Artículo de método

Disección a pequeña escala y tinción por anticuerpos de discos imaginales de antenas oculares y de alas de Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/70434

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15 de mayo de 2026

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1Department of Developmental and Cell Biology, Charlie Dunlop School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

En este artículo

Resumen

Este artículo describe un protocolo eficiente de disección imaginaria de discos y tinción de anticuerpos que es económico con los reactivos y facilita el manejo de discos imaginarios en pequeñas cantidades.

Resumen

Los discos imaginales de Drosophila han sido estudiados durante mucho tiempo como modelos de desarrollo, patrón y regeneración epitelial. El marcaje de anticuerpos y la imagen de discos imaginarios diseccionados son importantes para visualizar patrones de expresión proteica como marcadores de procesos de desarrollo y fisiología. Este método de disección y marcado de discos imaginarios fue desarrollado originalmente para la microscopía electrónica inmune de discos imaginarios ojo-antena por Tomlinson y Ready. Utilizando placas de 60 micropozos, y transfiriendo tejidos entre soluciones en lugar de transferir soluciones, es posible una atención individualizada a las muestras de tejido con muy poco desperdicio. Incluso los discos imaginarios individuales pueden ser procesados. El método requiere solo pequeños volúmenes de anticuerpos y otros reactivos. Como ejemplo de la aplicación del método a otros tejidos pequeños, el artículo también demuestra cómo los discos imaginales de alas pueden ser diseccionados y etiquetados con el mismo método. Un enfoque similar puede aplicarse a cualquier tejido pequeño de dimensiones similares, así como a otros procedimientos histoquímicos y de marcado además de la tinción por anticuerpos.

Introducción

Los discos imaginales de Drosophila son tejidos progenitores que se apartan durante la embriogénesis y crecen dentro de la larva sin diferenciarse, contribuyendo a las estructuras epidérmicas adultas durante la fasepupal 1. Su estudio ha proporcionado muchas ideas sobre los mecanismos de patrones del desarrollo, siendo los discos imaginarios del ojo y las alas especialmente estudiados 2,3,4,5,6. La inmunohistoquímica es especialmente útil para investigar patrones espaciales y temporales de expresión génica en discos imaginarios, así como para caracterizar comportamientos celulares, incluyendo la división y la muerte celular.

Para facilitar las demandas adicionales del análisis microscópico electrónico de discos imaginarios oculares marcados por anticuerpos, Tomlinson y Ready desarrollaron un protocolo a pequeña escala que es especialmente económico con los reactivos y proporciona un grado muy alto de fiabilidad ypersonalización 7. Su método se describe en formato impreso, pero no hay vídeodisponible 3,8,9. El método se modifica fácilmente para el marcado de otros discos imaginarios (u otros tejidos) y puede aplicarse a discos imaginales de alas además de discos imaginarios ojo-antena.

El marcaje de anticuerpos de los discos imaginarios de Drosophila sigue el contorno general aplicable a cualquier tejido10 (Figura 1). El tejido debe ser diseccionado y fijado antes de la incubación con anticuerpos específicos para proteínas de interés. Tras lavar el anticuerpo no unido, se añade un anticuerpo secundario marcado (a menudo fluorescente), que se une al anticuerpo primario, que a su vez está unido a la proteína de interés en el tejido fijado. Tras lavarse para eliminar el anticuerpo secundario no unido, se puede montar el tejido para un examen microscópico y visualizarse las proteínas de interés. Existen muchas descripciones generales de este proceso que pueden aplicarse a discos imaginarios y otros tejidos de Drosophila 11. Aquí se proporciona un protocolo para el método Tomlinson & Ready, en el que las muestras de tejido se transfieren individualmente entre pequeños pozos de incubación en una placa de micropozo y son observadas por un microscopio estereoscópico en cada paso (Figura 2). Este enfoque funciona mejor para teñir un número menor de tejidos a la vez (decenas de muestras) y no es ideal para lotes grandes (es decir, cientos). Este enfoque requiere solo pequeños volúmenes disolutivos de 13 μL en cada pozo y, por tanto, puede realizarse con muy pocos anticuerpos. Debido a que la pérdida de tejido es mínima, no existe un tamaño mínimo de muestra, e incluso discos imaginarios individuales pueden procesarse de forma fiable.

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Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Fabricación de la herramienta de transferencia

  1. Usa unas pinzas para cortar ~2,5 cm de alambre de tungsteno de 0,005" de diámetro. Utiliza pinzas para formar un extremo del alambre en forma de gancho o lazo (Figura 3). Introduce el otro extremo en un portaagujas. Esto se usará para transferir los discos con poca o ninguna transferencia líquida. El lazo puede ser el más fácil de usar, pero el gancho transfiere menos líquido entre soluciones.

2. Diseccionar y fijar discos imaginarios ojo-antenas

  1. Enjuaga las larvas con ~7,5 mL de 0,1 M fosfato de fosfato de sodio (pH7,2) en una placa de Petri (60 mm de diámetro) para eliminar cualquier medio de mosca u otros residuos. Véase el paso 6 para la disección de discos imaginales de alas en lugar de discos antenales oculares. Ambos discos imaginarios se encuentran en la parte anterior del cuerpo (Figura 4).
    NOTA: El PBS también puede usarse en lugar del tampón de fosfato en los pasos 2.1–2.3.
  2. Transfiere las larvas a una placa de Petri que contenga un tampón fresco.
    NOTA: Algunos obreros prefieren diseccionar larvas individuales en gotas tampón individuales en una placa de Petri de 60 mm; otros usan diapositivas de pozo para depresión.
  3. Mientras observas con un microscopio de disección, sujeta las larvas ~50% del cuerpo usando pinzas. Usa un segundo par de pinzas finas para agarrar los ganchos bucales y tirar. Los discos antenales del ojo saldrán unidos a las partes bucales. El cerebro también puede permanecer unido a los discos oculares.
  4. Utiliza la herramienta de alambre para transferir el tejido diseccionado a una pequeña placa de Petri (35 mm de diámetro) que contiene ~3 mL de fijador, por ejemplo, 3,7% de formaldehído en un tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH7,2), producido diluyendo una solución de fondo de formaldehído al 37% en el tampón.
    NOTA: Sigue los procedimientos de seguridad aprobados localmente para manipular formaldehído. El formaldehído al 3,7% es un fijador sencillo que será satisfactorio en muchos casos, pero otros fijadores pueden ser óptimos para ciertos antígenos. PBS o PEM (0,1 M PIPES pH 7,0, 2 mMMgSO 4, 1 mM EGTA) pueden usarse como tampón fijador en lugar de 0,1 M fosfato de sodio, o se puede obtener una solución de formaldehído disolviendo paraformaldehído sólido, en lugar de una solución concentrada de stock. El fijador paraformaldehído-lisina-periodato (PLP) combina una fijación más suave de proteínas con la entrecruzamiento de carbohidratos y preserva mejor las estructuras demembrana 12. La glicoproteína escabrosa de Drosophila, por ejemplo, permanecerá antigénica tras la fijación de PLP, pero no después de la fijación con formaldehído. Preparar el PLP fresco de la siguiente manera: (1) Añadir 2 g de polvo de paraformaldehído a 25 mL de agua desionizada en un matraz cónico en una campana extractora y remover a baja temperatura; (2) Sumerge una pipeta en una solución de hidróxido de sodio al 50% y transfiere una traza del líquido (mucho menos de una gota) a la mezcla. El paraformaldehído debería disolverse en pocos minutos sin que la solución llegue a hervir. Mientras se enfría la solución de formaldehído al 8%, disuelva 0,36 g de lisina en 10 mL de agua desionizada, 7,5 mL de fosfato sódico 0,1 M pH 7,2, 2,5 mL 0,1 M Na2HPO 4 y mantenlo en hielo. Mezcla 15 mL de esta solución de lisina tamponada en frío con 5 mL de formaldehído fresco al 8% y 50 mg de periodato de sodio en un tubo de tapa roscada de 50 mL, mezcla por vortexing y úsalo cuando esté fresco.
  5. Tras 15–20 minutos a temperatura ambiente, transfiere el tejido diseccionado a otra placa de Petri que contenga 0,1 M de fosfato de fosfato de sodio (pH 7,2).
    NOTA: También se puede usar PBS en lugar del tampón de fosfato. La fijación sobre hielo puede ser preferible para algunos antígenos, o cuando se desea obtener imágenes de la fluorescencia endógena de GFP o RFP expresada en el tejido. La fijación del PLP siempre es durante 45 minutos sobre hielo.

3. Bloqueo e incubación con anticuerpos primarios

  1. Transfiere tejido a una placa de Petri de 35 mm que contiene ~3 mL de gel de gel anticorporal NSG para bloquear. Incuba la placa de Petri sobre hielo durante al menos 15 minutos. La NSG contiene 0,1 M de fosfato sódico (pH 7,2), 0,1% saponina y 5% Suero normal de cabra. Las culatas de lavado se almacenan esterilizadas con filtro a 4 °C.
    NOTA: Diferentes buffers de lavado pueden ser óptimos para ciertos anticuerpos. Por ejemplo, mientras que la saponina es un detergente suave y no iónico que solubiliza especialmente la membrana plasmática, otros detergentes pueden ser preferibles para detectar antígenos dentro del núcleo. Como ejemplo adicional, el anticuerpo desarrollado contra la proteína nuclear atonal por Jarman et al.13 es el más inmunorreactivo en tampones que contienen NP40 como detergente. Consulta la Tabla de Materiales para recetas de los buffers de lavado alternativos: PDT, PBT o NSG. Cuando se utiliza suero normal como proteína bloqueadora, idealmente debería proceder de la especie en la que se produce el anticuerpo secundario, por ejemplo, suero normal de cabra si se van a usar anticuerpos secundarios de cabra, o suero normal de burro si se van a usar anticuerpos secundarios de burro. En la práctica, esto apenas cambia.
  2. Elimina cualquier tejido no deseado de los discos imaginarios ojo y antena durante el bloqueo usando pinzas finas, excepto los ganchos bucales. Deja las piezas bucales unidas por ahora para facilitar las transferencias.
    NOTA: El tejido externo, por ejemplo, el cerebro, también puede dejarse hasta que se monta la lámina (paso 5.4), siempre que no interfiera con la tinción o la visibilidad.
  3. Durante el bloqueo, preparar una dilución 1:100 de solución de anticuerpos mAb40-1a en NSG, por ejemplo, 1 μL de anticuerpo en 100 μL de NSG. Mezcla pipeteando, no con vórtice.
    NOTA: mAb40-1a es un anticuerpo monoclonal que se eleva contra la beta-galactosidasa. La dilución óptima de anticuerpos y el buffer de lavado variarán según los anticuerpos concretos utilizados.
  4. Añadir 13 μL de soluciones de anticuerpos a cada uno de hasta seis pozos en la primera columna de una minibandeja de micropozos de 60 pozos. Los micropozos cónicos con lados rectos son importantes para la claridad óptica. Si se necesitan más de seis pozos, comienza con una segunda minibandeja.
  5. Transfiere discos imaginarios ojo-antena, preferiblemente aún unidos a las piezas bucales, a la solución primaria de anticuerpos uno a uno usando el lazo o gancho.
    NOTA: El número de discos imaginarios que se pueden añadir a cada pozo depende del anticuerpo. Demasiado tejido puede agotar algunos anticuerpos hasta el punto de que el marcaje disminuye. Cinco pares por pozo suelen ser satisfactorios. Así, se pueden etiquetar fácilmente ~60 discos usando las 6 filas de placas microtituladas de 60 pozos. Se pueden usar diferentes anticuerpos para cada una de las filas. Si las soluciones de anticuerpos pueden reutilizarse requiere pruebas empíricas para cada caso; No es rutina en nuestro laboratorio.
  6. Cierra la placa con la tapa y sella con parafilm para limitar la evaporación. Incubar en hielo o a 4 °C durante 4 horas hasta toda la noche. No es necesario mecerse.
    NOTA: El momento y la temperatura óptimos de incubación del anticuerpo dependen del propio anticuerpo. En muchos casos, 1–2 horas a temperatura ambiente serán suficientes, pero algunos anticuerpos mejorarán los resultados tras la incubación a 4 °C, y a menudo puede ser conveniente incubar a 4 °C durante la noche. En muy pocos casos, las incubaciones primarias de anticuerpos de 2–3 días pueden ser óptimas. Sellar la tapa del micropozo solo es necesario para incubaciones de más de ~4 horas.

4. Lavado e incubación con anticuerpos secundarios

  1. Añade 13 μL de tampón NSG a las siguientes tres columnas de pozos tras cada pozo de anticuerpos, ya que las muestras se lavarán tres veces. Transfiere las muestras para lavarlas durante 5 minutos en cada pozo de forma consecutiva.
  2. Durante el lavado, prepare una dilución 1:200–400 de anticuerpos secundarios conjugados fluorescentemente en un tampón NSG, por ejemplo, 0,5 μL de anticuerpos en 100 μL de NSG. Mezcla pipeteando, no con vórtice. Centrifuga la solución secundaria de anticuerpos durante 60 s (a velocidad máxima) antes de diluirla, ya que los agregados de anticuerpos pueden unirse de forma inespecífica a la superficie del tejido.
    NOTA: La dilución óptima de anticuerpos secundarios puede variar según el fabricante. Se pueden encontrar anticuerpos conjugados con Alexa o cianina restados para otras especies para facilitar el marcaje múltiple.
  3. Añadir 13 μL de la solución secundaria de anticuerpos a la siguiente (quinta) columna de pozos.
  4. Transfiere muestras al anticuerpo secundario usando el lazo o un gancho.
  5. Cierra la placa con la tapa y sella con parafilm para limitar la evaporación. Incuba en hielo durante 4 horas durante la noche.
    NOTA: El momento y la temperatura óptimos de incubación del anticuerpo dependen del propio anticuerpo. En muchos casos, 1–2 horas a temperatura ambiente serán suficientes, pero algunos anticuerpos mejorarán los resultados tras la incubación a 4 °C, y a menudo puede ser conveniente incubar a 4 °C durante la noche. Sellar la tapa del micropozo solo es necesario para incubaciones de más de ~4 horas.

5. Lavado y montaje de tejido para microscopía

  1. Prepara las siguientes tres columnas de pozos tras el pozo secundario de anticuerpos con 13 μL de NSG. Transfiere las muestras por cada pozo durante 5 minutos.
  2. Transfiere las muestras a un lavado final enel pozo 9 utilizando 13 μL de tampón fosfato de sodio 0,1M (pH 7,2). Este lavado de tampón es necesario cuando los tampones de lavado contienen componentes que precipitan en el medio de montaje.
  3. . Añade 13 μL de medio de montaje a la columna final (décima ésta) de pozos. El medio de montaje se produce disolviendo 2% de n-propilo galato en un 75% de glicerol y un tampón de fosfato sódico 0,1 M, pH 7,2. Prepara un medio de montaje fresco cada semana mezclando los componentes sobre una plataforma giratoria. Deja que las burbujas de aire se disipen antes de usarlas.
    NOTA: Los soportes de montaje también están disponibles comercialmente.
  4. Pipeta 20 μL de medio de montaje sobre una lámina limpia de microscopio. Transfiere muestras al medio de la lámina. Esta es una última oportunidad para eliminar tejido no deseado. Las piezas bucales cuticulares deben ser retiradas de los discos antenales oculares.
  5. Para disponer las muestras de modo que no se desvíen cuando se sobreponga el cristal de la cubierta, utiliza la herramienta de alambre para arrastrar las muestras fuera de la gota principal del montador. Baja suavemente un vidrio de cubierta limpio de 22 mm x 40 mm de grosor #1,5 sobre la corredera usando pinzas, sin introducir burbujas de aire.
  6. Deja reposar las correderas durante 1 hora en un portadeslizantes de cartón para que el soporte de montaje se asiente. Evita mover las láminas, ya que las muestras frágiles pueden dañarse si el cristal de la cubierta se mueve.
  7. Una vez que el vidrio de la cubierta se haya asentado, sella los bordes con esmalte de uñas. No muevas ni presiones el cristal de la cubierta mientras haces esto. Deja que el esmalte de uñas se seque al menos 1 hora antes de hacer la imagen.
    NOTA: Desafortunadamente, la mayoría de los esmaltes cosméticos ahora usan disolventes que no se distribuyen de forma uniforme en las láminas de vidrio y no son útiles, por lo que hay que conseguir esmalte científico.
  8. Guarda las láminas a 4 °C. Normalmente, las muestras pueden ser visualizadas y reimaginadas durante meses.
    NOTA: Las láminas también pueden almacenarse a -20 °C.

6. Disección y fijación de discos imaginarios de alas

  1. Para diseccionar discos imaginales de ala en lugar de discos imaginarios ojo-antena, sigue los pasos siguientes en lugar de los pasos 2.3–2.5 anteriores.
  2. Bajo un microscopio disecante, sujeta las piezas bucales larvales con pinzas finas. Con tijeras de microdisección, divide las larvas entre un 30% y un 40% desde la parte anterior.
  3. Invierte la porción anterior de la larva extendiendo el extremo abierto y cortado de las larvas usando un segundo par de pinzas y empujando la cabeza y las piezas bucales a través de ella, similar a invertir un calcetín
  4. Utiliza pinzas para transferir las larvas anteriores invertidas a un fijador en una pequeña placa de Petri (35 mm de diámetro) que contiene ~2,5 mL de fijador, por ejemplo, un 3,7% de formaldehído en un tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,2), elaborado diluyendo una solución de reservas de formaldehído al 37% en PBS.
    NOTA: Si se desea, las canales invertidas pueden transferirse a 400 μL de fijador en un tubo de microfuga, lo que facilita la fijación en una campana extractora. Las mismas opciones de fijación disponibles para la fijación ocular-imaginaria del disco también se aplican a la fijación del disco alar (véase la NOTA en el paso 2.4). La fijación óptima y para el marcado de discos imaginarios ojo-antenas suele ser la misma para los discos de las alas.
  5. Tras 15–20 minutos a temperatura ambiente, transfiere el tejido diseccionado a otra placa de Petri que contenga 0,1 M de fosfato de fosfato de sodio (pH 7,2).
    NOTA: Las mismas opciones de buffer de lavado disponibles para la fijación del disco visual-ojo también se aplican a la fijación del disco alar (véase NOTA en el paso 2.4). El buffer de lavado óptimo para etiquetar discos imaginarios ojo-antena suele ser el mismo para discos de ala.
  6. Retira los discos alares de las larvas usando pinzas finas. Si aún están presentes, el disco haltere y el disco de la pierna más pequeños pueden retirarse ahora o permanecer unidos a los discos alares para facilitar las transferencias.
    NOTA: Los discos alares pueden no ser fácilmente visibles en la carcasa hasta que se retira el cuerpo graso u otro tejido (siempre identifica un tejido antes de retirarlo). Los discos alares son los discos imaginarios más grandes y están unidos a la pared del cuerpo, estrechamente asociados con la tráquea. Tienen forma de lágrima, como el contorno de Sudamérica1 (Figura 4).
  7. Continúa con los pasos 3–5 como se ha dicho antes.

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Resultados

El procedimiento Tomlinson and Ready produce regularmente excelentes resultados de tinción por anticuerpos. Aquí se ilustran discos imaginarios de ojos, antenas y alas etiquetados triplemente. En la Figura 5A, un disco imaginario antenal ocular de tercer estadio ha sido triple marcado para detectar el factor de transcripción Senseless (azul), el marcador progenitor neural Elav (rojo) y el marcaje anti-GFP de clones celulares que expresan ARN para el transcri...

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Discusión

La tinción por anticuerpos de tejidos de Drosophila utilizando placas cónicas de 60 pozos mediante el método Tomlinson and Ready da resultados excelentes y es muy fiable, ya que cada disco imaginario se sigue al microscopio de disección durante cada manipulación. El método requiere solo pequeñas cantidades de reactivos de anticuerpos y cambia las soluciones de forma más completa en cada paso, ya que las muestras se transfieren con muy poco líquido asociado. Es especialmente adec...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

NEB agradece a Andrew Tomlinson por compartir el método y a Lucy Firth por sus mejoras. Agradecemos a Abhishek Bhattacharya por contribuir con la Figura 5A. Agradecemos a Joyner Cruz, Jonathan Gonzalez, Chelsea Nguyen y Jensen Northrup. La investigación en el laboratorio de los autores se financia mediante subvenciones del NIH (GM120451 y CA284362). La Figura 2 y la Figura 4 fueron creadas con Biorender.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fosfato disódicoFisher7558-79-4Na2HPO4 - fosfato de fosfato de sodio anhidro. Se pueden usar otros estados de hidratación, pero cambian el peso molecular
Fórceps: Dumont #5 Pinza BiologieHerramientas científicas finas11252-20Estilo: #5
           Forma de la punta: recta
               Longitud: 11 cm
           Autoclave Safe: Sí
           Consejos: Biología
           Dimensiones de la punta:
         0,05 x 0,02 mm
           Aleación / Material: Inox
FormaldehídoFisherBP531-500Grado de biología molecular, 37% de formaldehído. 500ml
Fijador de formaldehídoFisherBP531-5003,7% formaldehído en 0,1M de tampón fosfato de sodio pH7,2 producido por dilución a partir del 37% de stock.
GlicerolBiorreactivos de FisherBP229-1
HieloPreferencia del usuario
L-Lisina, 98%TermocienciaJ62225.22
mAb40-1DHSB40-1a-sAnti-beta galactosidasa
Tubos microcentrífugasCientífico en EE. UU.1615-5520Tubos de 1,5 mL para almacenar muestras.
Tijeras de microdisecciónHerramientas Científicas Fines15003-08Filo de corte de 5mm, punta recta, 8,5cm
Fosfato monosódicoFisher7558-80-7NaH2PO4 - Fosfato de sodio monobásico anhidro. Si se usa una forma hidratada, el peso necesario para hacer una solución de 0,1M cambiaría.
Medio de montajeSolución de glicerol al 75% en un tampón fosfato de sodio 0,1M pH7,2 con 2,5% de n-propilo galato. Mezcla por inversión para minimizar burbujas.
NSG0,1M de fosfato de sodio tampón pH7,2, 0,1% saponina, 5% NGS
N-propilo galatoMP Biomedicina210274780
Esmalte de uñasTed Pella, comprado a FisherNC0381432Para correderos de sellado
PortaagujasFisherNC0099380Para microdisecar agujas. Acero inoxidable hueco; Longitud del mango: 4 3/4" de largo
Mini Bandejas Microwell NuncTermo Científica12565155MicroWell MiniTray para aplicaciones serológicas. Recuento de pozos: 60
ParafilmStatLabPM996StatLab ParaFilm M Película Flexible Autosellante
ParaformaldehídoPolysciences, Inc.00380-250
10 veces PBSPreferencia del usuarioPrepara 800 mL de agua destilada en un recipiente adecuado.
           Añade 1,37 m de cloruro de sodio a la solución.
             Añade 26,8 mM de cloruro de potasio a la solución.
             Añade 101 mM de dibásico fosfato de sodio a la solución.
         Añade 18,0 mM de Monobásico de Fosfato de Potasio a la solución.
         Ajustar la solución al pH deseado (normalmente pH y asínpice; 7,4).
           Añade agua destilada hasta que el volumen sea de 1 L.
PBTPreferencia del usuario0,1M tampón fosfato de sodio pH7,2, 0,1% albúmina sérica bovina y 0,2% Triton X-100.
PDTPreferencia del usuario0,1M tampón fosfato de sodio (pH = 7,2), 0,3% desoxicolato y 0,3% Triton x-100
Placa de PetriHalcónCorning 351007Placa de Petri; 60mm; no tratado
Placa de PetriHalcónCorning 351008Placa de Petri; 35mm; no tratado
AlicatesPreferencia del usuario
PLPN/D2% de paraformaldehído 1,35% lisina en un tampón fosfato de sodio 0,05M pH7,2
Anticuerpos secundariosJackson ImmunoResearch715-545-1510,5 mg de Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG.
Cubiertas para diapositivasVWR48393-172VWR Coverglass #1.5 22x40 (CAJA)
DiapositivasFisher125442Fisher Glass Slides 10bx/CS
Desoxicolato de sodioCiencias Termodinámicas de Fisher89904detergente desoxicolato de sodio; 5 mg
Periodato de sodioSigma Aldrich71859-25GPeriodato de sodio y ndash; 25 gramos
Buffer de fosfato de sodio0,1M del tampón NaPO4 pH 7,2. Mezcla 28 ml de 0,1 millones de fosfato monosódico anyhdrous (11,998 g de NaH2PO4 a 1L de agua destilada) con 72 ml de fosfato disódico anyhidro 0,1M (14,196 g de Na2HPO4 a 1L de agua destilada) para generar 100 ml de tampón de 0,1M NaPO4. Alternativamente, se puede utilizar PBS.
Alambre de tungstenoTed Pella27-11.005" Dia.
Triton x-100Ciencias Termodinámicas de FisherA16046AE
VórticePreferencia del usuario

Referencias

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