Síntesis, encapsulación de hemoglobina y PEGilación biortogonal en nanopartículas UiO-66 jerárquicamente porosas para aplicaciones de suministro de oxígeno

Resumen

Este protocolo detalla la síntesis, encapsulación de hemoglobina y PEGilación superficial de nanopartículas jerárquicamente porosas de UiO-66 diseñadas para la entrega de oxígeno. El procedimiento combina ingeniería de defectos con conjugación biortogonal promovida por deformación para generar portadores altamente permeables y fisiológicamente estables, adecuados para aplicaciones biomédicas.

Resumen

Los portadores de ogénigeno basados en hemoglobina (HBOC) son una plataforma importante para la entrega de osígeno y así mitigar la hipoxia en varios contextos biomédicos. Sin embargo, la hemoglobina libre (Hb) es inestable y vasoactiva fuera de los glóbulos rojos. Aquí presentamos un protocolo reproducible, escalable paso a paso para fabricar nanopartículas de UiO-66 jerárquicamente porosas (HP-UiO-66 NPs) que encapsulan Hb y están estabilizadas por capas bioortogonales de polietilenglicol (PEG). La mesoporosidad jerárquica se introduce mediante modulación con ácido dodecanónico y posterior lavado ácido, produciendo NPs HP-UiO-66-NH₂ con cristalinidad preservada y isotermas combinadas tipo I/IV_{N 2} . Las aminas de superficie se convierten en azidas (HP-UiO-66-N₃ NPs), lo que permite la cicloadición alquino-azida promovida por deformación sin catalizador (SPAAC) producir NPs Hb@HP-UiO-66-PEG. El flujo de trabajo comprende: i) ingeniería de defectos de los NPs UiO-66-NH₂, ii) eliminación de moduladores, iii) instalación de azidas, iv) carga de Hb en medios acuosos con búfer, y v) PEGylación mediada por SPAAC. En cada etapa se detallan parámetros experimentales críticos, modos estándar de fallo y estrategias de solución de problemas para mejorar la reproducibilidad entre laboratorios. El protocolo es compatible con la producción a escala gramo de NPs HP-UiO-66-NH₂ por lote. Se obtienen eficiencias de encapsulación de ~35% (contenido de carga ~24 en peso) para Hb bajo condiciones suaves, con NPs redispersables con un diámetro hidrodinámico de ~140 nm y baja polidispersidad tras la PEGylación. Una caracterización fisicoquímica exhaustiva verifica la integridad del armazón, la mesoporosidad, la química superficial exitosa y una corona difusa de PEG de hasta ~12 nm de ancho. Los ensayos funcionales muestran oxigenación/desoxigenación reversible de Hb encapsulado, lo que indica la capacidad de transporte de oxígeno retenida. La PEGylación mejora notablemente la estabilidad coloidal y estructural en solución salina, HEPES y suero, evitando la degradación inducida por fosfatos observada en contrapartes no PEGiladas. Al integrar guías detalladas de resolución de problemas, visualización asistida por vídeo de pasos críticos y consideraciones de escala, este protocolo modular proporciona una vía robusta y accesible hacia HBOCs basados en estructuras metal-orgánicas. La estrategia es fácilmente adaptable a otras biomacromoléculas o enzimas que requieren microambientes protectores pero accesibles para su administración terapéutica.

Introducción

Una oxigenación adecuada es fundamental para una terapia eficaz y la cicatrización de tejidos en diversos entornos^{biomédicos 1}. En traumatismos y hemorragias quirúrgicas, la pérdida severa de oxígeno puede ser potencialmente mortal, lo que pone de manifiesto la necesidad de sustitutos sanguíneos seguros cuando la sangre de donante no está^{disponible 2}. En oncología, las regiones tumorales hipóxicas limitan la eficacia de los tratamientos dependientes del oxígeno, y la administración suplementaria de oxígeno puede aumentar notablemente la eficacia^terapéutica 3,4,5,6. El oxígeno también desempeña un papel central en la cicatrización de heridas, donde el aumento de la disponibilidad de oxígeno favorece la angiogénesis y la reparación de los^tejidos. De manera similar, en condiciones isquémicas y trasplantes de órganos, los portadores de oxígeno pueden reducir la lesión hipóxica y mejorar la viabilidad y recuperación^{tisular 8,9}.

Los portadores de osígeno sintéticos basados en hemoglobina (Hb) representan un enfoque prometedor para mitigar la^{hipoxia 10}. Sin embargo, el Hb fuera de los glóbulos rojos (glóbulos rojos) es inherentemente inestable y se disocia rápidamente en dímeros que pueden causar nefrotoxicidad, daño oxidativo y vasoconstricción debido a la absorción de óxidos^{nítricos 11}. Para mitigar estos desafíos, se han desarrollado estrategias de encapsulación para estabilizar Hb dentro de nanoportadores biocompatibles como los liposomas¹²,^{polimersomas 13} y nanopartículas poliméricas (NPs^{) 14,15,16,17}. Aunque estos sistemas mejoran la estabilidad del Hb, lograr una alta eficiencia de encapsulación manteniendo la función nativa de unión al ogénigeno sigue siendo^{un reto 18}. Además, la conversión oxidativa a metahemoglobina y la fuga de hemo puede comprometer el rendimiento en el transporte^{de oxígeno 19}. La rápida eliminación y la fuga prematura de Hb limitan aún más el tiempo de circulación y la traslación clínica²⁰.

Los marcos metal-orgánicos (MOFs) han surgido recientemente como nanoplataformas versátiles para la entrega de fármacos y biomacromoléculas debido a su arquitectura cristalina, gran superficie y porosidad^{ajustable 21}. Compuestos por nodos metálicos coordinados con enlaces orgánicos, los MOF permiten la difusión molecular y la personalización estructural, lo que los hace atractivos para aplicaciones biomédicas. Sin embargo, la mayoría de los MOFs poseen predominantemente cavidades microporosas (<2 nm), que restringen severamente la encapsulación post-sintética de macromoléculas como proteínas, ácidos nucleicos o^enzimas 22,23,24,25. Un enfoque para superar esta limitación es la mineralización biomimética in situ, donde las biomoléculas actúan como centros de nucleación durante el crecimiento de la MOF, como se demuestra en ZIF-8 y ZIF-90 26,27,28. A pesar de su eficacia, esta estrategia requiere condiciones de síntesis suaves, que restringen el rango de químicas MOF^{compatibles 29,30}.

UiO-66, un MOF basado en circonio construido a partir de nodos octaédricos_{Zr 6O4}(OH)₄ y enlaces de 1,4-bencenodicarboxilato (BDC), destaca por su excepcional estabilidad química y^{biocompatibilidad 31}. Su estructura robusta resiste la descomposición en ambientes acuosos y fisiológicos, lo que la hace ideal para aplicaciones^biomédicas. No obstante, su estructura microporosa intrínseca limita su utilidad para la encapsulación de biomacromoléculas. Hb, con una dimensión molecular de ~5 nm, no puede ser alojada en los poros internos de UiO-66 prístino. En consecuencia, solo un número limitado de estudios ha explorado UiO-66 en sistemas relacionados con Hb, en los que los MOFs se utilizan principalmente para la detección de Hb basada en superficies en lugar de para encapsulación^{de marcos 33,34}. Como resultado, las plataformas basadas en UiO-66 para encapsulación de Hb siguen siendo relativamente poco desarrolladas.

Muy recientemente, introdujimos un NP UiO-66 jerárquicamente poroso (HP-UiO-66 NP) que supera esta restricción de tamaño de poro incorporando dominios mesoporosos capaces de acomodar Hb, ampliando así el alcance funcional de UiO-66 para el desarrollo de^{HBOC 35}. La porosidad jerárquica se introduce mediante la ingeniería de defectos, específicamente empleando ácidos monocarboxílicos de cadena larga, como el ácido dodecanoico (DA), como moduladores durante la síntesis^36,37. Este modulador compite con el ligando BDC por la coordinación con Zr⁴⁺, lo que conduce a la formación de defectos y al aumento de los mesóporos. La posterior eliminación del modulador produce NPs HP-UiO-66 que contienen dominios micro- y mesoporosos coexistentes, con tamaño de poro sintonizable mediante concentración del modulador o longitud^{de cadena 36}.

Aunque la introducción de mesoporosidad mejora la accesibilidad molecular, también puede comprometer la integridad del marco en los tampones que contienen fosfato. Los iones fosfato pueden coordinarse con los grupos Zr, lo que conduce a una desintegración estructural parcial o^{completa 38,39}. Por ello, las estrategias de estabilización superficial son esenciales para preservar la estabilidad coloidal y química bajo condiciones^{fisiológicas.} En general, la estabilización superficial MOF puede lograrse mediante interacciones no covalentes (por ejemplo, interacción de van der Waals y enlaces de hidrógeno)⁴¹, interacciones de coordinación con sitios metálicos expuestos⁴², o unión covalente a enlaces^{orgánicos 43}. Entre los diferentes enlazadores, el polietilenglicol (PEG) es especialmente atractivo debido a su amplia disponibilidad y su mínima complejidad sintética⁴⁴. Es importante destacar que la modificación superficial de PEG, comúnmente conocida como PEGilación, confiere varias propiedades favorables para los sistemas de administración de fármacos, incluyendo una excelente biocompatibilidad, reducción de la adsorción de proteínas inespecíficas y menor reconocimiento inmunitario y captación^{de macrófagos 45,46}. En conjunto, estos efectos reducen las respuestas inmunogénicas y prolongan la circulación^{sistémica 47}.

Las técnicas tradicionales de PEGilación suelen basarse en la química de carbodiimida o maleimida, que normalmente requiere catalizadores o intermediarios reactivos capaces de dañar biomoléculas sensibles, como Hb. Para evitar esta limitación, empleamos la cicloadición alquino-azida promovida por cepa (SPAAC), una reacción bioortogonal libre de catalizadores entre especies funcionalizadas por azida y dibenzilciclooctina (DBCO), que permite la conjugación específica del sitio bajo condiciones acuosas^{suaves 35,48}. Este enfoque garantiza una modificación eficiente de la superficie sin comprometer la función de la Hb encapsulada.

Basándose en nuestros previamente reportados HP-UiO-66 NPs³⁵, que se centraban en el diseño estructural y la validación biofuncional, el presente protocolo enfatiza la transparencia metodológica y la reproducibilidad proporcionando un flujo de trabajo experimental detallado y paso a paso, con rangos de parámetros definidos y consideraciones críticas de manejo. Se incluyen guías de solución de problemas para etapas clave de síntesis, encapsulación en Hb y PEGylación mediante química SPAAC, lo que finalmente produce NPs estables Hb@HP-UiO-66-PEG (véase Figura 1).

El flujo de trabajo implica: (i) ingeniería de defectos usando DA como modulador para sintetizar_NPs HP-UiO-66-NH 2 modificados por aminos; (ii) funcionalización de azidas de grupos aminas superficiales; (iii) encapsulación de Hb en condiciones suaves y acuosas; (iv) conjugación covalente de PEG a través de SPAAC.

Para cada paso principal, este protocolo identifica desafíos experimentales comunes, como la agregación de partículas, el colapso de poros o la funcionalización ineficiente de superficies, y proporciona estrategias prácticas de solución de problemas para mejorar la reproducibilidad entre laboratorios. Es importante destacar que este artículo demuestra ampliamente que la síntesis de NPs HP-UiO-66 es fácilmente escalable, lo que permite una producción fiable a escala de gramos por lote.

Los nanoportadores PEGilados finales exhiben una alta estabilidad coloidal en el ácido fisiológico, 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico (HEPES) y suero, manteniendo la capacidad de unión y liberación de oxígeno^{de Hb de 35}. Métodos analíticos como la espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), la resonancia magnética nuclear (RMN), la difracción de rayos X en polvo (PXRD), la sorción de nitrógeno (N₂), el análisis de potencial zeta (ζ), la dispersión dinámica de luz (DLS), la microscopía electrónica de barrido (SEM) y la microscopía electrónica de transmisión (TEM) confirman la transformación química, la integridad del marco, la porosidad, la morfología a nanoescala y la funcionalización exitosa de superficies.

Al enfatizar la reproducibilidad, escalabilidad y claridad operativa, apoyado por la visualización basada en vídeo de pasos técnicamente sensibles, esta metodología proporciona una vía reproducible, robusta y accesible para fabricar portadores de oxígeno estables basados en MOF. Es importante destacar que el enfoque es modular y fácilmente adaptable a otras biomacromoléculas o enzimas que requieren un microambiente protegido pero permeable al oxígeno para mantener su funcionalidad. Por tanto, los NPs Hb@HP-UiO-66-PEG representan un paso prometedor hacia la creación de HBOCs capaces de suministrar oxígeno de forma eficiente mientras resisten la degradación en fluidos biológicos.

Desde una perspectiva práctica, esta estrategia puede extenderse a otras biomacromoléculas más allá de Hb, siempre que tengan dimensiones inferiores a aproximadamente 20 nm, correspondientes al tamaño máximo accesible de mesóporo, y presenten una o más de las siguientes características: (i) sensibilidad a condiciones químicas adversas, favoreciendo una síntesis leve y modificación superficial; (ii) la necesidad de un microambiente hidratado y permeable al ogígeno para mantener la actividad funcional; y (iii) susceptibilidad a la degradación MOF inducida por fosfatos, lo que requiere estabilización superficial. El enfoque se basa en densidades moderadas de defectos para equilibrar la accesibilidad del mesóforo con la integridad del marco. Cuando se requiere una modificación superficial específica y sin catalizadores para preservar la función de la biomolécula, la PEGylación basada en SPAAC ofrece claras ventajas. En consecuencia, este protocolo es muy adecuado para una carga eficiente de biomacromoléculas, preservación funcional y estabilidad coloidal a largo plazo bajo condiciones fisiológicas, mientras que biomoléculas o sistemas sustancialmente mayores que requieren una estabilidad térmica o ácida extrema pueden requerir plataformas alternativas de MOF.

Protocolo

1. Extracción de Hb (Duración esperada: 2 días)

NOTA: La extracción de Hb de sangre bovina disponible comercialmente (SSI Diagnostica A/S, Hillerød, DK) se realiza siguiendo nuestro protocolo⁴⁹ previamente reportado.

1. Transfiere sangre bovina (normalmente 10 mL por extracción) a un tubo cónico de centrífuga de 50 mL. Añade un volumen igual de solución salina al 0,9% (p/v) para diluir la sangre y reducir la viscosidad. Inverte suavemente varias veces hasta obtener una suspensión homogénea.
2. Centrifuga la sangre diluida a 1.500 x g durante 20 minutos a 4 °C. Tras la centrifugación, aparece un sobrenadante amarillo claro (plasma) sobre un denso pellet rojo (glóbulos rojos). Si no se logra la granulación completa, continúa la centrifugación según sea necesario.
3. Decanta cuidadosamente y descarta la capa de plasma sin alterar la bola. Añade solución salina fresca (10 mL), resuspende el pellet de glóbulos rojos mediante una inversión suave y repite el paso de centrifugación en condiciones idénticas. Realiza dos ciclos de lavado en total para eliminar proteínas plasmáticas y plaquetas.
   NOTA: El proceso de lavado es crucial para obtener glóbulos rojos puros libres de contaminantes plasmáticos que puedan interferir con la extracción de tolueno aguas abajo.
4. Tras el segundo lavado, descarta el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet de glóbulos rojos limpio en una mezcla de tolueno, agua ultrapura y solución salina con una relación de volumen de 1:0,4:1. Por ejemplo, mezcla 10 mL de tolueno, 4 mL de agua ultrapura y 10 mL de suero en un embudo separador de 50 mL antes de añadir el pellet.
5. Sella el embudo y invierte suavemente varias veces para mezclar las fases. Colocar el embudo a 4 °C durante la noche (~12-16 h) para permitir una separación completa de fase. La fase tolueno extrae las membranas lipídicas, dejando una fase acuosa clara enriquecida en Hb.
6. Al día siguiente, recoge cuidadosamente la capa acuosa inferior utilizando la llave de registro del embudo separador. Esta capa parece transparente y de un rojo oscuro.
7. Transfiere la solución acuosa de Hb a tubos de centrifugadora y centrifuga a 8.000 x g durante 20 minutos a 4 °C para eliminar cualquier residuo celular o material emulsionado.
8. Filtra el sobrenadante a través de una frita de tierra de diatomeas usando un sistema de filtración al vacío. Aplica solo un vacío suave (evita presiones negativas altas que puedan causar espuma o desnaturalización de proteínas).
9. Recoge el filtrado que contiene Hb libre de estroma. Almacena este material en hielo si se usa inmediatamente, o en una cuota (~1 mL) y congela a −80 °C para uso prolongado.
   NOTA: Las alicuotas de Hb pueden almacenarse congeladas durante varios meses sin degradación detectable.
10. Cuantifique la concentración de Hb mediante un ensayo de proteína de ácido bicincónico según el protocolo del fabricante, utilizando Hb puro bovino como estándar de calibración. Ajusta el stock final de Hb a la concentración de trabajo deseada (normalmente 20 mg ^mL-1 en el tampón HEPES, pH 7,4).
    NOTA: Espera una solución clara y roja de Hb, libre de material celular.
11. Opcional: medir los espectros de absorción UV-vis (375-700 nm) del Hb extraído para evaluar su capacidad de unión y liberación de oxígeno. Graba el espectro UV-vis inicial. Añade ditionita sódica y purga con gas_N2 durante 10 minutos para liberar oxígeno, y registra el espectro de Hb desoxigenado. Posteriormente, purga con aire durante 10 minutos para permitir la reoxigenación y vuelve a grabar el espectro.
    NOTA: La presencia de bandas características de Soret y Q, de Hb oxigenado (~412 nm para la banda Soret; ~541 y ~577 nm para bandas Q) y desoxigenado (~430 nm para la banda Soret; ~557 nm para banda Q) tras purgar con aire y N₂, respectivamente, indica que Hb sigue funcional (Figura suplementaria 1).
    PRECAUCIÓN: Manipula el tolueno con cuidado en una campana extractora mientras llevas el equipo de protección personal adecuado, incluyendo bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes. En el presente estudio, todos los líquidos de desecho que contienen tolueno fueron recogidos y eliminados como residuos líquidos químicos orgánicos en recipientes designados (Grupo C), etiquetados como "tolueno y mezcla", de acuerdo con las directrices del Ministerio de Medio Ambiente danés. La documentación correspondiente sobre la eliminación de residuos se proporciona en el Archivo Suplementario 1.

2. Fabricación de los NPs HP-UiO-66-NH₂ (Duración esperada: 3 días)

PRECAUCIÓN: HCl (37%) es corrosivo; Un mango dentro de una campana extractora con bata de laboratorio, guantes resistentes al ácido y protección ocular adecuada. Añade ácido poco a poco y evita inhalar vapores.

1. Pesa_{ZrCl 4} (400 mg, 1,715 mmol) en un matraz de fondo redondo de 250 mL. Añade lentamente DMF (80 mL) y ultrasonica durante 5 minutos para disolver completamente ZrCl₄. Añade DA (12 g, 60 mmol) y ultrasonica durante 30 minutos adicionales hasta obtener una solución clara y homogénea. Mide el volumen total de la solución usando un cilindro graduado y añade DMF según sea necesario para ajustar el volumen final a 100 mL. DA actúa como un modulador competitivo, introduciendo defectos controlados en la red.
   NOTA: Añadir DMF lentamente al disolver ZrCl₄, ya que el proceso de coordinación es exotérmico y puede causar un ligero humo; realizar todas las operaciones en una campana extractora. Ten en cuenta el aumento de volumen causado por la incorporación de DA usando un volumen inicial de 80 mL de DMF para disolver_{ZrCl 4} y DA, y ajusta el volumen final a 100 mL solo tras la disolución completa para asegurar un control preciso de la concentración.
2. Añade ácido 2-amino-1,4-benzenedicarboxílico (BDC-NH₂, 155 mg, 0,857 mmol) al mismo frasco y sonica durante 30 minutos adicionales. Continúa hasta obtener una solución homogénea de color amarillo pálido.
3. Transfiere la mezcla a un autoclave revestido de teflón o a un recipiente de presión de fondo redondo de 150 mL, adecuado para la síntesis solvotérmica. Sella bien y colócala en un horno de amortiguación precalentado a 120 °C durante 18 horas. No perturbar el reactor durante el calentamiento para evitar una nucleación descontrolada.
4. Tras la reacción, apaga el horno y deja que el recipiente se enfríe de forma natural hasta alcanzar la temperatura ambiente (~2 h). Observa una fina suspensión amarilla que aparece de forma uniforme en todo el medio.
5. Recoge el producto por centrifugación (11.000 x g, 10 min, temperatura ambiente) y desecha el sobrenadante. Lava el pellet con DMF (100 mL) tres veces usando las mismas condiciones de centrifugación para eliminar el exceso de ligando y el DA no reaccionado. Si el producto no está completamente pelletado, amplía el tiempo de centrifugación según sea necesario.
6. Prepara una solución de eliminación de ácido que contiene DMF (100 mL) que contenga 0,5 mL concentrado de HCl (37%). Sumerge completamente el pellet lavado en esta solución y caliéntalo en un horno de amortiguación a 90 °C durante 12 horas. Este paso elimina el modulador DA, creando mesóboros dentro de la estructura.
7. Tras 12 horas, centrifugar (11.000 x g, 5 min, temperatura ambiente) y descartar el sobrenadante. Repite el tratamiento ácido usando un nuevo lote de DMF que contenga 0,5 mL de HCl para asegurar la eliminación completa de la DA. Si el producto no está completamente pelletado, amplía el tiempo de centrifugación según sea necesario.
8. Lava el pellet secuencialmente con DMF, acetona y etanol (100 mL, 11.000 x g, 5 min, temperatura ambiente) para eliminar cualquier ácido y disolvente residual. Si el precipitado no está completamente granulado, amplía el tiempo de centrifugación según sea necesario. Entre cada lavado, redispersa suavemente el pellet mediante vórtices o una suave sonicación.
9. Seca el producto en un horno al vacío (140 °C) durante la noche tras secar en ambiente dentro de una campana extractora. Los materiales finales (HP-UiO-66-NH₂ NPs) aparecen como polvo fino amarillo. Espera un rendimiento típico de ~428 mg.
10. Confirmar que los picos de PXRD en 2θ = 7,3°, 8,4°, 25,7° permanecen nítidos (Figura 2A), indicando la retención de la topología cristalina UiO-66. Verificar la eliminación completa de la DA mediante ¹H RMN tras una digestión alcalina (2 M KOH en_{D 2}O) (sin picos de metileno a 1,2 ppm) (Figura 2B).
11. Caracterizar la porosidad por adsorción-desorción N₂ en 77 K⁵⁰. La curva muestra una isotermia combinada tipo I/IV con un lazo de histéresis (Figura 2C), confirmando la formación de mesóporos.
    NOTA: Un secado incompleto a alta temperatura o una masa de muestra insuficiente conducen a mediciones de porosidad inexactas utilizando isotermas de adsorción-desorción_N2 ; repite el proceso de secado al vacío a 140 °C y asegura que el peso de la muestra supere los 100 mg si el área Brunauer−Emmett−Teller (BET) es < 1.000^{m 2 g-1}.
12. Opcional: evaluar la morfología de los NP usando SEM. Los NPs HP-UiO-66-NH₂ presentan morfología esférica con una distribución de tamaño estrecha de ~100 nm (Figura 2D).
    NOTA: Se esperan NPs HP-UiO-66-NH₂ que posean tanto micro- como mesóporos, adecuados para encapsulación posterior de Hb.
13. La síntesis_{de NPs} HP-UiO-66-NH 2 puede escalarse aumentando proporcionalmente todos los reactivos y disolventes utilizados en los pasos 2.1 - 2.9 y realizando múltiples reacciones solvotérmicas paralelas. Manteniendo las mismas proporciones molares, concentraciones, temperatura de reacción y tiempo de reacción, y aumentando las cantidades de reactivos y disolventes en 1,5 veces, se pueden operar simultáneamente dos o más autoclaves revestidos de teflón o recipientes de presión de fondo redondeado de 150 mL, permitiendo la producción a escala de gramos de HP-UiO-66-NH₂ NPs (Figura 3).
    NOTA: Manipula todos los disolventes orgánicos dentro de una campana extractora mientras llevas bata de laboratorio, guantes resistentes al ácido y protección ocular adecuada. Recoger todos los líquidos residuales que contengan DMF y eliminarlos como residuos líquidos químicos orgánicos en recipientes designados (Grupo C) etiquetados como "DMF y mezcla" conforme a las directrices del Ministerio de Medio Ambiente danés. Se manejaron en consecuencia las soluciones de residuos que contenían trazas de ZrCl₄ y HCl. La documentación correspondiente sobre la eliminación de residuos se proporciona en el Archivo Suplementario 1.

3. Funcionalización azida de HP-UiO-66-NH₂ NPs (HP-UiO-66-N₃ NPs) (Duración esperada: 1 día)

PRECAUCIÓN: La trimetilsilyazida (TMSN₃) y el tert-butilo nitrito (tBuONO) son tóxicos y volátiles. Realiza todos los pasos con una campana extractora, llevando bata de laboratorio, guantes de nitrilo y protección ocular.

1. Pesa con precisión HP-UiO-66-NH₂ NPs (50 mg) en un matraz de fondo redondeado de 25 mL. Añade THF (10 mL) y ultrasonea durante 5 minutos para dispersar completamente las partículas. La suspensión se vuelve opaca pero uniforme.
   NOTA: La dispersión uniforme de los NP tras la sonicación es fundamental para un contacto efectivo con los reactivos. Si la dispersión es incompleta, aumenta el volumen de solución y repite la sonicación.
2. Coloque el matraz en un baño de agua con hielo (0 °C) sobre un agitador magnético ajustado a 400 rpm. Usando una jeringuilla de cristal, añade tBuONO (0,4 mL) en gota durante 5 minutos manteniendo la temperatura por debajo de 5 °C.
3. Añadir inmediatamente TMSN₃ (0,35 mL) gota a gota bajo las mismas condiciones de frío. Puede aparecer una efervescencia leve, indicando progreso de la nitrosación. Envuelve el baño con papel de aluminio para proteger la reacción de la luz...
4. Continúe removiendo la mezcla de reacción durante la noche (~16 h) en el baño de hielo y agua para permitir la sustitución completa de los grupos aminas por azida en la superficie de la MOF.
5. Quita el baño de hielo y deja que la suspensión alcance la temperatura ambiente. Centrifugadora (11.000 x g, 5 min, temperatura ambiente) para recoger los NPs modificados. Si el precipitado no está completamente granulado, amplía el tiempo de centrifugación según sea necesario.
6. Lava el pellet a fondo con THF (10 mL) tres veces, recogiéndolo por centrifugación (11.000 x g, 5 min, temperatura ambiente) tras cada lavado. A continuación, se aplican tres lavados adicionales con acetona (10 mL), centrifugando bajo las mismas condiciones, para eliminar reactivos y subproductos residuales. Si el precipitado no está completamente granulado, amplía el tiempo de centrifugación según sea necesario.
7. Seca el producto (HP-UiO-66-N₃ NPs) usando un horno (140 °C) bajo vacío durante la noche tras secar al aire libre dentro de una campana extractora. Espera un rendimiento típico de ~45 mg.
8. Verifica la transformación química mediante espectroscopía FTIR: aparece un estiramiento asimétrico marcado de azida en ~2122 ^cm-1 (Figura 4A). La intensidad de la banda se correlaciona con la eficiencia de sustitución superficial.
   NOTA: La conversión incompleta puede afectar la conjugación posterior de clics. Si la banda de azida es débil, se repite la funcionalización usando cantidades 2 veces de tBuONO y TMSN₃. Esperemos_{HP-UiO-66-N 3} NPs con terminación azido-terminada con cristalinidad preservada y arquitectura mesoporosa (Figura 4B-D), listos para encapsulación en Hb y PEGilación SPAAC.
   PRECAUCIÓN: Recoger todos los líquidos de desecho que contengan TMSN₃, incluidas mezclas con otros reactivos (por ejemplo, tBuONO y THF), en contenedores de residuos peligrosos del Grupo O designados conforme a las directrices del Ministerio de Medio Ambiente danés. Etiqueta claramente todos los recipientes para indicar la presencia de TMSN₃ y sus mezclas. La documentación relevante para la eliminación de residuos se proporciona en el Archivo Suplementario 1.

4. Carga y cuantificación de Hb (Duración esperada: 2 días)

1. Transfiere HP-UiO-66-N₃ NPs (5 mg) a un tubo centrífuga de 2 mL, seguido de ~2 minutos de sonicación en 0,5 mL de buffer HEPES (20 mM, pH 7,4). Añade 0,5 mL de buffer HEPES que contiene Hb (20 mg ^mL-1) e invierte suavemente el tubo varias veces para dispersar completamente los NPs.
2. Coloca el tubo sobre un termoshaker y incuba a temperatura ambiente (22-25 °C) bajo 1.000 rpm agitando durante 2 horas.
3. Tras la incubación, centrifugar 13.500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para pelletar_{los NPs} resultantes de Hb@HP-UiO-66-N. Recoger cuidadosamente el sobrenadante para cuantificar el Hb no atrapado. Si el precipitado no está completamente granulado, amplía el tiempo de centrifugación según sea necesario.
4. Lava el pellet suavemente con agua ultrapura (1 mL) pipeteando arriba y abajo para eliminar el Hb ligeramente adsorbido, y repite el lavado dos veces. Recoger cuidadosamente el sobrenadante de cada lavado para cuantificar el Hb no atrapado. Resuspender el último pellet en agua ultrapura de 0,5 mL para caracterización. Guarda las muestras en la nevera (4 °C) para evitar la oxidación.
5. Determinar el Hb no atrapado en los supernadados recogidos utilizando el ensayo⁵¹ de lauril sulfato de sodio (SLS)-Hb. Pipetear 10 μL de cada sobrenadante en una microplaca de 96 pozos y añadir 100 μL de reactivo SLS (0,6 mg ^mL-1 en agua ultrapura). Incubar 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y luego leer la absorbancia a 412 nm usando un espectrofotómetro UV-vis.
6. Prepara una curva estándar usando soluciones Hb stock (0-10 mg ^mL-1) en un tampón HEPES para convertir los valores de absorbancia en concentración.
7. Calcular la eficiencia de encapsulación (EE) y el contenido de carga (LC) como:
   EE (%) = [(Hb inicial - Hb sobrenadante)/Hb inicial] × 100
   LC (%) = [(Hb encapsulado)/(Hb encapsulado + masa NP)] × 100
8. Para aumentar la encapsulación de Hb, incuba 100 mg de NPs con 20 mL de solución de Hb (10 mg mL⁻¹). Para evaluar la porosidad tras la encapsulación, sumergir los NP resultantes en etanol durante 24 horas, luego secarlos durante la noche en un horno al vacío a 140 °C, y registrar la isoterma de adsorción-desorción_N2 para evaluar la porosidad. El color rojo del polvo indica una encapsulación exitosa de Hb (Figura 5A), y una marcada disminución en la captación de N₂ confirma el relleno exitoso de mesóporos con Hb (Figura 5B).
9. Mide el potencial ζ usando un Zetasizer Nano ZS. La carga superficial disminuye de ~+40 mV (HP-UiO-66-N₃ NPs) a ~+20 mV (Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs), consistente con la adsorción de Hb (Figura 5C).
10. Opcional: adquirir micrografía SEM (Figura 5D) y difractograma PXRD (Figura 5E) para asegurar la integridad morfológica y la estabilidad estructural.
11. Registrar espectros UV-vis (375-700 nm) para evaluar la unión reversible al oxígeno de los NPs. Añadir ditionito sódico y purgar con_N2 durante 10 minutos para liberar oxígeno, registrar el espectro, luego purgar con aire durante 10 minutos para permitir la re-unión y registrar el espectro de nuevo (Figura 5F).
    NOTA: La presencia de bandas características de Soret y Q, de Hb oxigenado (~412 nm para la banda Soret; ~541 y ~577 nm para bandas Q) y desoxigenado (~430 nm para la banda Soret; ~557 nm para banda Q) tras purgar con aire y N₂, respectivamente, indica que Hb sigue funcionando.
12. Espere Hb@HP-UiO-66-N 3 NPs rojos uniformes que contengan Hb funcionalmente activo con comportamiento reversible de oxigenación.

5. Fabricación de NPs Hb@HP-UiO-66-PEG: PEGylación mediante SPAAC (Duración esperada: 2 días)

1. Prepara un tubo centrífugo de 2 mL que contiene Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs (10 mg) dispersados en 0,5 mL de agua ultrapura. Añade DBCO-PEG (MW ~2.000, 20 mg en 0,5 mL de agua ultrapura) para conseguir una proporción de PEG a NPs de 2:1 (p/w). Haz un vórtice suave hasta que esté completamente mezclado.
2. Incuba la mezcla en un termoshaker a temperatura ambiente y a 1.000 rpm durante 1 hora, luego transfiera a un frigorífico (4 °C) para una reacción nocturna (~16 h). Esta reacción de clic SPAAC sin catalizadores acopla covalentemente DBCO a los grupos azid, formando enlaces triazólicos estables.
3. Centrifugar a 12.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para pelletar los NPs PEGylados Hb@HP-UiO-66-PEG. Si el precipitado no está completamente granulado, amplía el tiempo de centrifugación según sea necesario. Descarta el sobrenadante que contiene PET no reaccionado.
4. Lava el pellet tres veces con agua ultrapura (2 mL cada uno, pipeteando arriba y abajo) bajo condiciones idénticas de centrifugación. Esto garantiza la eliminación de cadenas PEG libres y pequeños subproductos moleculares.
5. Suspender las NPs purificadas de Hb@HP-UiO-66-PEG en 2 mL de agua ultrapura y almacenarlas a 4 °C.
   El coloide parece homogéneo y ligeramente opalescente, lo que indica buena estabilidad en la dispersión.
6. Confirmar PEGylación exitosa mediante espectroscopía FTIR (Figura 6A): desaparición de la banda de azida en 2122 ^cm-1 y aparición de señales de metileno (−CH₂−) y enlace éter (−O−) derivadas de PEG en 2883 y 1097 ^cm-1, respectivamente.
7. Verificar con ^{RMN de 1}H (Figura 6B) tras la digestión alcalina en 2 M KOH/_{D 2}O; Las muestras PEGiladas muestran una señal adicional en δ = 3,53 ppm correspondiente a los protones oxietileno de la PEG.
8. Mide el diámetro hidrodinámico y el índice de polidispersión (PDI) mediante DLS (Figura 6C).
   Un aumento de ~115 nm (PDI ~0,1) a ~140 nm (PDI ~0,17) confirma el recubrimiento superficial con una capa delgada de polímero.
9. Opcional: medir el potencial ζ superficial usando un Zetasizer Nano ZS para verificar el efecto insignificante de la PEGylación superficial sobre la carga superficial (Figura 6D). Un cambio menor tras la PEGylación (de ~+20 mV a ~+17 mV) indica un impacto mínimo sobre la carga superficial.
10. Observa la morfología mediante TEM (Figura 6E). El TEM revela un borde difuso de ~10-12 nm alrededor del borde de la partícula que representa la corona PEG.
11. Realizar un ensayo de liberación de oxígeno utilizando un electrodo de oxígeno (Figura 6F) para mostrar que la función Hb permanece intacta tras la PEGylación, similar a la forma no PEGylada. Se espera un NP estable, disperso en color marrón rojizo-marrón de Hb@HP-UiO-66-PEG, que muestre una fuerte estabilidad coloidal y capacidad de unión al oxígeno retenida, adecuado para pruebas fisiológicas a largo plazo.
12. Opcional: realizar curvas de disociación de ogénigeno (COD) de Hb y Hb libres encapsuladas en Hb@HP-UiO-66-PEG NPs para identificar la presión parcial de oxígeno al 50% de saturación de oxígeno en Hb (p50) y el coeficiente de Hill (Hill-n) (Figura 7).

6. Evaluación de la estabilidad del NP (Duración esperada: 7 días)

1. Dispensar las NPs Hb@HP-UiO-66-PEG (~5 mg) en siete tubos centrífugos de 2 mL. Añade 2 mL de cada medio: agua ultrapura, solución salina (0,9% NaCl), HEPES (20 mM), suero para ratones, plasma humano, glucosa media modificada de Dulbecco (DMEM) y solución salina tamponada con fosfato (PBS). Asegúrate de que las tapas de los tubos de la centrífuga estén bien cerradas para evitar la evaporación del medio durante la incubación. El suero de ratón CD-1 y el plasma humano se compran a Innovative Research (Novi, MI, EE. UU.).
2. Incubar las muestras a 37 °C en un termoshaker a 1.000 rpm durante hasta 7 días.
3. Después de 3 y 7 días, recoge partículas por centrifugación (12.000 g, 10 min, temperatura ambiente), lávate una vez con agua ultrapura y seca para PXRD (Figura 8A). Si el precipitado no está completamente granulado, amplía el tiempo de centrifugación según sea necesario.
4. A 0, 24, 72 y 168 horas, extraer alicotas (~50 μL) y diluirlas 20 veces para el análisis DLS (tamaño y PDI) (Figura 8B).
5. Opcional: preparar muestras de SEM después de 48 horas en PBS para comprobar visualmente la morfología (Figura 8C).
   NOTA: Diluir la suspensión de los NPs (en PBS) con agua ultrapura es esencial para el análisis SEM, ya que reduce la interferencia de fondo de los componentes del tampón y facilita la imagen clara de los NPs.
6. Compárese con_{los NPs} no PEGilados Hb@HP-UiO-66-N 3 bajo condiciones idénticas; la rápida desaparición de reflejos cristalinos característicos y la aparición de amplias características amorfas de dispersión indican inestabilidad sin recubrimiento PEG.
   NOTA: Las muestras PEGyladas permanecen estructuralmente intactas tras 7 días en todos los medios, mientras que las no PEGyladas se descomponen en 24 horas en PBS o DMEM.

7. Caracterización fisicoquímica (Duración esperada: ~15 días)

NOTA: Esta sección describe los métodos analíticos necesarios para confirmar la morfología, composición, porosidad e integridad de Hb de los NP. Estas técnicas de caracterización validan colectivamente la reproducibilidad de los procesos de síntesis y modificación.

1. PXRD
   1. Seca ~5 mg de cada muestra de NP en un secador congelador durante la noche antes de medirlo para eliminar la humedad adsorbida.
   2. Carga la muestra sobre un soporte plano de silicio sin fondo y aplana suavemente usando una lámina de vidrio limpia para formar una capa fina y uniforme.
      NOTA: Evita presionar demasiado, ya que puede inducir efectos de orientación preferida.
   3. Registrar patrones PXRD usando un difractómetro de sobremesa equipado con radiación Cu Kα (λ = 1,5418 Å). Ajusta los parámetros de escaneo a 2θ = 4-50°, tamaño del paso = 0,02°, permanencia = 1 s por paso.
   4. Comparar los patrones obtenidos con la estructura simulada de UiO-66 generada mediante el software de Mercury basada en los datos cristalinos previamente^{reportados 31}. La presencia de picos pronunciados en 7,3°, 8,4° y 25,7° indica integridad cristalina.
2. N₂ Adsorción-Desorción (Área de superficie BET y distribución del tamaño de los poros)
   1. Desgasificar ~100 mg de cada muestra de NP a 140 °C bajo vacío durante 24 horas usando un sistema Micromeritics Smart VacPrep con purga de ultra alta pureza_{N 2}.
   2. Transfiere inmediatamente las muestras desgasificadas al puerto de análisis de un analizador de superficie Micromeritics Tristar. Registrar_{N 2} isotermas a 77 K dentro de un rango de presión relativa (P/P₀) de 0-1.
   3. Calcular las áreas superficiales usando el método BET siguiendo los criterios extendidos^{de Rouquerol 52}. Calcula la distribución del tamaño de los poros mediante la teoría del funcional de densidad no local implementada en el software de Micromeritics.
   4. Genera las curvas de adsorción/desorción y los gráficos de distribución del tamaño de los poros usando Origin 2022. Importa los datos de adsorción/desorción al software, con presión relativa (P/P₀) en el eje X y el volumen adsorbido de N₂ en el eje Y.
   5. Grafica los datos de distribución del tamaño de los poros con el ancho de poro como eje X y volumen incremental de poros como eje Y. Presenta los resultados como gráficos "Línea + Símbolo". Realiza todos los análisis usando la configuración predeterminada del software.
3. Espectroscopía FTIR
   1. Muele ~5 mg de cada muestra seca hasta obtener un polvo fino usando un mortero de ágata limpio. Coloca el polvo sobre el cristal ATR de un espectrómetro ALPHA-P^{Bruker 53}.
   2. Recoge espectros en el rango de 4.000-400 ^cm-1 con resolución de 2 ^cm-1 .
   3. Identificar picos característicos: La aparición del estiramiento de N₃ en ~2122 ^cm-1 confirma la formación de azidas (Figura 4A). Tras la PEGylación, observemos las bandas −CH₂− y C-O-C en ~2883 ^cm-1 y ~1097 ^cm-1, respectivamente, junto con la desaparición del estiramiento N₃ (Figura 6A). Se espera la desaparición de la banda azida y la aparición de señales de metileno (−CH₂−) y hueso de éter derivadas de PEG (−O−) confirmen la finalización de la reacción SPAAC.
   4. Grafica las curvas FTIR usando Origin 2022. Importa los datos en bruto al software con los valores X (número de onda) e Y (transmisancia). Genera gráficos en formato "Línea" usando la configuración predeterminada del software.
4. ¹H RMN
   1. Añade ~10 mg de NPs a 0,5 mL de 2 M KOH en D_2Ocolocados en un frasco de cristal, y calienta a 80 °C durante 1-2 horas para digerir el marco.
   2. Centrifugadora (12.000 x g, 10 min, temperatura ambiente) para centrifugar los residuos no disueltos. Transfiere el sobrenadante a un tubo de RMN de 5 mm.
   3. Graba espectros ^{RMN de 1}H en un espectrómetro Bruker Avance de 400 MHz.
   4. Asignar los desplazamientos químicos característicos, incluyendo los protones aromáticos de BDC-NH₂ (δ = 6-8 ppm) y las señales PEG (δ = ~3,53 ppm, Figura 6B), utilizando el software de MestReNova. Analiza los datos de RMN utilizando el módulo de procesamiento de RMN del software con sus ajustes predeterminados.
5. SEM
   1. Depositar ~5 μL de suspensión NP sobre una oblea de silicio; Déjalo secar al aire en un armario libre de polvo. Si se produce carga, aplica un recubrimiento de 5 nm de oro.
   2. Imagen en un FEI Quanta 200 SEM a 10-20 kV de tensión de aceleración.
   3. Analiza las imágenes usando ImageJ. Importa las imágenes TIFF originales con la información de escala incrustada en el software y ajusta el brillo y contraste únicamente para la visualización. No aplique ningún procesamiento adicional que pueda afectar la información dimensional. Genera las barras de escala usando la función Analizar del software.
6. TEM
   1. Colocar ~5 μL de dispersión NP en una rejilla de Cu de carbono lacey (malla 300). Seca el exceso con papel de filtro y sécate en condiciones ambientales.
   2. Examina bajo un FEI Tecnai T20 G2 TEM a 200 kV.
   3. Analiza las imágenes usando ImageJ. El procesamiento de imágenes sigue los procedimientos descritos en la Sección 7.5.3.
7. DLS y ζ-Potencial
   1. Diluir las NPs ~20 veces en agua ultrapura para tamaño y análisis PDI; para ζ-potencial, diluir en un tampón HEPES (20 mM, pH 7,4).
   2. Mide usando un Zetasizer Nano ZS a 25 °C. Se preparan al menos tres muestras independientes (n = 3), y cada muestra se mide en triplicado.
   3. Grafica los datos DLS y de ζ-potencial usando Origin 2022. Presenta la distribución ponderada por intensidad como grafos "Línea + Símbolo" y los resultados de ζ-potencial como grafos "columna". Informa los datos como media ± desviación estándar (n = 3). Realiza todos los análisis usando la configuración predeterminada del software.
8. Espectroscopía UV-vis para funcionalidad Hb
   1. Dispersa 3 mg de Hb libre o una cantidad correspondiente de NPs (es decir, que contengan una cantidad equivalente de Hb encapsulado) en 3 mL de agua ultrapura. Transfiere las suspensiones a una cuveta de cuarzo. Graba espectros UV-vis de 375 a 700 nm usando un espectrofotómetro UV-2600 UV−vis.
   2. Añade una pizca de ditionita sódica a la solución de Hb o a la suspensión NP y purga con_N2 durante 10 minutos para desoxigenar la muestra. Graba el desplazamiento de la banda Soret de 412 a 430 nm y la fusión de las bandas Q. Reoxigena la muestra burbujeando aire durante 10 minutos para observar la inversión (Figura 5F y Figura suplementaria 1).
   3. Grafica los datos usando Origin 2022. Presenta los espectros como grafos "Línea", con longitud de onda en el eje X y absorbancia en el eje Y.
9. Cuantificación del oxígeno liberado
   1. Dispersa 1 mg de Hb libre o una cantidad correspondiente de Hb@HP-UiO-66-N₃ y Hb@HP-UiO-66-PEG (que contengan una cantidad equivalente de Hb encapsulado) en agua ultrapura de 600 μL. Transfiere las suspensiones a frascos de vidrio de 2 mL y sérralos herméticamente con tapones de goma.
   2. Inserta cuidadosamente la sonda de aguja del electrodo de oxígeno a través de la tapa de goma en la suspensión para monitorizar el nivel de oxígeno disuelto usando un medidor tipo aguja_O2 .
   3. Añade rápidamente la solución de K₃[Fe(CN)₆] (10% en peso en 100 μL de agua ultrapura) a la suspensión usando una aguja de jeringuilla y registra continuamente el cambio en el nivel de oxígeno.
   4. Calcular el ogénito liberado restando el valor máximo observado tras la adición de K₃[Fe(CN₎₆] del valor inicial anterior a su adición. Normalizar los valores obtenidos al ogénito liberado de la misma cantidad de Hb libre (Figura 6F) usando Origin 2022. Mide tres muestras independientes (n = 3) para obtener Hb libre o cada NP.
      NOTA: Hb@HP-UiO-66-N₃ y Hb@HP-UiO-66-PEG NP muestran una liberación de oxígeno comparable, cada una liberando ~60% del osígeno liberado por Hb libre.
10. Medición de COD y cálculo de p50 y Hill-n
    1. Preparar NPs libres de Hb bovino o Hb@HP-UiO-66-PEG a una concentración final de Hb de ~1 mg ^mL-1 en 3 mL de suero fisiológico (20 mM HEPES, 0,9% (p/v) NaCl, pH 7,4). Transfiere la muestra a una cuveta de cuarzo equipada con una barra magnética de agitación.
    2. Coloca la cubetas en un analizador Hemox. Se ajusta la temperatura de medición a 37 °C y se permite que el sistema se equilibre bajo agitación continua hasta alcanzar una línea base estable.
    3. Registrar las COD mediante desoxigenación escalonada en un rango de presión parcial de 1-148 mmHg. Utiliza el software analizador Hemox preinstalado para medir ODCs y calcular p50 y Hill-n usando los ajustes de análisis por defecto. Mide tres muestras independientes (n = 3) para cada muestra.
    4. Exporta los datos procesados y grafica los ODC usando Origin 2022 en el formato predeterminado de gráfico "Línea".

8. Reproducibilidad y análisis estadístico

1. Realiza todos los procedimientos descritos en este protocolo al menos tres veces de forma independiente. Informa los resultados como resultados típicos observados a lo largo de estas repeticiones. Mantener los parámetros experimentales clave, como los tiempos de reacción y las temperaturas, dentro de un rango razonable para garantizar la reproducibilidad y fiabilidad para otros usuarios.
2. Caracterización estructural actual (PXRD, adsorción-desorción N₂ , FTIR, ^{RMN de 1}H, SEM, UV-vis) como datos representativos para la confirmación cualitativa sin realizar análisis estadístico.
3. Informa de mediciones cuantitativas (DLS, ζ-potencial, p50, Hill-n) como media ± DE (n ≥ 3). Determinar la significación estadística usando la prueba t de Welch bicolal no emparejada o ANOVA unidireccional, según corresponda. Indicar niveles de significación como ns (sin significado), * = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001.

Resultados

La síntesis exitosa de HP-UiO-66-NH₂ NPs fue verificada por PXRD (Figura 2A), que mostró los picos característicos de difracción en 2θ = 7,3°, 8,4° y 25,7°, en buena concordancia con la estructura simulada de UiO-66³⁶. El ligero ensanchamiento del pico respecto al patrón simulado se atribuyó a las dimensiones a nanoescala de las partículas y confirmó la preservación de la integridad cristalina tras la síntesis

Discusión

Este protocolo presenta una ruta robusta y reproducible para sintetizar, funcionalizar y caracterizar NPs HP-UiO-66 diseñados para aplicaciones de encapsulación en Hb y entrega de oxígeno. Adoptando un enfoque de ingeniería de dentro hacia fuera, este trabajo establece un marco generalizable para el diseño de NPs MOF para aplicaciones biomédicas, incluyendo la administración de biomacromoléculas y fármacos. Aunque el concepto material subyacente y el rendimiento funcional ya se han repor...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ácido 2-amino-1,4-benzenedicarboxílico	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	381071-25G
4-(2-hidroxietil)piperazina-1-ácido etanosulfónico	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	H3375-100G
Acetona (99%)	VWR International (Sø borg, DK)	23J244030
Ensayo de proteínas con ácido bicinquinínico	Thermo Fisher Scientific (Roskilde, DK)	23235
Sangre bovina y	SSI Diagnostica A/S (Hillerø d, DK)	77667
Tubo centrífuga
Centrifugadora	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, EE. UU.)	75009903	Megafuge ST Plus serie & nbsp;
Óxido de deuterio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	151882
Dibenzociclooctino-polietilenglicol	BroadPharm	BP-23949
ácido dodecanoico	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	L556-1KG
Dulbecco' s Águila modificada' s mediano e inconveniente; glucosa alta y nbsp;	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	11965092
Etanol (100%)	VWR International (Sø borg, DK)	24L044013
Espectroscopía infrarroja de transformada de Fourier	Bruker (Billerica, EE. UU.)
Analizador de hemox	CRP CIENTÍFICO TSC (PA, EE. UU.)
Plasma citado humano	TebuBio	SER-PLP25
Ácido clorhídrico (37%)	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	320331-500ML
Software ImageJ	Institutos Nacionales de Salud (EE. UU.)		Versión 1.47t
Rejilla de Cu de carbono lacey (malla 300)	Agar Scientific Ltd., (Stansted Essex, Reino Unido)	AGS166-3H
Agitador magnético	IKA-Werke GmbH & Compañía KG (,DE)	Identificación. No.: 0010011496
Sofeware MestReNova	Mestrelab Research (España)		Versión 12
Analizador de superficie Micromeritics Tristar	Thermo Fisher Scientific Inc	ASAP 2020 Plus
Mini centrífuga	Eppendorf Nordic (Hø rsholm, DK)	Nº de catálogo y nbsp; 5452000010
Suero para ratones	Investigación Innovadora (Novi, MI, EE. UU.)	IGMSCD1SER10ML
Caldera de amortiguador	Nabertherm GmbH (Bremen, DE)	Caldera amortiguadora LE 6/11
N,N′-dimetilformamida (99,9%)	VWR International (Sø borg, DK)	250131a008
Equipo Nanodrop 2000c	Thermo Fisher
Resonancia magnética nuclear	Bruker (Billerica, EE. UU.)
O2 meter	PreSens (Ratisbona, Alemania)
Software Origin 2022	OriginLab Corporation (MA, EE. UU.)		Versión 2022
Sensor de oxígeno	PreSens (Ratisbona, DE)	Traza OXY-1 ST
Solución salina tamponada con fosfato	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	P4417-50TAB
Lector de placas	Tecan Group Ltd.  (Mä nnedorf, CH)
Hexacianoferrato de potasio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	60299-100G
Hidróxido de potasio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	221473-500G
Difracción de rayos X en polvo	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Reino Unido)		Modelo: Malvern Panalytical Aeris Research 600W XRD para mediciones de pólvora (Publicado en 2020)
Recipiente de presión de fondo redondo	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	SYNP170004-1EA
Microscopía electrónica de barrido	Compañía FEI (Hillsboro, EE. UU.)	Helios Nanolab 600 FEI de doble haz
cloruro de sodio y nbsp;	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	71376
Ditionita sódica	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	71699-250G
Dodecilo sulfato de sodio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	L4509-100G
Synthware y comercio; Recipiente de presión de fondo redondo	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	SYNP170003
Tert-butilo nitrito	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	20370-100ml-F
Tetrahidrofurano (99,7%)	VWR International (Sø borg, DK)	201022A004
Termoshaker	Grant Instruments (Cambridge) Ltd (Reino Unido)	PHMT-PSC18 (01012015020119)
Microscopía electrónica de transmisión	Compañía FEI (Hillsboro, EE. UU.)	FEI Tecnai T20
Trimetilsililazida	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	155071-10G
Sistema TSC HEMOX DAQ	CRP CIENTÍFICO TSC (PA, EE. UU.)		Software analizador Hemox
Ultrosound sonicator	Branson Ultrasonics Corporation (Danbury, EE. UU.)	SKU: 2410240003
Espectrofotómetro UV-Vis	Shimadzu (Kioto, JP)
Horno de vacío y nbsp;	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, EE. UU.)
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Reino Unido)	Número de serie. MAL1188530
Cloruro de circonio(IV)	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	357405-100G