Artículo de investigación

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas de células mammiferas infectadas por el virus del dengue tipo 2

DOI:

10.3791/70437

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27 de marzo de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Medical Laboratory Science Program, Texas State University

En este artículo

Resumen

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Aquí describimos el aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas a partir de un sobrenadante de cultivo celular infectado con el virus del dengue tipo 2, seguido de la caracterización de la integridad y distribución del tamaño de las vesículas, y evaluación de la ausencia de virus infeccioso detectable mediante ensayo de placas bajo condiciones experimentales definidas.

Resumen

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Los EVs enriquecidos con exosomas son vesículas liberadas de varios tipos celulares en fluidos extracelulares como plasma, orina, saliva, medios de cultivo celular y otros fluidos corporales. Sus diámetros varían desde 30 nm hasta 150 nm. Han estado implicados en diferentes procesos celulares, incluyendo la comunicación celular y la modulación inmune durante la infección. Basándose en estos efectos, se han utilizado para estudiar la patogénesis de varios virus. Es complicado aislar los EVs enriquecidos con exosomas de supernadantes celulares infectados por virus utilizando las técnicas actuales de purificación. Esto se debe en gran parte a la superposición de tamaño entre ciertos virus y los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas. Aquí, nuestro objetivo es purificar los EVs enriquecidos con exosomas a partir de un supernadante de cultivo celular infectado por dengue tipo 2. Los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas se aislaron utilizando un kit comercial de aislamiento de exosomas. Para los VE enriquecidos con exosomas aislados en este protocolo, no se detectó ningún virus infeccioso mediante ensayo de placa bajo las condiciones analizadas. Los EVs purificados enriquecidos con exosomas se caracterizaron usando western blot para tetraspaninas, análisis de seguimiento de nanopartículas y microscopía electrónica de transmisión para confirmar el tamaño. Demostramos que nuestros EVs enriquecidos con exosomas están intactos y dentro del rango normal de diámetro de exosomas de 30-150 nm. En conjunto, nuestro protocolo proporciona un método económico para purificar EVs enriquecidos con exosomas a partir de sobrenadante de cultivo celular infectado por virus, que puede utilizarse en ensayos funcionales posteriores.

Introducción

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Los EV enriquecidos con exosomas son vesículas de tamaño nanodimensionado liberadas por cada célula del cuerpo. Son subtipos de vesículas extracelulares (EV) de origen endocítico. Los VE enriquecidos con exosomas se descubrieron por primera vez en medios de cultivo dereticulocitos 1. En las últimas décadas, los EVs enriquecidos con exosomas han sido purificados de varios fluidos corporales, incluyendo sangre, orina, saliva, leche materna, fluidos seminales y líquidos amnióticos 2,3,4,5. Tienen un diámetro que varía entre 30 nm y 150nm 6. Su liberación en el compartimento extracelular ocurre mediante la fusión de cuerpos multivesiculares (MVB) con la membrana plasmática celular. En el contexto de infecciones y respuesta inmune, se sabe que los EVs enriquecidos con exosomas provocan una respuesta específica en células de mamíferos. Estas respuestas incluyen la liberación de citocinas o alteraciones en la susceptibilidad ala infección 7,8,9.

El contenido de los EVs enriquecidos con exosomas está influenciado por varios factores, siendo el más importante el tipo y estado de la célula que losproduce 10,11. Además, su contenido también determina los efectos que tienen sobre las células receptoras ingenuas. Actualmente se utilizan varios métodos para aislar los EVs enriquecidos con exosomas a partir de fluidos biológicos. Los métodos comunes incluyen ultracentrifugación diferencial, precipitación, captura de inmunoafinidad, cromatografía por exclusión de tamaño, aislamiento basado en magnética y aislamiento basado en microfluídicos.

La ultracentrifugación diferencial se considera una de las técnicas más utilizadas12, 13 y 14. El método de purificación con ultracentrífuga es costoso y requiere una gran destreza técnica. Este método también provoca una pérdida significativa de vehículos eléctricos debido a múltiples pasos de ultracentrifugación. Finalmente, los EVs enriquecidos con exosomas resultantes no están libres de partículas virales activas debido a sus propiedades fenotípicas similares. Esto ha dificultado la purificación de EVs enriquecidos con exosomas a partir de supernadantes celulares infectados por virus. Por ello, es importante desarrollar un protocolo optimizado para reducir eficazmente los niveles del virus del dengue (DENV) a niveles indetectables en la solución EV enriquecida con exosomas, ya que los virus comparten tamaños y densidades similares a losexosomas 15,16.

En comparación con otras técnicas comúnmente utilizadas, este protocolo ofrece varias ventajas, incluyendo una reducción del tiempo de purificación, la dependencia de equipos de laboratorio económicos y ampliamente accesibles, y la capacidad de aislar vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas sin contaminación viral viva detectable. Además, aunque métodos como la centrifugación por gradiente de densidad y el aislamiento basado en el magnetismo pueden ofrecer ventajas, como un mayor rendimiento y mayor pureza, estos enfoques requieren un paso inicial de ultracentrifugación. El objetivo de este artículo es presentar un método para aislar los EVs enriquecidos con exosomas de supernadantes infectados sin virus infeccioso detectable mediante análisis de placa bajo las condiciones probadas.

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Protocolo

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1. Preparación de medios libres de exosomas

  1. Acopla un filtro de 0,1 μm a su base receptora dentro del gabinete de bioseguridad (BSC) de Clase II.
  2. Vierte asépticamente el suero fetal bovino inactivado por calor (FBS) sobre el filtro y conéctalo a la bomba de vacío dentro del BSC.
  3. Repite el paso 1.2 con el paso de flujo dos veces más.
  4. Prepara un medio completo para contener el 10% del FBS triple filtrado, 1% penicilina/estreptomicina y 1% L-glutamina.
    NOTA: El método de triple filtración se utiliza para evitar la necesidad de instrumentos como una ultracentrífuga.

2. Infección por el virus del dengue en células de mamíferos

  1. Cultivar células Vero durante la noche en un matraz de cultivo T75cm 2 dentro de una incubadora de cultivo tisular a 37 °C con un 5% deCO2.
  2. Al día siguiente, comprueba que la célula está entre el 70% y el 80% confluente e infecta las células con 0,1 multiplicidad de infección (MOI) de DENV-2 en 5 mL de medio completo e incuba a 37 °C con 5% deCO2 durante 2 horas.
  3. Después de 2 horas, retira el sobrenadante y lava el matraz 3 veces con solución salina con fosfato tamponado estéril (PBS).
  4. Añade 50 mL de medio completo al matraz e incuba a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 días (justo antes de observar los efectos citopáticos).

3. Purificación de exosomas en kit

  1. Transfiere el medio de cultivo celular del matraz a un tubo cónico de 50 mL y centrifuga a 200 × g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
  2. Transfiere el medio a un nuevo tubo cónico. Añade 125 μL de reactivo de precipitación EV, seguido de 600 μL de la resina. Haz un vórtice durante 10 s y déjalo reposar 10 minutos dentro del BSC a temperatura ambiente.
  3. Usar el vórtice durante otros 10 segundos y centrifugar aproximadamente a 450 × g durante 2 minutos a temperatura ambiente. Transfiere al BSC, descarta el sobrenadante y aplica 600 μL de buffer de resuspensión al perímetro.
  4. Haz el vórtice durante 10 s e incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos.
  5. Vórtice otros 10 segundos y centrifugación a aproximadamente 25 × g durante 2 minutos a temperatura ambiente.
  6. Transfiere el sobrenadante a una columna de filtros y centrifuga aproximadamente 4.500 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente. Recoge el flujo que contiene los EV enriquecidos con exosomas intactos y guárdalo a -80 °C hasta que esté listo para su uso.
  7. Confirma que el EV enriquecido con exosomas está libre de virus vivo realizando un ensayo de placa17.
  8. Caracterizar el EV enriquecido con exosomas usando microscopía electrónica para análisis de tamaño y seguimiento de nanopartículas para la distribución y concentraciónde tamaño 18.

4. Caracterización de la EV enriquecida con exosomas por western blot

  1. Determina la concentración de proteínas del EV enriquecido con exosomas mediante ensayos como el BCA.
  2. Mezcla volúmenes iguales de solución EV enriquecida con exosomas y buffer RIPA y añade 4x buffer de carga LDS (4:1).
  3. Separar las proteínas EV enriquecidas con exosomas usando un gel Bis-Tris al 4-12%.
  4. Transfiere las proteínas a una membrana de nitrocelulosa.
  5. Bloquea durante 1 hora usando leche desnatada al 5% disuelta en 1 TBS-Tween buffer a temperatura ambiente.
  6. Diluir los anticuerpos primarios usando leche seca desnatada al 5% hasta una dilución 1:1.1000 y sondear la membrana en busca de proteínas exosomas como CD63 y CD9 a 4 °C durante la noche.
  7. Retira el anticuerpo principal y lava 5 x 5 minutos con 1x TBS-Tween buffer en un balancín.
  8. Diluye el anticuerpo secundario (anti-Rabbit IgG HRP) con leche seca desnatada hasta una dilución 1:5.000 e incuba la membrana con esta solución durante 1 hora a temperatura ambiente.
  9. Retira el anticuerpo secundario y lava 5 x 5 minutos con 1x TBS-Tween buffer en un balancín.
  10. Desarrollar la membrana utilizando el reactivo de detección ECL y detectar señales proteicas usando el dispositivo de imagen quimioluminiscencia.

5. Caracterización de EVs enriquecidos con exosomas mediante microscopía electrónica de transmisión

  1. Añade 5 μL de muestras de exosomas a las rejillas de cobre de 200 mallas con formvar y recubrimiento de carbono, y déjalas secar al aire a temperatura ambiente.
  2. Tingue la rejilla con acetato de uranilo acuoso al 1% durante 60 s y seque al aire.
  3. Captura la imagen usando el TEM a 80 kV18.

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Resultados

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Analizamos el EV enriquecido con exosomas aislado según lo descrito en el protocolo mediante un ensayo de placa para determinar si podíamos detectar partículas activas de DENV-2 en la mezcla. Como se muestra en la Figura 1, no se detectaron placas bajo las condiciones analizadas en comparación con el control positivo. Estos resultados indican que el virus infeccioso estaba por debajo del umbral de detección del ensayo de plac...

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Discusión

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Los avances recientes en la investigación de enfermedades infecciosas han demostrado que los EVs enriquecidos con exosomas liberados de células ingenuas infectadas por virus desempeñan un papel fundamental en la modulación de la respuesta inmunitaria del huésped 7,8,9. Los EV enriquecidos con exosomas pueden potenciar la defensa inmunitaria promoviendo una respuesta antiviral adecuada o, por el ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

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Este estudio fue financiado por una subvención de investigación de la American Society for Clinical Laboratory Science (ASCLS) y por el fondo del Programa de Mejora de la Investigación (REP) de la Universidad Estatal de Texas

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo vinculado a IgG-HRP contra conejosSeñalización celular7074SAnticuerpo secundario
CD63Señalización celular52090SAnticuerpo primario
CD9Señalización celular13174SAnticuerpo primario
Kit de purificación de exosomas para medios de cultivo celularNorgen60600Kit de purificación de exosomas
Virus del dengue 2ATCCVR-1584Virus
DMEMFisher Scientific11-995-073Medios culturales
EMEMATCC30-2003Medios culturales
Microscopio electrónico de transmisión FEI Talos F200XThermofisher Scientific
Eerum bovino fetalNeurómicaFBS002Suplemento de medios
Analizador de seguimiento de nanopartículasParticle Metrix
Celdas VeroATCCCCL-81Línea celular de mamíferos

Referencias

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  1. Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation: Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262 (19), 9412-9420 (1987).
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