Medición de la instalación de salida y cumplimiento ocular en ojos de ratón ex vivo usando un sistema de bomba de jeringuilla

Resumen

La integración de enfoques analíticos de métodos de perfusión controlados por presión ya consolidados optimizó un sistema sencillo y de bajo coste con bomba de jeringuilla para evaluar la instalación de salida y la adherencia ocular en ojos de ratón.

Resumen

Mantener la presión intraocular (PIO) a un nivel adecuado y estable es esencial para la salud ocular. Las propiedades biomecánicas de la malla trabecular (TM), el conducto de Schlemm (SC) y toda la concha corneoscleral desempeñan un papel crucial en la homeostasis de la PIO. La instalación de salida (C) es un parámetro clave para evaluar la efectividad de la TM y la SC en el drenaje del humor acuoso, mientras que la adherencia ocular (φ) refleja la elasticidad de la concha corneoscleral y el flujo transitorio a través de la TM y la SC. Anteriormente, se desarrolló un sistema sencillo y rentable de bomba de jeringuilla para evaluar la C. Sin embargo, el uso de regresión lineal simple para el análisis de datos in vivo presenta limitaciones para caracterizar la MT y la función SC. En este estudio, el sistema de jeringuilla-bomba se optimizó aplicando enfoques analíticos desarrollados para sistemas de perfusión ocular controlados por presión ya establecidos. Los valores de C y φ medidos en ojos ex vivo se compararon con valores publicados previamente en sistemas de perfusión y fueron consistentes con esos rangos reportados. En resumen, este sistema sencillo y de bajo coste con bomba de jeringuilla facilita la evaluación de las propiedades biomecánicas de la TM y la SC.

Introducción

Mantener un nivel adecuado y estable de presión intraocular (PIO) es esencial para la salud^{ocular 1}. La elevación sostenida de la PIO es el factor de riesgo principal para el^{glaucoma 2,3}. Las fluctuaciones prolongadas de la PIO a lo largo de meses o años también contribuyen a la pérdida de^{visión 4,5}. Estudios recientes identificaron otra forma de fluctuación de la PIO, fluctuaciones transitorias causadas por actividades diarias, que también pueden acelerar la progresión del^{glaucoma 6,7}. Por ejemplo, un hombre de 46 años con 20 años de frotamiento en los párpados y un hombre de 52 que se había frotado los ojos durante 10 años mostraron daño acelerado en el disco^{óptico 8,9}. Estos hallazgos destacan la importancia de responder oportunamente y adecuadamente a los cambios en la PIO para minimizar el riesgo de pérdida visual.

La PIO está regulada por el equilibrio entre la producción de humor acuoso (AH) y su^{drenaje 10}. La AH sale principalmente del ojo a través de las vías convencional y^{uveoscleral 11}. Tanto en ojos normales como glaucomatos, la vía convencional que comprende la malla trabecular (TM) y el canal de Schlemm (SC) es la principal fuente de resistencia al flujo que influye en la homeostasis de la^PIO 12,13,14. Por lo tanto, las propiedades biomecánicas de la MT y la SC son esenciales para que el ojo se adapte a los cambios en la^PIO 15,16,17.

Los avances tecnológicos recientes han facilitado una evaluación más precisa del flujo de AH. Se han desarrollado enfoques invasivos, como la perfusión basada en gravedad y el sistema de jeringuilla-bomba, para calcular la instalación de salida (C), que indica cómo la TM y la SC regulan la salida en estado^{estacionario 18,19,20,21,22,23,24}. Métodos no invasivos, como la tonografía²⁵ y la fluorofotometría²⁶, se han utilizado clínicamente para determinar la C en pacientes con glaucoma. Sin embargo, la mayoría de los enfoques no pueden evaluar específicamente la función de la MT y la SC. Por ejemplo, en el sistema de bomba de jeringuilla, los datos de caudal y presión en estado estacionario se ajustan mediante regresión lineal simple, y la pendiente se interpreta como un C dependiente de la presión. Sin embargo, este C calculado en ratones vivos no puede reflejar con precisión la capacidad de salida de AH a través de la vía convencional porque se ve afectado por la secreción de AH, la salida uveoscleral y la presión venosa episcleral, tal como se describe en la ecuación de Goldmann.

Para abordar esta limitación, Millar et al. calcularon la entrada de AH, la salida convencional y la salida uveoscleral en el mismo ojo del ratón mediante múltiples mediciones de flujo constante basadas en la suposición de ausencia de entrada de AH, ausencia de presión venosa episcleral y salida uveoscleral sin cambios tras la^{eutanasia 22}. En 2016, Sherwood et al. informaron que el flujo uveoscleral es 0 en los ojos ex vivo a 0 mmHg, y luego abordaron la misma cuestión introduciendo un modelo de ley de potencia usando iPerfusión (un sistema de perfusión controlado por presión que en adelante se denominará sistema de perfusión⁾²⁷. Los avances metodológicos han aclarado los roles distintos de la MT y la SC, mejorando la comprensión de sus funciones fisiológicas para mantener la salida de la AH en estado estacionario.

Además, la respuesta transitoria de la TM y la SC a las fluctuaciones de la PIO es esencial para mantener la homeostasis de la PIO. Para seguir este movimiento, Xin et al. desarrollaron la tomografía de coherencia óptica sensible a la fase (OCT), que permite la observación en una escala temporal de^{segundos de 28}. La microscopía electrónica tridimensional de barrido en bloques en serie puede examinar este movimiento a un nivel^{ultraestructural 29}. Sin embargo, los métodos basados en imágenes solo estiman las propiedades biomecánicas de la MT y la SC y no proporcionan valores reales del drenaje transitorio de la AH. En 2019, tras desarrollar la iPerfusión, Sherwood et al. calcularon la adherencia ocular (φ) como un indicador clave tanto de la elasticidad corneoscleral como de la respuesta transitoria de TM y SC³⁰. Este avance proporciona un parámetro cuantitativo para evaluar los comportamientos transitorios de la MT y la SC en respuesta a las fluctuaciones de la IOP.

Basándose en estos avances en la evaluación de la función de TM y SC, este estudio mejoró el sistema de bomba de jeringuilla incorporando el modelo de ley de potencia para el cálculo de C e integrando nuevas metodologías para calcular φ. Estas mediciones se compararon con datos publicados obtenidos utilizando el sistema de perfusión para evaluar si el sistema optimizado de bomba de jeringuilla es adecuado para evaluar la instalación de salida y la adherencia ocular en ojos de ratón ex vivo .

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Declaración ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftalmológica y Visual y las directrices de cuidado y uso de animales de laboratorio del Centro Médico de la Universidad de Qingdao (QDU-AEC-2022069).

1. Selección y manejo de animales

1. Utiliza ratones de 5 meses con un 50% de C57BL/6 y 50% de BALB/c. No consideres el sexo en el diseño experimental.
2. Mantén a los ratones bajo un ciclo claro y oscuro de 12 h/12 h a 23 ± 2 °C y una humedad de 50 ± 5%.

2. Medición de la PIO

1. Anestesiar ratones usando isoflurano al 2,5% con 80% (vol/vol) de oxígeno en una cámara sellada durante 3,5 minutos.
   PRECAUCIÓN: El isoflurano es un anestésico volátil. Realizar anestesia en un lugar bien ventilado o en un sistema de contención adecuado.
2. Transfiere ratones a una plataforma operativa. Mantén la anestesia con mascarilla durante 30 segundos adicionales.
3. Realiza todas las mediciones entre las 9:00 y las 12:00. Toma tres mediciones por ojo. Calcula el valor medio de cada dato de cada dato.

3. Configuración del sistema (Figura 1)

1. Conecta una jeringuilla de 100 μL a una bomba de jeringuilla.
2. Conecta la jeringuilla a un sensor de presión de flujo directo.
3. Conecta el sensor a un sistema de adquisición de datos.
   NOTA: Asegúrate de que el sensor de presión y el soporte para ojos estén alineados a la misma altura para evitar artefactos de presión.
4. Llena el sistema con 1× suero salino tamponado con fosfato (PBS). Elimina todas las burbujas de aire.
5. Colocar el ojo en un soporte con un hueco circular (4–6 mm de diámetro). Asegúrate de que el ojo esté estable durante la canulación. Coloca el sensor de presión y el soporte para el ojo a la misma altura.
   NOTA: La desalineación puede introducir errores en la medición de presión. El archivo de diseño STL para el soporte de ojos personalizado se proporciona como Archivo Suplementario 1.

4. Funcionamiento por software

1. Calibración del sensor de presión
   1. Abre el software de adquisición de datos. Carga el archivo de configuración de calibración. Selecciona la función de calibración .
   2. Conecta el sistema a un depósito de agua a dos alturas definidas.
   3. Presiones medidas y reales de entrada usando la conversión:
      1 cm H₂O = 0,735 mmHg
2. Configuración de bombas
   1. Abre la configuración del módulo. Carga el archivo de configuración del regulador.
   2. Selecciona el dispositivo de bomba. Introduce el caudal máximo y el diámetro de la jeringuilla.
3. Registro de datos
   1. Empieza a grabar.
   2. Deja de grabar después de cada paso de presión.
   3. Introduce el siguiente valor de presión.
   4. Reiniciar la grabación.

5. Preparación de agujas

1. Saca una micropipeta de cristal según un protocolo^{establecido 8}.
2. Muele la punta a un diámetro interior de 80–100 μm. Pule la punta de la aguja.
   PRECAUCIÓN: Manipula las agujas de cristal con cuidado para evitar lesiones.
3. Monta la aguja en un micromanipulador. Conecta la aguja al transductor de presión.
4. Llena la aguja con PBS.
5. Coloca la punta de la aguja a la misma altura que el sensor de presión.
6. Medición de resistencia
   1. Aplica una presión de 1 mmHg. Registra el caudal.
   2. Calcular la resistencia de la aguja:
      
   3. Utiliza agujas con resistencia entre 0,01 y 0,5 mmHg/(μL/min).

6. Facilidad del sistema y cumplimiento normativo

1. Medición de instalaciones
   1. Perfundir el sistema con PBS. Sella el sistema usando una válvula de tres vías.
   2. Aplica pasos de presión de 6, 8, 10, 12, 14 y 16 mmHg.
   3. Graba P y Q durante 10 minutos en cada paso. Calcula valores medios de los últimos 5 minutos.
   4. Realiza regresión lineal. Interpreta la pendiente como una instalación del sistema.
2. Validación
   1. Repite las mediciones 3 veces.
   2. Confirma que la instalación del sistema es inferior a 0,2 nL/min/mmHg.
3. Medición de cumplimiento
   1. Introduce un tubo de silicona de 35 cm en el sistema.
   2. Mide la adherencia con y sin tubos de Teflón.
   3. Calcular el cambio de volumen usando un método de volumen^{discreto 14}.
   4. Determinar el cumplimiento del sistema como 4 nL/mmHg.
4. Comprobación de sensibilidad
   1. Confirma que la conformidad detectable del sistema es mayor a 9,9 nL/mmHg.

7. Enucleación

1. Eutanasia ratones usando CO₂ a un caudal de 0,7 L/min durante 3 minutos.
   PRECAUCIÓN: La eutanasia de CO₂ debe seguir las directrices institucionales para garantizar objetivos humanos.
2. Disecciona los músculos extraoculares y los nervios ópticos usando instrumentos estériles. Enuclea los globos oculares.
3. Inmediatamente coloca un ojo en el soporte a 35,5 °C.
4. Guarda el ojo contralateral a 4 °C.
5. Mide ambos ojos usando el mismo sistema.

8. Canulación

1. Inserción de aguja
   1. Introduce la aguja a través de la córnea central en un ángulo de 45°.
   2. Avanzar la aguja a una profundidad de 0,3–0,5 mm hacia la cámara anterior.
2. Validación
   1. Estabiliza el sistema. Confirma la fluctuación de presión ≤ 0,4 mmHg en los últimos 5 minutos.

9. _Cr ocular

1. Estabiliza el ojo a 8 mmHg durante 30 minutos.
2. Aplica pasos de presión de 6, 8, 10, 12, 14 y 16 mmHg.
3. Aplica un paso final a 8 mmHg.
4. Recogida de datos
   1. Ajusta el caudal máximo a 4 μL/min.
   2. Graba P y Q durante 10 minutos en cada paso.
5. Análisis
   1. Grafica las curvas P–T y Q–T. Calcula valores medios de los últimos 5 minutos.
   2. Datos de ajuste al modelo de ley^{de potencias 27}:
      
6. Define C_r (tras restar la facilidad del sistema) como la instalación de salida ocular.
7. Establece _{P r} = 8 mmHg.
8. Defina β como el coeficiente no lineal.

10. Ocular Φ_r

1. Analizar las curvas P–T y Q–T durante los incrementos de presión. Identificar el aumento del flujo hasta Q_max y la desaceleración posterior.
2. Calcula el cambio de volumen entre t_p y t_max usando el método de volumen^{discreto 30}.
3. Datos de ajuste a la ecuación modificada de Friedenwald³⁰:
   
4. Conjunto _{P r} = 13 mmHg. Define Φ_r (tras restar el cumplimiento del sistema) como el cumplimiento ocular Φ_r, _{el ojo} y γ como un parámetro material.

Resultados

El rendimiento del sistema optimizado de jeringuilla-bomba se evaluó comparando C y φ en ratones de 5 meses con valores previamente publicados en estudios de perfusión ocular controlada por presión. La normalidad de los conjuntos de datos en la Figura 2F se evaluó utilizando la prueba de Shapiro–Wilk, y se realizaron comparaciones estadísticas mediante una prueba t de Student emparejada de dos colas.

Como se muestra en

Discusión

Este estudio presenta un sistema optimizado de jeringuilla-bomba para estimar la capacidad de salida y la adherencia ocular en ojos de ratón, proporcionando valores consistentes con los reportados mediante sistemas de perfusión ocular controlados por presión. El enfoque actual mejora la precisión de las mediciones basadas en jeringuillas, manteniendo al mismo tiempo un montaje experimental sencillo y accesible. Esta combinación de refinamiento metodológico y accesibilidad puede facilitar...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo	1 y veces; PBS Buffer	Thermo Fisher Scientific	10010023
Isoflurano	Shenzhen Rewoode Life Sciences Co., Ltd., China	R640
Material	100 & mu; Jeringuilla de alta precisión L	Hamilton	1710
Vidrio borosilicato	Sutter, Novato, CA	BF100-50-10
Jeringuilla estéril desechable	Fenglin Medical Devices Co., Ltd. Jiangxi, China	10 ml
Sensor de presión	IcuMedical	PX26-015G
Tubo de silicona	Runze Fluid Co., Ltd, Nankín, China y Runze Fluid Co.,	N/A
Tubo transparente de PTFE	Runze Fluid Co., Ltd, Nankín, China y Runze Fluid Co.,	N/A
Equipamiento	Extractor de pipetas llameantes/marrón	Sutter, Novato, CA	P-97
Micromanipulador manual	Instrumentos de Precisión Mundial (WPI)	M3301
Baño metálico	Biología de Castores, Suzhou, China	2016C
MicroForge	Laboratorio de Instrumentos Científicos Narishige, Tokio, Japón	MF830
Molinillo de micropipetas	MPInstrument Co., Ltd., Wuhan, China	KDG-02
Microscopio binocular estéreo zoom PZMIII	Instrumentos de Precisión Mundial (WPI)	PZMIII
Bomba de jeringuilla	Instrumentos de Precisión Mundial (WPI)	AL-1000