Artículo de método

Protocolo para la Disociación de Células Individuales, Secuenciación de ARN y Aislamiento de Células Mioepiteliales y Fibroblastos de las Glándulas Lagrimales y Salivales Envejecidas

DOI:

10.3791/70441

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24 de abril de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un método optimizado para disociar glándulas lagrimales de ratón envejecidas y obtener células individuales viables para la secuenciación de ARN unicelular. La digestión enzimática secuencial y el manejo suave preservan la integridad celular, produciendo suspensiones de alta calidad adecuadas para el aislamiento específico de cada tipo celular y el análisis transcriptómico de cambios asociados al envejecimiento en poblaciones de glándulas lacrimales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El envejecimiento de la glándula lacrimal (LG) se asocia con una reducción de la secreción lagrimalical y la inflamación crónica, contribuyendo a la enfermedad ocular seca. Los cambios relacionados con la edad en LG incluyen infiltración de células inmunitares, daño celular, acumulación de lípidos en células acinares, deposición de matriz extracelular y dilatación ductal. La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) proporciona un enfoque potente para perfilar la heterogeneidad celular y los cambios transcripcionales durante el envejecimiento; sin embargo, generar suspensiones viables de células unicelulares a partir de tejido LG envejecido es técnicamente complicado debido al aumento de fibrosis, fragilidad celular y acumulación de lípidos. Este estudio presenta un protocolo optimizado y reproducible para la disociación eficiente de LG envejecido en ratones y el aislamiento de múltiples tipos celulares, adecuado para análisis posteriores de scRNA-seq. Es importante destacar que este protocolo también es aplicable a glándulas lacrimales jóvenes, conjuntivas y otros tejidos exocrinos. El flujo de trabajo emplea una estrategia de disociación enzimática escalonada utilizando colagenasa IV, dispasa II y DNasa I para la digestión inicial del tejido, seguida de Accutasa para disociar los grupos celulares restantes y un tratamiento final con DNasa I para obtener una suspensión unicelular limpia. Para minimizar el daño celular, todo el material plástico se recubre previamente con PBS que contiene albúmina sérica bovina, y el procesamiento del tejido se realiza bajo condiciones controladas de temperatura y agitación. La lisis de glóbulos rojos y la filtración secuencial a través de varios coladores mejoran aún más la pureza celular. El aislamiento específico por tipo celular se logra usando líneas de ratones reporteros combinadas con la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Utilizando ratonesActa2 GFP y PdgfraEGFP, aislamos con éxito células mioepiteliales y fibroblastos, respectivamente, tras la inmunotinción con un anticuerpo EpCAM. FACS permitió la separación de la población mioepitelial EpCAM⁺/αSMA⁺, mientras que las células de EGFP⁺ de ratones PdgfraEGFPrepresentaban la población de fibroblastos. Este protocolo proporciona suspensiones unicelulares viables y de alta calidad de LGs envejecidos y puede adaptarse fácilmente a otros tejidos exócrinos fibróticos o envejecidos que requieren disociación suave y aislamiento celular dirigido.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La glándula lagrimal (LG) es una glándula tubuloacinar exocrina responsable de secretar la capa acuosa de la película lagrimal. A lo largo de la vida, la superficie corneal y la LG están expuestas a infecciones bacterianas y virales, que pueden provocar alteraciones sistémicas de las células epiteliales, inducción de respuestas inflamatorias crónicas, infiltración de células inmunitarias en la LG y falta de regeneración. El envejecimiento va acompañado de un aumento en la incidencia de enfermedades inflamatoriascrónicas 1. Entre ellas, la enfermedad del ojo seco (DED) es una de las diez causas más comunes de discapacidad visual en todo el mundo y es un factor importante en la disminución de la independencia, movilidad y funcionamiento diario en la poblaciónde ancianos 2. Una causa principal de DED es la disfunciónLG 3.

Con el avance de la edad, el LG del ratón y el humano sufren alteraciones estructurales y funcionales pronunciadas, incluyendo atrofia de células acinares, dilatación ductal, infiltración de células inmunitares, fibrosis y deposiciónlipídica 4,5,6,7. Estos cambios degenerativos también van acompañados de inflamación crónica del LG y fibrosis tisular 3,5,8,9. A pesar de la clara asociación entre el envejecimiento y la patología del LG, los mecanismos moleculares y celulares que impulsan estos cambios siguen siendo poco comprendidos.

La secuenciación de ARN unicelular permite un perfilado integral de poblaciones celulares y sus cambios transcripcionales duranteel envejecimiento de 10 años. Este enfoque permite identificar de forma imparcial tipos y estados celulares distintos dentro de la glándula lacrimal, revelando cómo el envejecimiento altera los perfiles de expresión génica, la infiltración de células inmunitarias y las interacciones epitelio-mesenquimal.

Actualmente, existen numerosos métodos de disociación tisular, incluyendo métodos de disociación mecánica11 y protocolos que implican digestión enzimática tibia a 37 °C con enzimas como colagénasis, dispasa otripsina 12. Se han descrito diversas estrategias de disociación para una amplia variedad de tejidos, incluyendo hígado, pulmón, riñón, corazón y múltiples tipostumorales 13,14,15. Sin embargo, preparar suspensiones viables de células unicelulares a partir de tejido de glándulas lacrimales envejecido sigue siendo técnicamente complicado debido al aumento de fibrosis y fragilidad celular. Además, como hemos informado anteriormente, la recuperación de células acinares frágiles puede ser un reto, ya que los cambios asociados a la disociación en la permeabilidad de membrana pueden aumentar la liberación de ARN ambiental de estas grandes células secretoras, contribuyendo a la señal de fondo en conjuntos de datos unicelularesposteriores 16. Aunque varios estudios han reportado atlas scRNA-seq de glándulas lacrimales envejecidas, la calidad de estos conjuntos de datos ha estado limitada por métodos de disociación subóptimos, lo que resulta en un menor rendimiento de células epiteliales que de poblaciones estromales. Aquí presentamos un protocolo detallado y optimizado para la disociación eficiente de LG de ratones envejecidos y el aislamiento de poblaciones celulares distintas para análisis posteriores de scRNA-seq y análisis de ARN-seq a granel (Figura 1). Este enfoque proporciona una herramienta poderosa para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a la disfunción de las glándulas lacrimales relacionadas con la edad.

El protocolo permite la generación de suspensiones unicelulares viables y de alta calidad a partir de glándulas lagrimales envejecidas, proporcionando una base fiable para análisis transcriptómicos completos. Permite la identificación detallada y caracterización molecular de diversas poblaciones celulares, incluyendo células mioepiteliales, fibroblastos y otros tipos celulares epiteliales y estromales que sufren cambios relacionados con la edad. El flujo de trabajo optimizado preserva la integridad celular y minimiza los artefactos transcripcionales inducidos por el estrés, asegurando una representación precisa de los estados celulares in vivo. Además, la metodología es ampliamente aplicable y puede adaptarse a otras glándulas exocrinas o tejidos fibróticos, donde la disociación suave del tejido y el aislamiento preciso de poblaciones celulares distintas son fundamentales para estudios posteriores con células individuales.

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Protocolo

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Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) del Instituto de Investigación Scripps (protocolo nº 08-0123; aprobado el 29 de agosto de 2023). El cuidado animal en el Instituto de Investigación Scripps está acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio Internacional (AAALAC). Los ratones se mantuvieron bajo un ciclo estándar de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con alimento y agua proporcionados ad libitum. Para los experimentos se utilizaron líneas transgénicas de ratones Pdgfra EGFP y Acta2 GFP. La información detallada sobre las líneas de ratones se proporciona en la sección "Tabla de materiales".

1. Consideraciones generales

  1. Seguir las Precauciones Universales17 del NIH al manipular materiales biopeligrosos y tejidos animales. Realizar todo el trabajo animal conforme a los protocolos aprobados de IACUC y los Niveles de Bioseguridad Animal designados.
  2. Sigue las prácticas estándar de seguridad en laboratorio evitando el pipeteo por boca, minimizando el uso de objetos punzantes, utilizando un armario de seguridad biológica para procedimientos de generación de aerosoles, usando el EPI adecuado, desechando los objetos punzantes en recipientes resistentes a pinchazos y etiquetando y desinfectando correctamente todos los residuos biopeligrosos antes de su eliminación.
  3. Descontaminar rutinariamente las superficies y equipos de trabajo utilizando desinfectantes adecuados (por ejemplo, lejía al 10%).
  4. Realizar todos los pasos de centrifugación a 4 °C en una centrífuga refrigerada preenfriada para preservar la viabilidad de la celda y minimizar el estrés inducido por la temperatura.
  5. Optimizar los ajustes del citómetro de flujo y del clasificador celular para la configuración específica del instrumento y ajustar los parámetros para cada conjugado anticuerpo-fluoróforo utilizando muestras de control adecuadas. Utilizar el mismo citómetro y instrumento de clasificación, con ajustes fijos y optimizados, a lo largo de una serie experimental para minimizar la variabilidad.
  6. Prepara las soluciones seleccionadas hasta un día antes y guárdalas adecuadamente hasta su uso. Prepara todas las soluciones en condiciones estériles en un armario de bioseguridad.
  7. Mantén separadas las soluciones que contienen Ca2+/Mg 2+ de los tampones que contienen EDTA para evitar la quelación durante los pasos enzimáticos. Todos los reactivos necesarios para este procedimiento se muestran en la Tabla de Materiales.

2. Plásticos

  1. En condiciones estériles, aplica platos de pre-recubrimiento, tubos y jeringuillas con 1x PBS + 1% BSA durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Aspira y mantén todo estéril hasta el uso.
  2. Puntas de pipeta pre-recubrimiento. Aspira y dispensa 1x PBS + 1% de BSA tres veces con cada punta para recubrir la superficie interna. Coloca las puntas recubiertas de nuevo en la caja de la punta estéril y déjalas secar durante la noche en una incubadora estéril. Utiliza estas puntas pre-recubiertas al día siguiente durante el procedimiento de aislamiento celular.

3. Soluciones y amortiguadores

  1. DNasa I Stock (5 mg/mL)
    1. Preparar 150 mM de NaCl del material 5M NaCl y filtrar la solución con un filtro estéril.
    2. Añade 1 M de CaCl₂ a la solución filtrada de NaCl de 150 mM para obtener una concentración final de 5 mM de CaCl₂.
    3. Resuspender 100 mg de DNasa I en 20 ml de tampón de 150 mM NaCl / 5 mM CaCl₂ para obtener una solución de 5 mg/mL de DNasa I en stock.
    4. Prepara alicotas de 500 μL y guárdalas a −20 °C durante hasta 6 meses. Evita ciclos repetidos de congelación y deshielo para evitar la pérdida de actividad enzimática.
  2. Medio digestivo
    1. El día antes del experimento, prepara la mezcla base del medio mezclando DMEM/F12 con 0,5% de BSA y filtrándola.
    2. Añadir 1M HEPES y 1M CaCl₂ al medio base DMEM/F12 / 0,5% BSA para obtener concentraciones finales de 15 mM y 3 mM, respectivamente.
    3. Añadir todas las enzimas siguientes justo antes de su uso: Colagenasa IV (1 mg/mL; 125 U/mL), Dispase II (2,5 mg/mL; 1,25 U/mL) y DNasa I (20 U/mL; 0,05 mg/mL del stock de 5 mg/mL).
  3. Medio Bloqueador 1 (BM1)
    1. Añadir 1M HEPES y 0,5M EDTA a 1x HBSS para obtener concentraciones finales de 15 mM y 3 mM, respectivamente.
  4. Medio Bloqueador 2 (BM2)
    1. Añadir FBS y 1M HEPES a DMEM/F12 para obtener concentraciones finales del 10% y 15 mM, respectivamente.
  5. Medio para el tratamiento de la DNasa
    1. El día antes del experimento, prepara el medio base mezclando 1x HBSS con 0,5% de BSA y filtrándolo.
    2. Añadir 1M HEPES, 1M CaCl₂ y 1M MgCl₂ al medio base 1x HBSS / 0,5% BSA para obtener concentraciones finales de 10 mM, 1,5 mM y 2 mM, respectivamente.
    3. Justo antes de usar, añade DNasa I (200 U/mL; 0,5 mg/mL del fondo de 5 mg/mL) a la mezcla preparada.
  6. Medio Bloqueador 3 (BM3)
    1. Utiliza el mismo medio base filtrado 1x HBSS / 0,5% BSA y añade 1M HEPES y 0,5M EDTA para obtener concentraciones finales de 10 mM y 1 mM, respectivamente.
  7. Medio Bloqueo 4 (BM4)
    1. Utiliza el mismo medio base filtrado 1x HBSS / 0,5% BSA y añade 1M HEPES para obtener concentraciones finales de 10 mM.
  8. FACS Buffer
    1. El día antes del experimento, prepara el medio base mezclando 1x DPBS con 0,5% de BSA y filtrándolo.
    2. Añadir 1M HEPES y 0,5M EDTA a 1x DPBS / 0,5% BSA para obtener concentraciones finales de 25 mM y 1 mM, respectivamente.
  9. Medio para scRNAseq (MSC)
    1. El día antes del experimento, prepara el medio mezclando 1x DPBS con 0,4% de BSA y filtrándolo.

4. Extracción de tejidos y microdisección (~ 40 - 50 min)

  1. Anestesiar al ratón con isoflurano y eutanasiar mediante dislocación cervical de acuerdo con las directrices institucionales de la IACUC.
  2. Utiliza pinzas finas y tijeras para incisar la piel entre el ojo y el oído y retraerla suavemente para exponer la glándula lagrimal.
  3. Para aislar la glándula, levántala ligeramente con una pinza de punta opaca y separa cuidadosamente el tejido conectivo circundante retirándolo suavemente en un movimiento circular. Los límites de la glándula lacrimal son claramente visibles, lo que permite una fácil separación de los tejidos adyacentes, incluida la glándula parótida.
  4. Transfiere la glándula lagrimal (cada glándula pesa aproximadamente entre 10 y 25 mg, dependiendo del peso, sexo y edad del ratón) a una placa de Petri de 35 mm que contenga 2 mL de PBS fría 1x sobre hielo. Bajo un microscopio disecador, retire la grasa restante y retire cuidadosamente la cápsula de tejido conectivo usando dos pinzas.
  5. Confirma el marcado celular examinando un pequeño fragmento de tejido bajo un microscopio de fluorescencia y verificando la señal de reportero o fluorescente esperada antes de proceder a la digestión enzimática.
  6. Coloca una placa de Petri estéril de 35 mm sobre hielo y añade 800-1000 μL de PBS frío 1x (ajuste de volumen según el tamaño de la glándula) al centro de la placa. Transfiere una glándula lacrimal al PBS 1x.
  7. Utilizando dos bisturíes estériles, pica finamente la glándula en pequeños fragmentos hasta que alcance una consistencia blanda y pasta. Asegúrate de que los fragmentos de tejido permanezcan sumergidos en PBS durante todo el proceso de picado, pero no permitas que floten libremente sobre el plato.
  8. Recoge fragmentos de tejido en un lado del plato, aspira PBS residual y lava los fragmentos con 1 mL de PBS fresco y frío.
  9. Transfiere los fragmentos de tejido lavados a una placa de 6 pozos que contenga 2 mL por pozo de medio digerente precalentado. Mantenga la placa sobre hielo hasta que todas las muestras estén procesadas.

5. Primera digestión enzimática (~1,5 - 2 h)

  1. Incuba la placa en un baño maria agitado a 37 °C, 60 rpm durante 30 minutos.
  2. Tritura suavemente el pañuelo 15 veces con una punta de 1 mL de gran diámetro, luego vuelve a colocar la placa en el baño maria agitado a 37 °C, 60 rpm durante otros 30 minutos.
  3. Tritura suavemente la muestra 10 veces con una punta normal de 1 mL, luego vuelve a colocar la placa en el baño maria agitado a 37 °C, 60 rpm durante 30 minutos adicionales.
  4. Triturar suavemente la muestra 10 veces y transferir la suspensión de la célula a tubos microcentrífugas Dolphin de 2 mL.
  5. Añade 1 mL de BM1 frío a cada pozo de la placa para recoger el medio digestivo restante que contiene las células residuales. Coloca la placa sobre hielo hasta el siguiente paso.
    NOTA: Si aún se observan grandes grupos celulares o fragmentos de tejido en esta etapa, extiende cada paso de incubación entre 10 y 20 minutos adicionales. No excedas el número indicado de pasadas de trituración (máximo 10-15 pasadas suaves), ya que un estrés mecánico adicional comprometerá la viabilidad celular.

6. Finalización de la actividad enzimática y lavados primarios (~ 15 min)

  1. Centrifuga los tubos que contienen la suspensión de la celda a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
  2. Desecha el sobrenadante. Transfiere el BM1 de cada pozo de la placa inicial (que contiene las células residuales) al tubo correspondiente y vuelve a suspender suavemente los pellets de celda.
  3. Enjuaga cada pozo con 600 μL adicionales de BM1 frío y combina el lavado con el tubo correspondiente para recoger todas las células restantes.
  4. Resuspende suavemente la suspensión de la celda, centrifuga de nuevo a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C y descarta el sobrenadante.

7. Tratamiento con Accutasa y DNasa (~ 30 - 35 min)

  1. Añade 1 mL de Accutase a los pastillazos celulares y vuelve a suspender suavemente. Incuba el tubo solo durante 5-10 minutos a 37 °C y 60 rpm.
    NOTA: Coloca el tubo de lado durante la incubación para evitar que las células se asienten y se peguen al fondo.
  2. Tritura suavemente 10 veces usando una punta de pipeta de 1 mL.
  3. Añade 1 mL de BM2 frío para terminar la reacción enzimática diluyendo la Accutasa.
  4. Centrifuga a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C y descarta el sobrenadante.
  5. Resuspende las células en el medio para el tratamiento con DNasa, llenando el tubo hasta la parte superior.
  6. Incubar durante 10 minutos en tiempo de descanso, resuspendiendo suavemente una vez después de 5 minutos.
  7. Mientras tanto, se prehumedece un colador de celda de 70 μm con 1 mL de BM3 colocado sobre un tubo cónico de 15 mL.
  8. Transfiere la suspensión de la celda al colador.
  9. Enjuaga el tubo de recogida original con 1 mL de BM3 y transfiere el enjuague al mismo colador.
  10. Lava el colador con 5 mL adicionales de BM3.

8. Recuento de células y comprobación de viabilidad

  1. Toma 10 μL de la suspensión de celdas filtradas en BM3 y mezcla con 10 μL de azul de tripán. Determina la concentración y viabilidad celular usando exclusión azul de tripán y cuantifica contando manualmente o con un contador automático de células (por ejemplo, contador automático de células Countess 3). Continúa solo si la viabilidad cumple el umbral requerido para aplicaciones posteriores (típicamente ≥70-80%).
    NOTA: Considera el volumen total que hay ahora en el tubo de 15 mL al calcular el rendimiento.
  2. Proceder según la solicitud aguas abajo. Para la secuencia de scRNA, continuar hasta la Sección 9. Para la clasificación celular basada en citometría de flujo, continuar hasta la Sección 10.
    NOTA: El flujo de trabajo scRNA-seq incluye lisis de glóbulos rojos y eliminación de células muertas magnéticas para reducir residuos y ARN ambiental y mejorar la calidad de los datos. Sin embargo, estos pasos pueden sesgar la representación de tipo celular al afectar preferentemente poblaciones epiteliales frágiles o raras, incluidas las células acinares. Para la clasificación basada en citometría de flujo, estos pasos se omitieron para maximizar la recuperación y preservar los epítopos de la superficie celular. Por tanto, la selección del flujo de trabajo debe guiarse por objetivos experimentales, priorizando la calidad de los datos para la recuperación de scRNA-seq o celular y la viabilidad para la clasificación y aplicaciones posteriores.

9. Preparación de células para scRNA-seq (~ 1 - 1,5 h)

  1. Prepara una solución de 1x RBC reconstituyendo la solución 10x con agua miliQ.
  2. Centrifugar el tubo de 15 mL que contiene la suspensión de la celda a 400 × g durante 5 minutos a 4 °C y descartar el sobrenadante.
  3. Resuspende el pellet celular en 5 mL de 1x tampón de glóbulos rojos e incuba durante 5 minutos en tiempo de descanso.
  4. Centrifugar de nuevo a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C y descartar el sobrenadante.
  5. Resuspende el pellet celular en 2 mL de BM4 frío.
  6. Toma 10 μL de la suspensión de células filtradas en BM4 y mézclala con 10 μL de azul de tripán para evaluar la concentración y viabilidad de las células.
  7. Prehumedece el colador MACS de 30 μm con 1 mL 1x HBSS y filtra la suspensión de la celda a través del colador hasta un tubo de 15 mL.
  8. Enjuaga el tubo de recogida anterior con 2 mL de BM4 frío y pasa el lavado por el mismo colador hasta el tubo de 15 mL.
  9. Lava el colador con 10 mL adicionales de BM4 frío.
  10. Centrifuga el tubo de 15 mL a 400 × g durante 5 minutos a 4 °C y elimina completamente el sobrenadante.
  11. Resuspende suavemente el pellet en 100 μL de microperlas MACS e incuba durante 15 minutos en RT.
  12. Mientras tanto, prepara 1x Binding Buffer (BB) del Kit de Eliminación de Células Muertas usando agua estéril doble destilada.
  13. Lava una columna de MS de MACS con 500 μL 1x BB para equilibrarse.
  14. Añade 400 μL de BB a la muestra, resuspende las células con microperlas y aplica todo el volumen sobre la columna de MS equilibrada. Recoge el flujo en un tubo de 15 mL.
  15. Lava la columna cuatro veces con 500 μL BB cada una, recogiendo todas las fracciones de flujo directo.
  16. Centrifugar el flujo recogido a 400 × g durante 5 minutos a 4 °C y descartar el sobrenadante.
  17. Resuspende las celdas en 400 μL de buffer MSC y transfiere la suspensión a un tubo de 1,5 mL.
  18. Enjuaga el tubo anterior con un tampón MSC de 700 μL y agrupa el enjuague con la muestra.
  19. Centrifugar a 400 × g durante 5 minutos a 4 °C y descartar el sobrenadante.
  20. Resuspende el pellet de celda en el tampón MSC usando una punta de gran diámetro hasta un volumen final de aproximadamente 1,5 mL.
  21. Centrifugar de nuevo a 400 × g durante 5 minutos a 4 °C y descartar el sobrenadante.
  22. Deja ~100 μL de sobrenadante, resuspende suavemente el pellet y cuenta las células de nuevo mezclando celdas de 6 μL con 6 μL de Trippan Blue.
  23. Ajusta el volumen final con el buffer MSC para alcanzar 700-1200 celdas/μL y recuenta las celdas para confirmar la concentración celular.
  24. Asegurarse de que la viabilidad celular tras la lisis de glóbulos rojos y la eliminación de células muertas sea ≥ 70% (normalmente 70-95%) antes de cargar para un procesamiento de cromo 10x (Solución de Células Individuales de Cromo 3' V3).
  25. Aplicar criterios básicos de control de calidad scRNA-seq: nUMI > 500, nGene > 200 y fracción génica mitocondrial <15%. Utilizar un umbral mitocondrial permisivo (15%) para preservar poblaciones epiteliales con mayor actividad metabólica. Incluir solo células que cumplan todos los criterios de control de calidad en análisis posteriores.
    NOTA: Estos umbrales de control de calidad representan valores de ejemplo derivados de nuestros conjuntos de datos (Figura suplementaria 1) y fueron reportados en nuestra publicaciónanterior 18.

10. Preparación de células para la clasificación celular basada en citometría de flujo (~ 1 - 1,5 h)

  1. Para el aislamiento basado en citometría de flujo de MECs y fibroblastos, se utilizaron líneas de ratones reporteros PdgfraEGFP y Acta2 GFP, respectivamente, para permitir la identificación precisa de cada población.
  2. Centrifugar el tubo de 15 mL con suspensión de celda a 400 × g durante 5 minutos a 4 °C y descartar el sobrenadante.
  3. Resuspende el pellet celular en un tampón FACS frío hasta una concentración final de 5 x 10⁵ a 2 x 106 celdas por 100 μL.
  4. Preparar los controles necesarios para la compensación de FACS: control negativo - células no teñidas de un ratón salvaje, control de fluorescencia de fondo - células no teñidas de ratonesActa2 GFP y PdgfraEGFP , control de una sola tinción - células de un ratón tipo salvaje teñidas individualmente con cada anticuerpo usado en el experimento.
    NOTA: Para cada muestra control, utilice al menos 1 × 10⁵ células resuspendidas en 100 μL de tampón FACS.
  5. Añade FcBlock (1:100) e incuba durante 5 minutos sobre hielo.
  6. Añadir anticuerpo monoclonal CD326 (EpCAM)-APC (1:100) o CD140a (PDGFRα) monoclonal (1:100). Incubar durante 45 minutos sobre hielo, protegido de la luz.
  7. Resuspende suavemente las células cada 15 minutos durante la incubación de anticuerpos.
  8. Llena cada tubo hasta arriba con buffer FACS frío y centrifuga a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
  9. Prepara la solución de trabajo FxCycle (1:1000) en el búfer FACS.
  10. Resuspende muestras en 1 mL y controla en 500 μL de buffer FACS frío con FxCycle.
  11. Transfiere todas las muestras a tubos FACS y mantenlas en hielo, protegidas de la luz.
  12. Proceder inmediatamente al Núcleo de Citometría de Flujo para la clasificación. Recoger las células clasificadas en el tampón FACS, medio de cultivo, tampón de lisis o ARNlater después, dependiendo de las aplicaciones posteriores.
    NOTA: La configuración del instrumento (por ejemplo, tamaño y presión de la tobera) y las tasas de eventos dependen de la configuración del clasificador y la población de celdas objetivo; por ello, se recomienda una prueba piloto preliminar para determinar parámetros óptimos para cada experimento.

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Resultados

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Disociar las glándulas exocrinas envejecidas es un reto debido a la acumulación de lípidos y a la extensa deposición de CLE. Las glándulas envejecidas presentan una marcada infiltración linfocítica y una pronunciada dilatación ductal con material intraluminal, reflejando los cambios estructurales e inflamatorios que complican la disociación tisular. La glándula lagrimal es un órgano exocrino compuesto por tres tipos principales de células epiteliales: células acinar, ductales y mioepitel...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, optimizamos y evaluamos un protocolo significativamente mejorado para generar suspensiones unicelulares a partir de tejidos exocrinos, centrado en la glándula lacrimal. Utilizando este enfoque, generamos suspensiones unicelulares limpias y de alta calidad tanto a partir de LG viejos como jóvenes, adecuadas para secuenciación unicelular y otras aplicaciones posteriores.

A pesar de la disponibilidad de numerosos protocolos de disociación tisular, fue nece...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo ha sido apoyado por el National Institute of Health, el National Eye Institute (NEI), EE. UU., subvenciones 5R01EY026202, R01EY035333; las subvenciones del National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01DE031044, 2R01DE014756, y la subvención 5R01CA271500 del National Cancer Institute (NCI).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Material
BSA Sigma-AldrichA4919
CaCl2 (1  Solución M)BioVisionB1010-100
Colagenasa IVSigma-AldrichC5138
Kit para retirar células muertasMiltenyi biotec130-090-101
Kit para retirar células muertasMiltenyi biotec130-090-101
Dispasa IIRocheC756V28
DNasa ISigma-AldrichDN25-100MG
DPBS Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-144
Suero bovino fetal, IgG ultra-bajoGibco# 16250078
La solución salina equilibrada de Hank (HBSS)Corning (Thermo Fisher Scientific)21-022-CV
HEPES (1  Solución M)Sigma-AldrichH0887
Solución de isofluranoCovertus# 11695067772
MACS® SmartStrainers (30 y micro; m)Miltenyi biotec130-098-458
MACS® SmartStrainers (70 y micro; m)Miltenyi biotec130-110-916
Media/F12 (DMEM/F12)MilliporeDF-042-B
MgCl2 1MSigma-AldrichM1028-100ML
Columnas MSMiltenyi biotec130-042-201
NaCl (acción de 5M)Invitrogen y comercio;AM9759
Tabletas de solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sigma-AldrichP8920-500ML
Solución para la lisis de glóbulos rojos (10 veces)Miltenyi biotec130-094-183
StemPro Accutase Gibco, Thermo Fisher ScientificA1110501
Solución azul de tripán, 0,4%Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061
EDTA ultrapuro (0,5M, pH 8,0)Invitrogen15575020
Anticuerpos
CD140a (PDGFRA) Anticuerpo monoclonal (APA5), APC-eFluor & trade; 780, Rat / IgG2a, kappaeBiociencia47-1401-82; RRID:AB_2784706
FcBlock (bloqueador de Fc CD16/CD32)BD en Biociencias  553141; RRID:AB_394656
FxCycle & trade; Mancha de violetaThermo Fisher ScientificF10347
Anticuerpo monoclonal de rata CD326 (EpCAM)-APC (G8.8), IgG2a de rata, kappaeBiociencia17-579182; RRID:AB_2716944
ratones
Acta2GFP  Un generoso regalo del Dr. Ivo KalajzicPMID: 18571490
PdgfraEGFP  - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/JEl laboratorio JacksonRRID:IMSR_JAX:007669
Equipo
Invitrogen y comercio;   Condesa y comercio; 3 Contador Automático de CeldasFisher ScientificA49862; RRID:SCR_026963

Referencias

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