La estimulación magnética de todo el cuerpo reduce la alimentación tipo atracón en un modelo ratón de trastornos alimentarios

Resumen

La estimulación magnética de todo el cuerpo (WB-EM) se utilizó en un modelo de alimentación tipo atracón que implicaba acceso intermitente a una dieta agradable. WB-MS redujo la admisión de forma transitoria durante la simulación sin alterar la entrada de comida. Aun así, los efectos no se mantuvieron, ya que el comportamiento tipo atracón reapareció tras el tratamiento, sin cambios en el peso, la adiposidad ni la expresión de accumbens c-Fos.

Resumen

La estimulación magnética de todo el cuerpo (WB-EM) se utilizó en un modelo de alimentación tipo atracón que implicaba acceso intermitente a una dieta agradable. WB-MS redujo la admisión de forma transitoria durante la simulación sin alterar la entrada de comida. Aun así, los efectos no se mantuvieron, ya que el comportamiento tipo atracón reapareció tras el tratamiento, sin cambios en el peso, la adiposidad ni la expresión de accumbens c-Fos.

Introducción

El atracón es un patrón de alimentación desregulado caracterizado por el consumo rápido de grandes cantidades de alimentos muy apetecibles en ausencia de hambre fisiológica. Es una característica central del trastorno por atracón (BED), una condición fuertemente asociada con la obesidad y la disfunción^{metabólica 1,2}. Cada vez hay más evidencia que pone de manifiesto el papel de los circuitos de recompensa mesolímbicos en la pérdida de control sobre el comportamiento^{alimentario 3,4}. La TEM se conceptualiza cada vez más como un trastorno de la señalización corticostrial alterada, en el que la comunicación desregulada entre los sistemas de control ejecutivo y relacionados con la recompensa favorece la ingesta compulsiva de alimentos. A nivel neurobiológico, la señalización dopaminérgica dentro de la vía mesolímbica, junto con las entradas glutamatérgicas, contribuye a una alteración de la saliencia de incentivos y a una motivación excesiva por alimentos agradables ^5,6. Además, señales metabólicas periféricas como GLP-1, insulina y grelina interactúan con estos circuitos para modular la valoración de la recompensa y el comportamiento^{alimenticio 7}. Evidencias recientes indican además que el comportamiento tipo atracón está asociado con cambios en la dinámica neuronal dentro del NAc, incluyendo oscilaciones de baja frecuencia en los rangos delta y theta (2–8 Hz), que se han relacionado con estados de anticipación y antojos de recompensa previos a la pérdida de control⁸.

El NAc actúa como un centro integrador que conecta los sistemas límbico, cortical y motor, traduciendo señales motivacionales en comportamientos orientados a objetivos. La alteración de este sistema, especialmente bajo exposición repetida a alimentos agradables, favorece patrones compulsivos y de hábito de ingesta ^9,10. Los modelos experimentales que utilizan el acceso intermitente a alimentos palatables inducen de forma fiable atracones se asocian con una mayor activación del NAc, apoyando su papel en el comportamiento de alimentación^{compulsiva 11–14}. La neuromodulación no invasiva se refiere a técnicas que alteran la actividad cerebral sin intervención quirúrgica, incluyendo enfoques basados en campo magnético como la estimulación magnética^{transcraneal 15}. Estas estrategias han adquirido relevancia clínica por su capacidad para modular la excitabilidad neuronal y la actividad de redes en trastornos^{neuropsiquiátricos 16,17}. En humanos, se ha demostrado que la neuromodulación reduce los síntomas de atracón y mejora el control conductual, además de influir en la regulación^{metabólica 18,19}.

Según esta evidencia, la estimulación magnética de todo el cuerpo (WB-EM) podría representar un enfoque terapéutico no invasivo capaz de modular los circuitos implicados en la alimentación compulsiva. A diferencia de las técnicas focales, los campos magnéticos de baja frecuencia pueden influir en la excitabilidad neuronal y las redes cerebrales distribuidas, lo que sugiere un posible impacto en estructuras subcorticales como^{NAc 8}. Estudios experimentales han demostrado que tales campos modulan la neurotransmisión dopaminérgica y glutamétrica 6,7,8,19, proporcionando un mecanismo plausible para influir en circuitos relacionados con la recompensa. Sin embargo, sus efectos sobre el comportamiento de comer similar a los atracones siguen siendo desconocidos. Por ello, el presente estudio evaluó los efectos de la esclerosis múltiple de baja frecuencia en un modelo murino de atracón similar a los atracones inducidos por el acceso intermitente a alimentos agradables, evaluando la ingesta de alimentos, el peso corporal, la adiposidad y la expresión de c-Fos en el NAc.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo conforme al Estándar Oficial Mexicano para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NOM-062-ZOO-199) y fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL) de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), bajo el protocolo número 035-CIC-2023. Todos los materiales utilizados en el estudio se mencionan en la Tabla de Materiales.

Definición y adquisición de población

Se utilizaron un total de 30 ratones C57BL/6 ratones (9 hembras y 21 machos) en el día 30 (P30), con un peso corporal inicial de 15–18 g. Los ratones se alojaron individualmente en jaulas domésticas bajo condiciones ambientales controladas: un ciclo de luz y oscuridad de 12:12 h (luces encendidas a las 6:00 a.m.), una temperatura ambiente de 23 ± 2 °C y una humedad relativa de 70 ± 10%.

Habituación

A P30, los animales fueron alojados individualmente en jaulas domésticas con acceso improvisado a agua y alimento estándar. Todas las jaulas se enriquecieron ambientalmente con tubos de cartón y se usaron virutas de madera como cama. Durante el periodo de habituación de 7 días, se registraron peso corporal, ingesta de alimentos y consumo de agua cada 24 horas.

Consumo tipo atracón

El modelo experimental utilizado en este estudio se basa en el paradigma de atracón intermitente descrito por los investigadores¹⁴. Antes de la asignación por grupo, todos los animales se llevaron a un peso corporal medio comparable (17 g) para reducir la variabilidad basal. Los animales (N = 30) fueron asignados aleatoriamente a grupos experimentales usando una herramienta digital de "giro de la rueda", en la que se listaban y asignaban secuencialmente a uno de los tres grupos. El grupo estándar incluía hembras (grupo femenino estándar, SFG; n = 3) y machos (grupo masculino estándar, SMG; n = 7), que tenían acceso continuo a comida y agua estándar. El grupo de acceso continuo incluía hembras (grupo femenino continuo, CFG; n = 3) y machos (grupo masculino continuo, CMG; n =7) con acceso continuo ad libitum a comida estándar, agua y alimentos palatables (M&M's). El grupo de acceso intermitente incluía a mujeres (grupo de mujeres intermitentes, IFG; n =3) y a hombres (grupo de hombres intermitentes, IMG; n = 7), que tenían acceso ad libitum a comida y agua estándar, y que tenían acceso a alimentos sabrosos tres veces por semana (lunes, miércoles y viernes) durante 2 horas (de 16:00 a 18:00). Estas condiciones de alimentación se mantuvieron durante 35 días.

Estimulación magnética de todo el cuerpo (WB-MS)

Este paradigma de estimulación se seleccionó basándose en estudios previos que utilizaban campos electromagnéticos de baja frecuencia (50 Hz, 1 mT) en ratones C57BL/6 bajo condiciones experimentales^{similares 20,21}. El WB-MS se realizó utilizando un dispositivo de magnetoterapia pulsada (Dhan 1000, unidad de magnetoterapia) que generaba un campo magnético sinusoidal alternante de 10 Gauss (1 mT) a 50 Hz. Para las sesiones de estimulación, los ratones permanecían alojados individualmente en sus jaulas de casa, que se colocaban entre dos placas electromagnéticas a lados opuestos de cada jaula. Para evitar interferencias de campo magnético, los componentes metálicos, incluyendo la jaula de alambre, la rejilla y la botella de agua, se retiraron temporalmente durante la estimulación. Esta configuración permitía a los animales moverse libremente durante todo el procedimiento sin sujeciones ni estrés adicional.

Para asegurar la consistencia experimental, se mantuvieron condiciones de manipulación y ambientales idénticas tanto durante las sesiones de estimulación como de no estimulación. Durante las sesiones de control (días 15–21), las placas magnéticas se posicionaron de forma idéntica pero permanecieron inactivas, controlando así los posibles efectos del manejo, la manipulación de jaulas, el ruido ambiental o la colocación de placas electromagnéticas.

La WB-MS consistió en exposiciones diarias de 20 minutos desde las 15:40 hasta las 16:00 durante siete días consecutivos (días 22–28 del protocolo experimental), justo antes del periodo de evaluación de la alimentación tipo atracón (16:00–18:00). Del día 29 al 35, los ratones volvieron a ser sometidos a sesiones sin estimulación, tras las cuales se evaluó su ingesta de alimento.

Recogida de tejido adiposo

Al finalizar el protocolo experimental (día 36, 8:00 a.m.), se recogió tejido adiposo de todos los grupos experimentales. El SG estaba formado por tres mujeres y dos machos (n = 5), el CG por tres hembras y tres machos (n = 6), y el IG por tres hembras y cuatro machos (n = 7). Todos los animales fueron anestesiados con ketamina (60 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg⁾²², y la ausencia de una respuesta nociceptiva a la estimulación por pellizcos en los dedos confirmó una profundidad adecuada de anestesia. A continuación, se realizó una incisión ventral en la línea media utilizando una hoja de bisturí nº 3, que se extiende a través de las regiones abdominales subcostales, inguinales y medianas, seguida de una suave retracción lateral de la piel para exponer la cavidad abdominal.

Los depósitos de tejidos adiposos de gonadál, retroperitoneal y subcutáneo fueron identificados, diseccionados y extirpados cuidadosamente bajo condiciones estandarizadas para minimizar la variabilidad entre muestras. Inmediatamente después de la disección, los tejidos se pesaron utilizando una balanza analítica calibrada (capacidad máxima 220 g, legibilidad 0,1 mg), verificada previamente según las especificaciones del^{fabricante 23}. Todas las muestras se procesaron bajo condiciones idénticas entre los grupos para garantizar la consistencia experimental.

Preparación del tejido cerebral e inmunofluorescencia

Los ratones fueron eutanasiados 90 minutos después de la última sesión de consumo^{de alimentos, 24}. Se recogieron cerebros tras una perfusión intracardíaca con paraformol al 4% y posteriormente se procesaron para análisis histológico. Las secciones coronales del cerebro (30 μm) se obtuvieron mediante un criostato mantenido a −18 °C y almacenado en PBS que contenía azida de sodio hasta el procesamiento. Se asignó un subconjunto de animales machos de cada grupo experimental a la preparación del tejido cerebral para análisis de inmunofluorescencia (SG, n = 4; CG, n = 4; IG, n = 4), mientras que los demás animales se utilizaron para la recogida de tejido adiposo. Esta asignación diferencial se determinó a priori según los requisitos metodológicos, ya que la perfusión intracardíaca con paraformaldehído resulta en una fijación tisular incompatible con la posterior extracción de tejido adiposo debido a la alteración de la integridad del tejido adiposo. Por lo tanto, la distribución de las muestras estaba determinada exclusivamente por restricciones técnicas y era independiente de la asignación experimental de grupos o de los resultados biológicos.

Para la inmunofluorescencia de c-Fos, se incubaron secciones durante 72 horas con un anticuerpo monoclonal anti-c-Fos de ratón (1:1000, sc-166940) diluido en PBS que contenía 0,25% de gelatina de piel de cerdo y 0,5% de Triton X-100, que sirvió como solución de bloqueo y permeabilización. Se realizó incubación primaria de anticuerpos durante 24 horas a temperatura ambiente, seguida de 48 horas a 4 °C. Tras la incubación, las secciones se enjuagaron a fondo en PBS e incubaron durante 2 horas con un anticuerpo secundario anti-ratón policlonal de burro (conjugado con Alexa Fluor 488, 1:500, AB_2338840) diluido en la misma solución. Finalmente, las secciones se montaron sobre correderas de cristal usando medio de montaje.

Adquisición y cuantificación de imágenes

La imagen confocal se realizó utilizando un microscopio equipado con un láser de 488 nm y una lente objetivo de 20x. Las imágenes Z-stack se adquirían usando el software NIS-Elements C y se almacenaban bajo identificadores codificados para análisis ciego. La cuantificación de núcleos positivos en c-Fos se realizó utilizando ImageJ (ImageJ 2.9.0 / 1.53t). Solo se incluyeron núcleos completamente contenidos en los conteos, y se aplicó un enfoque basado en cuadrantes para evitar el doble conteo de células individuales. Para cada animal, se obtuvo una imagen de cada una de las tres secciones inmunotinzadas independientes utilizando parámetros de adquisición idénticos en todos los grupos experimentales. El número de núcleos positivos en c-Fos se cuantificó individualmente para cada imagen, y se sumaron los valores obtenidos de las tres secciones correspondientes al mismo animal. Este valor total fue posteriormente normalizado al área total analizada y expresado como densidad c-Fos (núcleos positivos/mm²). El esquema general de los procedimientos experimentales utilizados se ilustra en la Figura 1A–H.

Figura 1: Diseño experimental y cronología del protocolo de atracones y la intervención en BM-EM. (A) muestra una imagen representativa de un ratón que indica las condiciones iniciales de vivienda. Un total de 30 ratones (9 hembras y 21 machos) fueron alojados individualmente en jaulas domésticas a partir de P30 y pasaron por un periodo de hábito de 1 semana. (B) ilustra las condiciones dietéticas implementadas a lo largo del protocolo de atracón desde el día experimental 1 hasta el día 35. El grupo de control tenía acceso improvisado a comida y agua estándar. Los grupos de acceso continuo tenían acceso improvisado a comida estándar, agua y alimentos agradables. Los grupos de acceso intermitente tenían acceso improvisado a comida y agua estándar. Al mismo tiempo, la comida agradable solo se proporcionaba los lunes, miércoles y viernes de 16:00 a 18:00 (C). Lo que indica que desde los días 15 hasta el 21, los animales continuaron bajo las mismas condiciones dietéticas mientras que placas magnéticas de estimulación se colocaban bajo las jaulas sin proporcionar estimulación (exposición simulada). (D) muestra que del día 22 al 28, se administró la WB-MS 20 minutos antes de la exposición a alimentos agradables, manteniendo las condiciones dietéticas correspondientes para cada grupo. (E) indica que desde los días 29 hasta 35 se suspendió la leuco-EM, aunque las condiciones dietéticas permanecieron sin cambios. (F) muestra que los cerebros se recogieron en el día postnatal 72 (P72), seguido por la recogida de tejido adiposo en el día postnatal 73 (P73). (G) ilustra la sección cerebral mediante un criostato y procedimientos inmunohistoquímicos. Finalmente, (H) muestra el análisis de microscopía confocal de la inmunorreactividad c-Fos. Las imágenes fueron creadas por los autores usando Biorender, y se ha obtenido una licencia adecuada. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Análisis estadístico

Se realizaron análisis estadísticos utilizando la versión 25 de SPSS. Dado que no se pudo asumir una distribución normal, se utilizaron pruebas no paramétricas a lo largo del estudio. Se evaluaron las diferencias entre SG, CG e IG utilizando la prueba de Kruskal–Wallis. Se analizaron comparaciones repetidas dentro de cada grupo experimental utilizando la prueba de Friedman, seguidas de pruebas de comparación múltiple cuando era apropiado. Debido a tamaños limitados de muestra para ciertos criterios experimentales, especialmente en hembras (n = 3 por grupo), los datos de ratones machos y hembras C57BL/6 se agruparon para los análisis presentados en las Figuras 2, Figura 3 y Figura 4 , con el fin de mejorar la robustez estadística y apoyar una evaluación exploratoria de los resultados experimentales. Además, se analizaron datos combinados de ingesta tipo atracón de ratones C57BL/6 machos y hembras utilizando una ANOVA bidireccional, seguidos de pruebas de comparaciones múltiples para evaluar los efectos del grupo experimental y el tiempo durante el protocolo de alimentación, incluida la semana de estimulación WB-MS. La significación estadística se definió como p ≤ 0,05.

Resultados

Durante el atracón, los sujetos de los grupos de acceso intermitente (IMG para hombres, IFG para mujeres) mostraron una ingesta calórica significativamente mayor que los de los grupos estándar (SFG y SMG) y continuo (CFG y CMG) en los días 15, 17 y 19 (test de Kruskal-Wallis; p < 0,05; Figuras 2A–B). La WB-MS se administró con una intensidad de 1 mT y una frecuencia de 50 Hz durante 20 minutos al día durante siete días consecutivos,...

Discusión

Los hallazgos actuales sugieren que la WB-MS puede modular de forma transitoria el comportamiento de la alimentación tipo atracón en un modelo murino inducido por el acceso intermitente a alimentos agradables. Aunque no se detectaron cambios significativos en la actividad neuronal en el NAc, la ingesta de alimentos agradables disminuyó progresivamente durante las sesiones de acceso intermitente durante el periodo de estimulación, culminando en una disminución significativa durante la últ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ImageJ	imagej.net	Dominio Público, BSD-2	Software. Programa de procesamiento de imágenes basado en Java. Desarrollado en los Institutos Nacionales de Salud y el Laboratorio de Instrumentación Óptica y Computacional (LOCI, Universidad de Wisconsin)
Coverslips	Corning	2935	Portaobjetos de vidrio 24 x 50 mm (Espesor 0.13–0.17)
Secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	AB_2340758	Anticuerpo secundario policlonal de asno anti-ratón
Laboratory Rodent Diet 5001	LabDiet	1320	Comida estándar. https://di.facmed.unam.mx/comisiones/Composición%20del%20alimento%20Laboratory%20Rodent%20Diet%205001.pdf
Leica CM1510 S	Leica	CM1510 S	Criostato para histología de rutina.
M&Ms 43.8g (Empaquetado marrón)	M&M´s	NA	Comida apetecible. Contenido nutricional por 100 : 480 kcal, 19 g de grasa, 70 g de carbohidratos, 5.1 g de proteína, 0.13 g de salIngredientes: azúcar, masa de cacao, leche desnatada en polvo, manteca de cacao, lactosa, almidón, grasa de leche, grasa de palma, jarabe de glucosa, manteca de karité, estabilizador (goma arábiga), dextrina, agentes de glaseado (cera de abejas, cera de carnauba), colorantes (E100, carmín, E132, E133, E150a, E150c, E150d, E153, E160a, E160e, E162, E163, E170), concentrado de remolacha, emulsionantes (lecitina de soja, E445), sal, aromas, aceite de palma en grano, antioxidante (E306). (Puede contener: maní, avellana, almendra). El chocolate con leche contiene un mínimo del 14% de sólidos de leche. El chocolate con leche contiene grasas vegetales además de la manteca de cacao.
Dhan 1000	Magnetoterapia SA de CV	MAG1000	Dispositivo de magnetoterapia pulsada
PBS	MEYER	Monobásico 2415. Dibásico 2410.  NaCl S3014	Monohidrato de fosfato sódico monobásico . Fosfato sódico dibásico heptahidrato. Cloruro de sodio cristalino grado de biología molecular.
Microscopio Nikon	Nikon Instruments, Inc	A1R+ STORM	Microscopio confocal
Jaula para ratones de policarbonato	Orchid Scientific	EM01	Jaula de policarbonato no ferromagnética utilizada para la exposición a WB-MS, totalmente transparente y autoclave (373 x 190 x 138 mm).
Anesket	Pisa	040.000.0226.00	Solución inyectable de ketamina
Procin Equus	Pisa	Q-7833-111	Solución inyectable de xilacina
c-Fos antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-166940	Anticuerpo monoclonal de ratón anti-c-Fos
Báscula de laboratorio	Sartorius		Báscula analítica
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10	El medio de montaje antifade está especialmente formulado para preservar las señales de fluorescencia en microscopía de inmunofluorescencia (IF) minimizando el fotoblanqueo.
Diapositivas de vidrio	VELAB	VE-P30	Diapositivas de microscopio de vidrio con un lado bruñido de 26 x 76 mm (Espesor 0.8–1.1 mm)
Aziuro de sodio		K 6048.0100	Aziuro de sodio al 99%