). Sin embargo, la pequeña magnitud de este cambio probablemente no sea biológica o clínicamente significativa.

Figura 4
Figura 4: Evaluación cuantitativa de la distribución del tamaño de los islotes, correlación y caída temprana de los islotes. Resumen gráfico de mediciones de islotes obtenidas mediante análisis manuales y automatizados. (A) Distribución del tamaño de islotes del Día 0 (D0) basada en cuantificación manual entre contenedores estandarizados equivalentes a islotes de tamaño IEQ. (B) Día 1 (D1) Distribución del tamaño de los islotes determinada por mediciones automáticas basadas en imágenes en los mismos contenedores estandarizados de tamaño IEQ. (C) Correlación de los recuentos entre la cuantificación manual de D0 y la cuantificación automática de D1 entre los contenedores de tamaño IEQ. (D) Diagrama de caja de la distribución de los diámetros de islotes entre D0 y D1 para mediciones automáticas de la misma placa. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Pureza (contenido endocrino vs. exócrino)

Tinción con ditizona (DTZ)

En D1, se teñió con DTZ una alitera de islotes (n = 451) durante 30 s a temperatura ambiente y se fotografió inmediatamente mediante microscopía de campo brillante (4× objetivo; exposición de 1/20 s). En Fiyi, se eliminaron los píxeles de fondo de modo que el área restante correspondiera al área total de los islotes. Las regiones de tejido exocrino DTZ negativo, identificadas por un contraste de color más oscuro, se seleccionaban manualmente usando una herramienta de lazo, y el área de cada región de interés se registraba automáticamente en píxeles. La pureza endocrina se calculó como el porcentaje de píxeles DTZ positivos en relación con el total de píxeles de los islotes, dando una pureza de 98,56 ± 0,38% (Figura 5A).

Viabilidad y rendimiento funcional

Secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS)

En cada punto temporal (D1, D3, D7), se seleccionaron a mano 15 islotes de tamaño similar y se colocaron en pozos individuales de una placa de 24 pozos, preparados en cuadruplicados. Los islotes fueron incubados a 37 °C 5% CO2 en un tampón de Krebs bajo un protocolo de estimulación de glucosa baja-alta-baja: primero en glucosa baja (2,8 mM, 60 min), seguido de glucosa alta (16,7 mM, 60 min, véase Tabla 1). Se recogieron fracciones de efluente al final de cada periodo de incubación y las concentraciones de insulina se cuantificaron utilizando un ensayo ELISA de insulina en rata. Los índices de estimulación se calcularon como la proporción de secreción de insulina durante condiciones de glucosa alta a baja. Los índices de estimulación fueron 9,37, 8,34 y 6,7, en los días 1, 3 y 7, respectivamente, sin diferencias significativas (Figura 5B).

Tinción viva/muerta

En D1, D3 y D7, se seleccionaron a mano 15 islotes y se teñieron con el kit de viabilidad Vivo/Muerto según las instrucciones del fabricante. Brevemente, los islotes se incubaron en la solución de tinción Live/Dead durante 30 minutos a 25 °C, y luego se imagaron bajo ajustes de microscopio consistentes para asegurar la comparabilidad entre puntos de tiempo (objetivo 4X; exposición de 1/30 s, filtros Texas Red y GFP). La viabilidad se cuantificó mediante un script Python que empleaba scikit-image para la segmentación de islotes y la medición de fluorescencia. Los islotes se identificaron combinando los canales de fluorescencia verde y rojo, aplicando el método de umbral de Li para generar una máscara binaria y utilizando segmentación de cuencas para separar islotes en contacto. Los objetos se filtraron por área para excluir escombros y artefactos. Para cada islote, la viabilidad se calculó como el porcentaje de densidad integrada viva (píxeles verdes) en relación con la densidad integrada total (píxeles verdes más rojos). Los resultados mostraron una viabilidad del 68 ± 9% en D1, 98,2 ± 0,6 % en D3 y 100% en D7. Una muestra de control positiva tratada con etanol al 70% durante 10 minutos mostró una viabilidad de 2,7 ± 7,2% (véase la Figura 5C-F).

Figura 5
Figura 5: Evaluación de la pureza, viabilidad y respuesta funcional de los islotes. Imágenes representativas y resúmenes cuantitativos de las características de los islotes aislados a lo largo del tiempo. (A) Imagen representativa de campo claro 10× de islotes teñidos con ditizona (DTZ), mostrando islotes endocrinos teñidos de rojo y tejido exocrino sin teñir. (B) Valores de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) del índice de estimulación de glucosa alta/baja glucosa (HG/LG) para los días 1, 3 y 7. (C-E) Imágenes de fluorescencia viva/muerta de islotes en el Día 1 (C), Día 3 (D) y Día 7 (E). (F) Imagen de fluorescencia viva/muerta de islotes de control positivo tratados con etanol. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

(a) Medios de lavado
ComponenteConcentración finalCantidad (mL)
RPMI 1640-500 mL
Suero fetal bovino10%50 mL
Pen-Strep (10.000 U/mL)1%5,5 mL
HEPES25 mM12,5 mL a partir de 1M stock
L-glutamina2 mM5 mL de 200 mM de stock
(B) Medios de Cultura de los Islotes
ComponenteConcentración finalCantidad (mL o g)
RPMI 1640, sin glucosa-500 mL
Suero fetal bovino10%50 mL
Pen-Strep (10.000 U/mL)1%5,5 mL
HEPES20 mM11 mL de 1M stock
Piruvato de sodio1 mM5,5 mL de 100 mM de material
Glucosa5,5 mM2,75 mL de 200 g/L
(C) Solución de enjuague de penicilina y estreptomicina
ComponenteConcentración finalCantidad (mL o g)
Solución salina, 0,9%-500 mL
Estreptomicina penicilinosa (10.000 U/mL)2%10 mL
(D) Amortiguador
ComponenteConcentración finalCantidad (mL o g)
HBSS-500 mL
Suero fetal bovino20%100 mL
HEPES (1 M)2.50%2,5 mL
(E) Amortiguador de Krebs
ComponenteConcentración finalCantidad (mL o g)
dH2O-975 mL
NaCl115 mM6,72 g
NaHCO324 mM2,02 g
KCl5 mM0,3728 g
HEPES (1 M)25 mM25 mL
MgCl21 mM0,0952 g
BSA0.10%1 g
CaCl22,5 mM0,2775 g

Tabla 1: Lista de soluciones. Detalles de composición y preparación para todas las soluciones utilizadas a lo largo del protocolo de aislamiento y purificación de islotes. Cada subsección enumera los componentes, concentraciones finales, volúmenes de preparación y números de catálogo. (A) Medios de lavado, usados para enjuagar y lavar tejido durante la digestión y purificación. (B) Medios de cultivo de islotes, utilizados para el mantenimiento y viabilidad de islotes tras el aislamiento. (C)Solución de enjuague de penicilina y estreptomicina, utilizada para esterilizar y enjuagar el páncreas cosechado. (D) Tampón de Temple, utilizado para terminar la digestión enzimática y preservar la viabilidad celular. (E) Tampón de Krebs, utilizado durante los ensayos de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS).

Número de páncreasColagenasa (15,38 mg/mL)Termolisina (1 mg/mL)ADNAsa (100 mg/mL)Amortiguador de funcionamiento600 mL de vasos de precipitados para usarVolumen/Vaso de precipitados
304,5 mL2,25 mL450 μL450 mL525 mL
243,6 mL1,8 mL360 μL360 mL425 mL
203 mL1,5 mL300 μL300 mL325 mL
162,4 mL1,2 mL240 μL240 mL225 mL
121,8 mL0,9 mL180 μL180 mL225 mL
101,5 mL0,75 mL150 μL150 mL225 mL
Concentración final.0,15 mg/mL5 mg/mL0,1 mg/mL

Tabla 2: Solución enzimática digestiva por cantidad de páncreas. Se requerían volúmenes de colagénasa, termolisina y DNasa para preparar el Medio de Disociación de Trabajo (WDM) para diferentes cantidades de páncreas de rata. Las concentraciones finales de cada enzima se indican al final de la tabla.

Número de páncreasTubos número 50 mLVolumen/ jeringaNúmero de 1,096 jeringuillasNúmero de 1,068 jeringuillas
3010 tubos50 mL22
248 tubos40 mL22
206 tubos30 mL22
164 tubos40 mL11
124 tubos40 mL11
102 tubos20 mL11

Tabla 3: Carga en gradiente por cantidad del páncreas. Número de tubos cónicos de 50 mL y los correspondientes volúmenes de gradiente necesarios para la purificación de islotes según el número de páncreas procesados.

Rango de diámetro de islotes (μm)Número de Partículas de los Islotes (IA)Factor de conversión IEQIEQ por rango
50-100a* 0.167a * 0,167
101-150b* 0.648b * 0,648
151-200c* 1.685c * 1.685
201-250d* 3.500d * 3.500
251-300e* 6.315e * 6.315
301-350f* 10.352f * 10.352
> 350g* 15.833g * 15.833

Tabla 4: Conversión de equivalencia de islotes. Conversión de los rangos de diámetro de islotes a equivalentes estandarizados de islotes (IEQ). La tabla muestra los contenedores de diámetro observados de islotes, el número de partículas de islotes por rango, el factor de conversión IEQ correspondiente para cada rango de tamaño y la contribución resultante de IEQ por rango.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un enfoque de alto rendimiento para aislar y purificar islotes pancreáticos de ratas Lewis. El éxito del método depende de varios pasos críticos que, en conjunto, preservan la integridad y función de los islotes. Entre ellos se encuentran la perfusión intraductal precisa y completa del páncreas, la limpieza cuidadosa del páncreas perfundido y el tiempo exacto de digestión enzimática. La perfusión consistente de órganos completos es crucial para lograr una distensión uniforme del páncreas y garantizar una distribución uniforme de la mezcla de colagenonasa-termolisina-DNasa, que actúa respectivamente digeriendo la matriz extracelular, mejorando la penetración enzimática y reduciendo la viscosidad mediada por elADN 21,22. La subperfusión puede provocar una digestión incompleta de los tejidos y la pérdida de una parte significativa de los islotes, ya que el tejido poco digerido se filtra con el tamiz. De manera similar, una eliminación inadecuada del tejido adiposo o vascular antes de la digestión puede introducir impurezas no endocrinas que reducen la pureza. Finalmente, una digestión prolongada provoca la desegregación de islotes por la rotura excesiva de la matriz extracelular, mientras que una digestión subóptima produce tejido no digerido resistente a la digestión mecánica mediante aguja espinal. Estos pasos representan los errores técnicos más frecuentes y deben ser monitorizados cuidadosamente durante el entrenamiento y la optimización.

Aunque este método fue diseñado específicamente para ratas Lewis, probablemente pueda adaptarse a otras cepas o especies mediante una ligera reoptimización del tiempo de digestión y la proporciónenzimática 23,24,25,26. Algunos laboratorios pueden optar por ajustar la proporción de colagénasa, termolisina y DNasa I en el Medio de Disociación de Trabajo (WDM) para optimizar el rendimiento según las características específicas de su lote enzimático o tisul. Para ello, los laboratorios pueden seguir cuidadosamente la guía paso a paso del fabricante para la optimización de enzimas y tejidos y, en todos los casos, evitar añadir componentes como 0,1 M EDTA, cisteína, mercaptoetanol, inhibidores de proteasa, suero o albúmina, ya que estos pueden inhibir la colagenasa, la termolisina y la actividad enzimáticaDNasa 1 27. Aunque no se ha publicado un tiempo de trabajo definitivo para la mezcla enzimática antes de la disociación, datos previos muestran que la preservación prolongada en frío del páncreas afecta negativamente al rendimiento y función de losislotes 28. Empíricamente, hemos comprobado que, en nuestro protocolo, los aislamientos exitosos se lograban consistentemente cuando el tiempo total de isquemia fría, definido como el intervalo entre colocar el primer páncreas sobre hielo para su limpieza y transferirlo al baño maria de 37 °C, se mantenía por debajo de 1,5 h. Puede ser necesaria una optimización adicional de este parámetro dependiendo de la aplicación del usuario final.

A pesar de su robustez, este protocolo presenta varias limitaciones prácticas y técnicas. En primer lugar, la mezcla enzimática (colagénasa, termolisina y DNasa I) y los gradientes de densidad son esenciales para una disociación eficiente de tejidos y aislamiento de islotes, pero suponen un coste significativo. Nuestra selección de combinación enzimática se informó de las características estructurales de la matriz extracelular pancreática y la necesidad de equilibrar una disociación tisular eficaz con la preservación de la integridad de los islotes. Cada componente enzimático facilita un papel distinto: la colagénasa se dirige a los colágenos fibrilares y de membrana basal para liberar islotes; la termolisina, una proteasa neutra, corta proteínas de la matriz no colágena y moléculas de adhesión célula-célula, reduciendo la exposición necesaria a la colagenasa; y la DNasa I minimiza la viscosidad causada por el ADN liberado de célulaslisadas 29,30,31. Aunque las formulaciones de enzimas digestivas de menor coste están disponibles comercialmente, su pureza es variable y puede comprometer el rendimientoenzimático 13,23. Dado que la colagenasa se aísla de cultivos bacterianos, pasos adicionales de purificación reducen la contaminación por endotoxinas pero aumentan sustancialmente elcoste 13,23.

Para la colagenasa, recomendamos preparaciones con una actividad de aproximadamente 2.000 a 4.000 unidades de Wünsch por botella, que favorecen una disociación eficiente con dosis moderadas y evitan una digestión prolongada. Cabe destacar que la mezcla debe incluir una proporción equilibrada de colagénasa clase I y clase II, correspondiente a una fracción de colagenasa II/colagenasa total de aproximadamente 0,3-0,5. Esta proporción proporciona una fuerte actividad colagenolítica y limita la degradación excesiva de la matriz extracelular no colágena. Además, la mezcla de colagenasa debe complementarse con un nivel moderado de actividad proteasa neutra (aproximadamente 150.000-250.000 unidades) y DNasa, por las razones ya comentadas.

Desde el punto de vista del control de calidad, cada lote debe incluir documentación de baja carga de endotoxinas (≤50 EU/mg de proteína), alta pureza enzimática (≥85% por HPLC) y actividad verificada de lote a lote, ya que la pureza y composición de las enzimas pueden variar considerablemente según el fabricante. Finalmente, las variaciones en la composición de los lotes pueden afectar la consistencia digestiva y el rendimiento de los islotes, lo que requiere la realización de una validación interna específica de cada lote. Esta validación puede lograrse siguiendo las condiciones de digestión estandarizadas descritas en este protocolo y evaluando posteriormente la eficiencia digestiva y la morfología de los islotes. Los indicadores de un rendimiento enzimático subóptimo incluyen disociación incompleta del tejido, islotes con bordes irregulares o rugosos, o la necesidad de un corte mecánico excesivo para lograr la separación, en cuyo caso puede ser necesaria la titulación del tiempo de digestión.

Consideraciones similares se aplican a los gradientes de densidad. Seleccionamos un gradiente basado en polisacarosa, un copolímero sacarosa-epiclorhidrina no iónico y altamente hidrofílico que forma gradientes estables de hasta 1,2 g/mL y tiene un largo historial en aislamientode islotes 32,33. El iodixanol es una alternativa bien validada, y estudios en islotes humanos muestran que los gradientes basados en iodixanol pueden mejorar la recuperación de islotes manteniendo la viabilidad y función 34,35,36,37. Sin embargo, los datos sobre roedores son inconclusos, con algunos estudios que reportan resultados superiores usando iodixanol y otros que demuestran mejor viabilidad y función con gradientes basados enpolisacarosa 32,35. De manera crítica, se recomienda el uso de soluciones de gradiente fabricadas comercialmente y con control de calidad para mejorar la reproducibilidad en laboratorios. Los gradientes basados en polisacarosa están ampliamente disponibles con densidades óptimas para aislar islotes, mientras que los gradientes de iodixanol suelen prepararse mediante dilución interna, introduciendo variabilidad adicional. Una segunda limitación es que la extracción quirúrgica requiere un alto nivel de destreza técnica, especialmente para la perfusión intraductal a través del esfínter de Oddi y la rápida escisión del páncreas. Incluso retrasos o desalineaciones menores pueden provocar daños tisulares, fugas, perfusión desigual o isquemia tibia prolongada, lo que puede comprometer el rendimiento y la viabilidad de los islotes. Para mitigar esta limitación, el protocolo incluye descripciones procedimentales detalladas y ayudas gráficas originales con puntos anatómicos codificados por colores para facilitar la comprensión. Se anima a los nuevos operadores a familiarizarse con la técnica de perfusión antes de realizar aislamientos completos, y se recomienda practicar con canales antes de intentar capturas vivas.

Tercero, para lograr la máxima eficiencia, este protocolo requiere trabajo en equipo coordinado. Durante la extracción del páncreas y la digestión enzimática, normalmente se requieren tres operadores formados: uno que realiza cirugía estéril, otro limpia el páncreas en condiciones estériles y otro que circula y eutanasia animales en condiciones no estériles. Tras la digestión, los pasos de purificación aguas abajo generalmente pueden ser realizados por menos operadores una vez alcanzada la competencia. Aunque esta coordinación representa una demanda logística inicial, permite aislar muchos islotes de varios animales en un plazo relativamente corto, mejorando el rendimiento general en comparación con flujos de trabajo menos coordinados. Aunque este protocolo es técnicamente exigente y requiere muchos recursos, estas limitaciones son comunes a todos los métodos de aislamiento de islotes. Al enfatizar condiciones de digestión estandarizadas, formación estructurada y ejecución coordinada, este enfoque de alto rendimiento puede reducir el tiempo y el trabajo por aislamiento y producir resultados consistentes y reproducibles cuando lo realiza un equipo entrenado.

En comparación con los protocolos convencionales de aislamiento de islotes de roedores, este método ofrece ventajas sustanciales en rendimiento, reproducibilidad y consistencia. Las digestiones tradicionales de un solo órgano dependen en gran medida del picking manual y a menudo producen una purezavariable 13. En cambio, nuestro protocolo utiliza digestión agrupada y purificación por gradiente de densidad, reduciendo sustancialmente el tiempo de preparación y la variabilidad entre muestras, manteniendo una alta viabilidad y respuesta funcional en los islotes. Los islotes aislados fueron caracterizados de forma exhaustiva por morfología (tinción por ditizona), viabilidad (ensayo vivo/muerto) y función (secreción de insulina estimulada por glucosa), confirmando la robustez del método. En conjunto, este flujo de trabajo estandarizado permite la generación de preparaciones de islotes abundantes, limpias y funcionales adecuadas para aplicaciones posteriores, incluyendo encapsulación, trasplante y modelado microfisiológico 38,39,40. Es importante destacar que los islotes de rata de Lewis aislados con esta técnica han revertido la diabetes en modelos preclínicos, subrayando la relevancia traslacional de este enfoque reproducibley escalable 41.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.G. es cofundador y asesor científico principal de Continuity Biosciences, LLC. A.G., J.P-M. y C.Y.X.C. son inventores de propiedades intelectuales licenciadas por Continuity Biosciences, LLC. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R01DK133610-01 (A.G., N.K.) y NIH NIDDK R01DK132104 (A.G.), Breakthrough T1D SRA-2021-1078-S-B (AG) y SRA-2022-1224-S-B (A.G., N.K.), y la Fundación Vivian L. Smith.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
21 G x 2 pulgadas. BD PrecisionGlide NeedleBD305129
500 y micro; m Bastidor de latón y criba de acero inoxidable 304, 3" de diámetro x 1" de profundidad (tamiz número 35)McMaster-Carr34735K525
Jeringuillas estériles Air-Tite, cerradura LuerFisher Scientific14-817-178
Biogel PI UltraTouch MMö Inlycke42665
Tijeras de Bonn; Recto; Puntas Afiladas; Longitud de la hoja de 15 mm; Longitud total de 3 1/2"RobozRS-5840
Braintree Scientific GERMINATOR 500 DRY STERILFisher ScientificNC9956482
Serie Cell-IQ 5,8 pies cúbicos. Incubadora de Laboratorio de CO2PHCBIMCO-170AICUVHL-PA
Plato de cultivo Corning de 100 mm No tratado con TCCorning430591
Suero fetal bovino Corning, 500 mL, normal, probado por el USDA (inactivado por calor)Corning35011CV
Gradiente de Corning Islet 1,069 (densidad 1,069 g/cm3)Corning99-815-CISRequiere una solicitud especial por parte de la empresa
Gradiente de islote de Corning 1,096 (densidad 1,096 g/cm3)Corning99-691-CISRequiere una solicitud especial por parte de la empresa
Gradiente de islote de Corning 1,108 (densidad 1,108 g/cm3)Corning99-692-CISRequiere una solicitud especial por parte de la empresa
Protecciones Tendersorb CovidienFisher Scientific22-225-102
DNasa I Grado IIRoche10104159001
Falcon  Tubos centrífugos cónicos de alta claridad de 50 mLFisher Scientific14-432-22
Papel de aluminio Fisherbrand, rollo de vía estándarFisher Scientific01-213-100
Fisherbrand  Esponjas de gasa no tejidasFisher Scientific22-028-559
Vasos de precipitados reutilizables de vidrio de baja resistencia y baja resistencia FisherbrandFisher ScientificFB101600
Miroscopio de fluorescencia  BZ-X810KeyenceBZ-X810
Solución de glucosaGibcoA2494001
Soporte para microagujas HalseyHerramientas Científicas Fines12500-12
HBSS, calcio, magnesio, sin fenol rojoGibco14025092
HEPES (1 M)Gibco15630080
Pinzas hemostáticas Classic Crile de 5-1/2 pulgadas de longitudMcKesson1231217
Pinzas Hudson (Ewald)RobozRS-5238
Monoyecto de aguja hipodérmica de 1,1/2 pulgada de largo, pared regular de calibre 16 sin seguroMcKesson43481
L-Glutamina (200 mM)Gibco25030081
Liberase T-Flex, grado de investigaciónRoche5989132001
Kit de viabilidad/citotoxicidad VIVA/MUERTO, para células de mamíferosInvitrogen  L3224
Paquete de software MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
Bomba de jeringuilla programable NE-4000 de dos canalesBomba de JeringaNE-4000-US
AGUJA, HIPO FUERZA DISP 27GX1/2" (100/BX) EXLINTMcKesson408877
Nunc Cultivo Celular/Placas de PetriTermo-Científica174926
Microscopio de contraste de fase invertido Olympus CKX41OlimpoCKX41-B
PBS, pH 7,4Gibco10010023
Penicilina' Estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122
RPMI 1640Gibco11875093
RPMI 1640, sin glucosaGibco11879020
Piruvato de sodio (100 mM)Gibco11360070
Piruvato de sodio (100 mM de stock)Gibco11360070
Sorval ST 16RTermo-Científica75004381
Aguja de jeringuilla 304 de acero inoxidableMilipore SigmaZ117013-1EA
MANTO QUIRÚRGICO, DESECHABLE, 36 IN X 100 YDCovetrus10408
Tijeras quirúrgicas - ToughCutHerramientas Científicas Fines14054-13
Pinzas de apósitar para pulgar de 4,5" con delicado ancho de punta de 1,3 mmRobozRS-8120
Tubo de centrífuga Thermo Scientific Nunc 200mLTermo-Científica14-962-17
Adaptadores y cojines para botellas de centrífuga Thermo Scientific NuncTermo-Científica12-565-283B
TSDUB15 Baño de agua sacudido 15L DubnoffFisher Scientific300610298
TX-400 4 x 400 mL Rotor de cubeta oscilanteTermo-Científica75003181
Tygon S-50-HLTygonAAXoooo3
Kit ELISA de insulina ultrasensible para ratasQuímica de Cristal90060

Referencias

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