Aislamiento eficiente de células madre y adipocitos derivados del adiposo a partir de tejido adiposo porcino

Resumen

Aquí presentamos un método estándar para aislar de forma eficiente células madre y adipocitos derivados del adiposo, caracterizado por una reducción del > del 90% en el tiempo de procesamiento, alta viabilidad celular y amplia compatibilidad.

Resumen

Las células madre derivadas de la adiposa (ADSC) han surgido como células semilla ideales en la medicina regenerativa debido a sus abundantes fuentes, su cosecha mínimamente invasiva, su potencial de diferenciación multi-linaje y sus propiedades inmunomoduladoras. Sus aplicaciones abarcan la reparación de tejidos, la modelización de enfermedades y la terapia celular; sin embargo, el aislamiento eficiente de ADSC de alta viabilidad sigue siendo fundamental para avanzar en la investigación y la traducción clínica. Los métodos convencionales de aislamiento, como la digestión enzimática combinada con disociación mecánica mediante pipeteo, están limitados por tiempos de procesamiento largos (1–3 h), baja viabilidad celular (a menudo <70%) y una variabilidad considerable de lote a lote, lo que compromete los experimentos posteriores.

Aquí presentamos el sistema SoniConvert (un sistema mecánico de separación celular basado en ondas), que combina la digestión por ondas mecánicas y enzimática para abordar estos desafíos. El sistema integra una unidad de control basada en microprocesador que regula la disociación mediada por ondas mecánicas mediante retroalimentación digital, junto con un reactivo de afloja específico para tejido tisular optimizado para tejido adiposo (incubación de 5 a 15 minutos). Este enfoque permite la rápida conversión de tejido a una suspensión unicelular, completando la disociación mecánica en 3–9 segundos.

El sistema ofrece tres ventajas: (1) procesamiento ultrarrápido, con el proceso de aislamiento del núcleo —desde la digestión enzimática hasta la separación inicial de fracciones celulares— que se completa en aproximadamente 30 minutos (reducción >90% en comparación con los métodos convencionales); (2) alta preservación de la viabilidad, con la tinción de azul de tripán que confirma la viabilidad celular del 80–95%, superando los protocolos tradicionales; y (3) amplia compatibilidad, ya que las suspensiones unicelulares resultantes cumplen los requisitos de cultivo celular primario, citometría de flujo, ensayos de citotoxicidad y construcción de organoides adiposos. Al reducir el tiempo de procesamiento, mejorar la integridad celular y limitar la variabilidad, este sistema proporciona una plataforma práctica para la investigación relacionada con la adiposa.

Introducción

Las células madre derivadas del adiposo (CADA), un subconjunto crítico de células madre mesenquimales (CMS) aisladas del tejido adiposo, presentan un potencial terapéutico considerable debido a su accesibilidad, extracción mínimamente invasiva, robusta capacidad proliferativa, potencial de diferenciación multi-linaje y potentes propiedades paracrinas e^{inmunomoduladoras} 1,2,3,4 . Estas cualidades han posicionado a los ADSC como candidatos prometedores para la medicina regenerativa, la ingeniería tisular y la inmunoterapia. Sin embargo, la utilidad traslacional de los ADSC depende de la capacidad de aislar poblaciones funcionalmente intactas y de alta pureza, un proceso que sigue siendo técnicamente desafiante. La biología única del tejido adiposo introduce dos obstáculos principales: (1) el alto contenido lipídico de los adipocitos los hace propensos a la ruptura durante el procesamiento mecánico, liberando lípidos libres que contaminan la fracción vascular estromal (SVF) y comprometen la viabilidad y rendimiento celular ^5,6; y (2) la complejidad estructural del tejido, que comprende fascia, células endoteliales, células inmunitarias y componentes^{sanguíneos 7}, complica la separación de las células derivadas de la adiposa. Estas limitaciones subrayan la urgente necesidad de un método eficiente, rápido y que preserve la viabilidad para aislar ADSC y adipocitos de alta calidad, que son igualmente críticos para aplicaciones posteriores como la modelización de enfermedades metabólicas y terapias basadas en células.

Actualmente existen varios métodos establecidos para aislar células derivadas del adiposo, incluyendo la digestión enzimática, el cultivo de explantaciones y la separación^{mecánica 8,9,10}. La digestión enzimática, el enfoque más adoptado, emplea colagénasa para degradar componentes de la matriz extracelular (ECM), liberando células madre encapsuladas. Este método suele implicar la picada de tejidos, digestión con colagénasa (37 °C, 1–2 h), aislamiento de SVF mediante centrifugación y purificación de cultivos adherentes. Aunque eficaz para la descomposición de la MEC, la digestión enzimática presenta inconvenientes notables: tiempo de procesamiento prolongado (3–4 horas en total), dependencia de grandes volúmenes de muestra y riesgos de citotoxicidad enzimática o variabilidad de lote a lote por colagénasas de origen animal, todo lo cual dificulta la traducción clínica. El cultivo explantado, que aprovecha la migración de células madre a partir de fragmentos de tejido, produce células con viabilidad preservada pero sufre de bajo rendimiento y recuperación celular retrasada (7–10 días). La disociación mecánica, que depende de la disrupción física (por ejemplo, oscilación, cizallamiento), reduce el tiempo de procesamiento pero a menudo compromete la integridad celular, lo que conduce a una menor viabilidad y a poblaciones impuras. En conjunto, estos métodos no logran reconciliar eficiencia, pureza y viabilidad, criterios críticos para el aislamiento celular de grado clínico. Por ello, proponemos un método novedoso para aislar células derivadas del adiposo (adipocitos y ADSC) que combina la digestión enzimática con la disociación mecánica mediada por^{ondas 11}. Este enfoque logra dos avances clave: (1) eficiencia temporal: al combinar cócteles enzimáticos preoptimizados y libres de animales con ondas mecánicas de baja frecuencia, el tiempo total de procesamiento se reduce de 3–4 horas a ~30 minutos (Figura 1); (2) Preservación de la viabilidad: la dispersión mecánica suave minimiza la ruptura de adipocitos y la liberación de lípidos. Es importante destacar que el periodo de 30 minutos se refiere al flujo de trabajo de aislamiento central (digestión, disociación mecánica, filtración y centrifugación inicial) para obtener fracciones de adipocitos y SVF crudos; los pasos opcionales de purificación posterior, como la lisis de glóbulos rojos (RBC), requieren tiempo adicional de manipulación.

Nuestro método optimizado de aislamiento de células adiposas demuestra un potencial significativo para su aplicación en múltiples ámbitos de investigación y clínicos. En la investigación fundamental, las células de alta viabilidad obtenidas muestran un rendimiento excepcional en estudios de diferenciación adipogénica y osteogénica, proporcionando una fuente celular fiable para aplicaciones de ingeniería de tejidos. En medicina traslacional, los estudios clínicos han demostrado el potencial terapéutico de las ADSC para tratar condiciones como la^{osteoartritis 12}, enfermedades^{cardiovasculares 13}, esclerosis^{múltiple 14} y enfermedad inflamatoria intestinal (EII)/enfermedad^{de Crohn 15}. Los ADSCs rápidamente aislados sirven como bloques de construcción ideales para construir organoides de tejido adiposo e implementar aplicaciones de terapia celular, avanzando significativamente en la investigación en cribado de fármacos y modelado de enfermedades. Además, las suspensiones unicelulares de alta calidad son adecuadas para la secuenciación de ARN unicelular. En conclusión, este enfoque integrado establece una plataforma tecnológica robusta para el tejido adiposo, apoyando tanto la investigación básica como la traducción clínica en medicina regenerativa.

Protocolo

Toda la investigación animal se llevó a cabo de acuerdo con el Reglamento para la Administración de Asuntos Relacionados con Animales Experimentales (Ministerio de Ciencia y Tecnología de China, revisado en marzo de 2017), y fue aprobado por el Comité de Ética y Bienestar Animal de la Universidad Agrícola de Sichuan (Número de permiso: 20230089). Este protocolo requiere el uso del sistema SoniConvert, un dispositivo comercial disponible para la disociación tejidos asistida por ondas mecánicas (en adelante denominado sistema de disociación mecánica). El protocolo está optimizado para tejido adiposo porcina, y su dependencia de este equipo especializado es una limitación clave.

1. Recogida y preparación del tejido adiposo

1. Desinfección y depilación preoperatoria
   1. Eutanasiar al cerdo mediante una sobredosis intravenosa de pentobarbital sódico (100 mg/kg de peso corporal). Confirma la muerte antes de la recogida de tejido.
   2. Aplicar gasas estériles remojadas en iodóforo al 2% para la desinfección en espiral del dorso porcina, extendiéndose 15 cm desde la línea media. Deja secar durante 30 s.
   3. Usa una maquinilla estéril para afeitar el pelo de un área de 16 cm × 8 cm. Asegúrate de que se elimine todo el vello de la zona operativa.
   4. Limpia la parte trasera dos veces con etanol al 75% usando gasas estériles.
2. Recogida de tejido adiposo
   1. Haz una incisión transversal de 20 cm a lo largo de la línea media dorsal con un bisturí estéril.
   2. Levanta el borde de la incisión con pinzas estériles. Disecar a lo largo del plano natural entre el tejido adiposo y la dermis para obtener una capa superior completa de tejido adiposo subcutáneo dorsal (ULB) de aproximadamente 2–3 mm de grosor.
   3. Enjuaga el ULB una vez en solución fisiológica estéril bien fría y colócalo en un recipiente de cultivo estéril (Figura 2).

Figura 2: Recogida de ULB de cerdo para aislamiento celular. (A) Ilustración de la estructura del tejido adiposo del dorso de cerdo; (B) Lugar de corte del Bama minipig; (C) Presentación del tejido adiposo dorsal, la adiposa subcutánea de la espalda de cerdo contiene dos capas, la capa superior (ULB) y la capa interna (ILB); (D) Recogió ULB. Abreviatura: ULB = capa superior de la espalda; ILB = capa interna de la espalda. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Punto de pausa: El tejido adiposo recogido puede mantenerse en solución estéril de solución fisiológica o D-Hanks fría a 4 °C durante un corto periodo antes de una disección adicional.
NOTA: El objetivo es recoger la ULB. Evita incluir la capa inferior del tejido adiposo subcutáneo de la espalda (ILB) durante la disección.

3. Disección y limpieza del tejido adiposo
   1. Añade 10 mL de D-Hanks Buffer bien frío por cada 1,8 g de papel en la bandeja y asegúrate de que el tejido esté completamente sumergido.
   2. Identifica y extirpa todos los vasos sanguíneos visibles del tejido utilizando tijeras quirúrgicas estériles. Elimina cualquier tejido conectivo y componentes fibróticos. Desecha los materiales extirpados en contenedores designados como biohazard.
      NOTA: Ten extrema precaución al manipular instrumentos afilados; Siempre corta el cadáver y desecha las cuchillas y tijeras usadas en recipientes para objetos afilados inmediatamente después de usarlas.
   3. Enjuaga el tejido dentro del D-Hanks Buffer para eliminar la sangre y los restos residuales.
      NOTA: Para muestras con hematoma excesivo, sustituya el tampón 1–3 veces según sea necesario para lograr claridad visual. Mantén todos los pasos de disección sobre hielo para preservar la viabilidad del tejido.
4. Disociación mecánica del tejido adiposo
   1. Transfiere 1,8 g de los fragmentos de tejido enjuagados a un tubo microcentrífuga estéril de 1,5 mL. Añade 800 μL de buffer de disociación tisular tipo A (buffer A) al tubo.
   2. Con tijeras oftálmicas estériles, pica el tejido del tubo en pequeños trozos de aproximadamente 1–2^{mm 3} de tamaño.
      NOTA: Si se observan fugas lipídicas significativas durante o después de la picada, lave el tejido nuevamente con 1 mL de solución de D-Hanks preenfriada antes de proceder a la digestión enzimática para eliminar lípidos de los adipocitos rotos. Este paso preserva la integridad de los adipocitos para el análisis posterior.

2. Aislamiento celular y homogeneización

1. Procesamiento enzimático
   1. Añadir 200 μL del Agente de Disociación de Tejidos de Tipo A (Solución de Tipo A) a un nuevo tubo microcentrífuga. Gira y agita suavemente el tubo a mano 3 veces para mezclar el contenido y asegurarte de que los fragmentos adiposos estén completamente sumergidos en la solución de disociación.
   2. Verifica que la tapa del tubo esté bien cerrada. Coloca el tubo en un baño metálico a 37 °C e incuba durante 5–10 minutos.
      NOTA: Monitoriza la solución hasta que se vuelva turbia y los fragmentos de tejido parezcan parcialmente digeridos. La solución tipo A contiene colagénasa y proteasa neutra. Lleva guantes de nitrilo, bata de laboratorio y gafas de seguridad al manipularlo. Evita el contacto con la piel; Si hay exposición, enjuaga inmediatamente con abundante agua durante 15 minutos. El A-Buffer no se descartará tras añadir la Solución Tipo A.
2. Disociación mecánica asistida por ultrasonidos
   1. Transfiere los fragmentos de tejido adiposo parcialmente digeridos junto con el tampón circundante desde el tubo de microcentrífuga a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL designado para el sistema de disociación mecánica.
   2. Ejecuta el programa preestablecido para tejido adiposo en el sistema de disociación mecánica para realizar la disociación mecánica usando una onda sinusoidal de 200 Hz.

3. Filtración para obtener una suspensión de celda única

1. Filtración y centrifugación
   1. Recoge la suspensión celular y pásala a través de un colador de 200 μm hasta un nuevo tubo centrífugo de 50 mL para eliminar grandes restos y grumos de tejido no digerido.
   2. Añade 5 mL de solución D-Hanks preenfriada (4 °C) al colador. Enjuaga el colador con la solución D-Hanks dos veces para maximizar el rendimiento de la celda.
   3. Centrifuga la suspensión de celda filtrada a 500 × g durante 5 minutos a 4 °C.
      Punto de pausa: Tras la centrifugación, la suspensión de la celda puede procesarse inmediatamente o mantenerse en hielo durante un corto tiempo antes de separar la capa.
   4. Recogida de adipocitos: Para recoger los adipocitos, aspirar y eliminar la capa lipídica sobrenadante utilizando una pipeta pasteur estéril, dejando 1 mL de tampón para proteger la capa de adipocitos. Recoger la segunda capa para el análisis posterior de los adipocitos. Evita molestar la tercera y cuarta capa.
   5. Recogida de SVF (fracción vascular estromal): Tras retirar las capas superiores, resuspende suavemente el pellet inferior que contiene la fracción vascular estromal (SVF) en 1 mL de D-Hanks/PBS. Resuspende suavemente el pellet celular en 1 mL de D-Hanks/PBS para lograr una concentración celular de 2–5 × 10⁶ células/mL.
      NOTA: Idealmente, se pueden observar cuatro capas tras centrifugar: la capa lipídica en la parte superior; la segunda capa contiene adipocitos; la tercera es la capa tampón hidrofílica; y la capa inferior es la SVF, que contiene células madre (Figura 1).
2. Lisis de glóbulos rojos
   1. NOTA: Si el pellet celular presenta un color rojo significativo, indicando contaminación por glóbulos, realice la lisis de glóbulos.
      Resuspende el pellet celular en 1–3 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) usando una pipeta P1000 con puntas de ancho. Incuba en hielo durante 15 minutos con mezcla ocasional.
   2. Preenfriar todas las soluciones y centrifugar los rotores a 4 °C para minimizar la actividad metabólica durante el procesamiento.
   3. Centrifugar a 500 × g durante 10 minutos a 4 °C. Aspira completamente el sobrenadante.
   4. Lava las células una vez más resuspendiendo el pellet en 5 mL de solución de D-Hanks preenfriada y centrifuga a 500 × g durante 5 minutos a 4 °C. Descarta el sobrenadante.
3. Resuspensión final
   1. Resuspende el pellet de celda final en D-Hanks/PBS para aplicaciones posteriores.

4. Aplicaciones y análisis aguas abajo

1. Viabilidad de las células SVF y evaluación del rendimiento celular
   1. Prepara la suspensión de celda SVF obtenida en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Mantén la suspensión en hielo hasta que la uses.
   2. Mezclar 10 μL de la suspensión de la celda SVF con 10 μL de solución de azul de tripán al 0,4% en un tubo de microcentrífuga estéril de 0,5 mL. Pipetea suavemente arriba y abajo 3 veces para asegurar una mezcla uniforme.
      NOTA: La concentración final de azul de tripán en la mezcla es del 0,2%. Evita introducir burbujas de aire durante la mezcla, ya que pueden interferir con el conteo automático de celdas.
      Transfiere 10 μL de la mezcla de celdas teñidas a una lámina de conteo adecuada para el contador automático de celdas. Asegúrate de que la muestra llene completamente la cámara sin desbordamiento.
   3. Inserta la diapositiva de conteo en el Contador de Celdas. Selecciona el tipo de ensayo Trypan Blue y ajusta el rango de concentración celular si es necesario.
   4. Pulsa el botón Contar para iniciar el recuento automático de celdas. El instrumento capturará imágenes de la cámara de conteo y distinguirá automáticamente las células vivas de las muertas.
   5. Registra el porcentaje de viabilidad de las células y cuenta el número total de celdas viables que aparecen en la pantalla del instrumento. Realizar tres mediciones independientes para cada muestra y calcular la viabilidad media y el rendimiento celular por gramo de tejido adiposo.
      NOTA: Limpia la lámina de conteo y el puerto de carga de instrumentos con etanol al 70% tras cada uso para evitar contaminación cruzada entre muestras.
2. Observación de la morfología de los adipocitos
   1. Teñe los adipocitos aislados con 5 μg/mL de Hoechst para núcleos y 1 μM de BODIPY para lípidos en D-Hanks/PBS durante 15 minutos a 37 °C.
      Punto de pausa: Tras la tinción, las muestras deben tomarse con rapidez; si es necesario, pueden mantenerse protegidos de la luz a 4 °C durante un corto tiempo antes de la microscopía.
   2. Utiliza un sistema de vidrio con tapa de portaobjetos adaptado a los adipocitos para preparar las láminas y evitar la compresión de las células.
   3. Observa los núcleos (teñidos con Hoechst) y las gotas lipídicas (teñidas con BODIPY) bajo un microscopio de fluorescencia.
      NOTA: Debido al gran tamaño (20–300 μm) y al alto contenido de lípidos, los adipocitos son frágiles, tienden a flotar y a apilarse en múltiples capas, lo que hace que los métodos de montaje convencionales no sean adecuados para la observación microscópica clara (Figura 3A). Para solucionar esto, se desarrolló un sistema de montaje casero compatible con adipocitos utilizando correderas y cubiertas estándar (Figura 3B).
3. Purificación de componentes vasculares estromales y observación morfológica de los ADSC
   1. Siembra el SVF recién aislado en un matraz de cultivo celular T25 que contenga 5 mL de DMEM suplementado con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina. Incubar a 37 °C con un 5% de CO₂.
   2. Después de 48 horas, lava suavemente el matraz dos veces con PBS precalentado para eliminar las células no adherentes. Añade medio fresco de cultivo y continúa incubando.
   3. Cambia el medio de cultivo cada 2–3 días. Monitoriza la morfología y confluencia celular bajo un microscopio invertido.
   4. Cuando las células alcanzan una confluencia del 80–90% (normalmente después de 7–10 días), se desprenen usando tripsina-EDTA al 0,25% durante 3–5 minutos a 37 °C. Neutraliza con medio de cultivo y recoge la suspensión celular.
   5. Realizar tinción con Trippan Blue para detectar la viabilidad de la célula antes de la detección y clasificación FACS.
   6. Observa la morfología de los ADSC purificados y cultivados bajo un microscopio óptico.
   7. Filtrar la suspensión de las celdas recogidas a través de un tamiz de 70 μm para eliminar cualquier agregado restante. Resuspender las células en PBS que contienen un 2% de FBS para el análisis FACS.
   8. Tiñe las células con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD73, CD90, CD11b y CD45 durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad.
   9. Lava las células dos veces con tampón de tinción y vuelve a suspenderlas en PBS que contenga un 2% de FBS.
   10. Realizar un análisis citométrico de flujo utilizando una boquilla de 70 μm a 20 psi y un caudal inferior a 3,0.
   11. Excluye los restos celulares mediante la compuerta de la población principal usando parámetros de área de dispersión frontal (FSC-A) y área de dispersión lateral (SSC-A).
   12. Eliminar dobletes mediante el gating FSC-A frente a FSC-H y seleccionar la población viable de singlets para análisis aguas abajo.
   13. Analizar células con gated basándose en la expresión de marcadores superficiales. Utiliza CD73 y CD90 como marcadores positivos y CD11b y CD45 como marcadores negativos para verificar el fenotipo ADSC.
   14. Observa la morfología de los ADSC enriquecidos y cultivados bajo un microscopio óptico. La morfología característica en forma de fuso y similar a fibroblastos indica un enriquecimiento exitoso del ADSC.
4. Diferenciación adipogénica ADSC
   1. Siembra la tercera generación de ADSC con una densidad de 1 × 10⁴ celdas/^{cm 2}. Cuando la confluencia celular alcanza aproximadamente el 90%, inicia la inducción adipogénica.
   2. Prepara el medio de inducción adipogénico utilizando el medio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco con alta glucosa, que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS), 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 μM de dexametasona, 10 μg/mL de insulina y 1 μM de rosiglitazona.
   3. Después de 3 días de inducción, sustituye el medio por medio de mantenimiento y cambia la solución cada 2 días.
   4. Tras 14 días de inducción, tiñe las células con aceite rojo O y observa las gotas lipídicas bajo un microscopio invertido.
5. Diferenciación osteogénica del ADSC
   1. Cuando la confluencia celular alcanza el 80–90%, comienza la inducción osteogénica. Formular el medio de inducción osteogénico con DMEM de alta glucosa que contenga 10% FBS, 10 mM β-glicerfosfato, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 μM de calcitriol y 1 μM de dexametasona.
   2. Cambia el medio cada 2–3 días y continúa el proceso de inducción durante aproximadamente 14 días.
   3. Tinte las células con 2% de Alizarina Roja S (pH 5,2) y obsérvalas bajo un microscopio invertido.
6. Construcción e identificación de organoides
   1. Preparar una suspensión monocelular de ADSC en medio de cultivo completo y ajustar la concentración celular a 2 × 10⁴ células/20 μL.
   2. Inverte la tapa de un plato de cultivo de 100 mm y dispensa 20 μL gotas de la suspensión de la celda sobre la superficie interna de la tapa.
   3. Añade PBS estéril en el fondo del recipiente para mantener la humedad, cubre la tapa con cuidado e incuba las gotas colgantes en condiciones estándar de cultivo.
   4. Observa las gotas a diario y deja que las células se agrupen y formen esferoides durante 6 días.
   5. Recoge los esferoides suavemente con una pipeta y transfiere a Matrigel preenfriado sobre hielo.
   6. Incrusta los esferoides en Matrigel y emplata la mezcla en placas de cultivo antes de incubarla bajo condiciones estándar de cultivo.
   7. Sustituye el medio regularmente y monitoriza el crecimiento de los organoides hasta los días 18–28, cuando las estructuras se compactan y maduran.
   8. Fijar los organoides con un 4% de paraformaldehído, permeabilizarlos con 0,1% de Triton X-100 y bloquear la unión inespecífica con un 5% de BSA.
   9. Incubar las muestras con anticuerpos primarios contra CD73, CD90, CD11b y CD45, y luego incubarlas con los anticuerpos secundarios fluorescentes correspondientes.
   10. Teñe los organoides con Hoechst y BODIPY para visualizar los núcleos y las gotas lipídicas, respectivamente, y observa las muestras teñidas bajo un microscopio de fluorescencia.
       NOTA: Realizar la clasificación celular y todas las manipulaciones que impliquen cultivos abiertos, incluyendo siembra, alimentación y preparación de tinción, bajo estrictas condiciones asépticas en un armario de bioseguridad.

Resultados

Figura 1: Ilustración esquemática del proceso de aislamiento celular derivado de la adiposa. El diagrama representa el método tradicional y el método actual como flujos de trabajo ilustrativos. Se implican tres pasos principales en el aislamiento de células derivadas del adiposo: el primero es el pretratamien...

Discusión

El presente estudio introduce un enfoque innovador y integrado para aislar células derivadas del adiposo (principalmente adipocitos y ADSC) que aborda limitaciones críticas de los métodos convencionales. Al combinar el aflojamiento enzimático específico de los tejidos con la disociación mecánica de ondas de precisión, este sistema logra un aislamiento celular rápido (tiempo total de procesamiento ~30 min), alta viabilidad (80–95%) y reproducible.

La digestión ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de Disociación de Tejidos Tipo A	Docsense	TM001	Contiene el agente de disociación tisular tipo A (solución tipo A) y el tampón de disociación tisular tipo A (buffer A).
Kit de Medio de Diferenciación Adipogénica	OriCell	GUXMD-90031	Utilizado para la diferenciación adipogénica, incluyendo el medio modificado de Eagle's de Dulbecco (sin modificar) y el medio de mantenimiento de alta glucosa
Alizarin Red S	OriCell	A5533ALIR-10001	Tinción mineralizada para diferenciación osteogénica (pH 5,2)
Ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A4544	Ácido L-ascórbico, cultivo celular analizado, para inducción osteogénica
Bama minipigs	Chengdu Dossy Animales Experimentales Co., Ltd		Animales machos de un año, de grado SPF, mantenidos bajo procedimientos estandarizados de vacunación, desparasitación y limpieza.https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863 04.html
Contador Automático de Celdas Bio-Rad TC20	Laboratorios Bio-Rad	1450011	Contador de celdas automatizado para la viabilidad y la evaluación de rendimiento
PEDY	Thermo Fisher Scientific	D3922	Tinte lipídico neutro
BSA (5%)	Sigma-Aldrich	A9418	Albúmina sérica bovina, polvo liofilizado, para bloquear
Calcitriol	Sigma-Aldrich	C9756	1&alfa, 25-Dihidroxivitamina D3, para inducción osteogénica
Tamiz celular (70 y mu; m)	Corning	352350	Falcon 70 y mu; Colador de células m, estéril, para la preparación de muestras FACS
Filtro celular (200 y mu; m)	pluriSelect	43-50200-03	pluriScolador, malla PET, encaja en tubos de 50 mL, estéril y nbsp;
tubo centrífuga (50 mL)	Corning	352098	Falcon 50 mL tubo cónico de alta claridad, estéril, polipropileno
Corredera de conteo (para Bio-Rad TC20)	Laboratorios Bio-Rad	1450011	Portaobjetos de conteo de doble cámara para contador automático de celdas TC20 y nbsp;
plato de cultivo (100 mm)	Corning	430167	Plato de poliestireno estéril, para formación de organoides en gotas colgantes
Dexametasona	Sigma-Aldrich	D4902	≥ 98%, para inducción adipogénica y osteogénica
Solución salina balanceada de D-Hanks o PBS	Gibco	10010015	Preenfriado a 4 °F; C, pH 7,4.
DMEM	Gibco	11965084	Se utiliza para el cultivo de SVF aislado y fresco
DNasa I	Beyotime	D7073	Opcional, recomendado si se observa agrupamiento.
etanol	Sigma-Aldrich	459836	75% para desinfección superficial.
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	A4736201	Sistema Tet aprobado, origen estadounidense, estéril y nbsp;
Citómetro de flujo	BD Biociencias	BD FACSCanto II	3 láseres (405 nm, 488 nm, 633 nm), 8 canales de fluorescencia, para análisis de marcadores superficiales (CD73, CD90, CD11b, CD45), se encuentra con 70 m requisito de tobera a 20 psi
microscopio de fluorescencia	Olimpo		Modelo invertido o vertical capaz de sistemas de filtros FITC y DAPI.
Anticuerpos secundarios fluorescentes	Thermo Fisher Scientific	A-11001 (anti-ratón), A-11008 (anti-conejo)	Alexa Fluor conjugado, para inmunofluorescencia
Anticuerpos conjugados con fluorocromo (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD Biociencias	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Para el análisis citométrico de flujo del fenotipo ADSC
Hoechst	Thermo Fisher Scientific	H3570	Tinción nuclear para evaluación de células vivas/muertas.
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879	≥ 99% (HPLC), para medio de inducción adipogénica
Solución fisiológica estéril helada	Baxter	2F7124	Inyección de cloruro de sodio al 0,9%, USP, para enjuague tejido
Insulina	Sigma-Aldrich	I9278	Recombinante, expresado en levaduras, para inducción adipogénica
Iodóforo	Sigma-Aldrich	25104	Solución desinfectante al 2%.
Matrigel	Corning	354230	Factor de crecimiento reducido, sin fenol rojo, para incrustar esferoides y nbsp;
Baño de Metal	Servicebio	SMB-H	Se usa para incubación a 37 °C.
Oil Red O	OriCell	OILR-10001	Tinción lipídica para diferenciación de adipocitos
Microscopio óptico	Olimpo		Microscopio estándar de campo claro con 10x y guion guion; 40x objetivos.
Kit de medio de diferenciación osteogénica	OriCell	GUXMD-90021	Utilizado para la diferenciación osteogénica, incluyendo el medio modificado de Dulbecco (sin modificar) y el medio de mantenimiento de alta glucosa
Pipeta P1000 con puntas de ánimo ancho	Beckman Coulter	B01113	Biomek P1000 Span-8 con puntas de ánimo, estériles
Paraformaldehído (4%)	Thermo Fisher Scientific	J61899	Solución acuosa, para fijar organoides
Pasteur Pipette	Corning	7095S-5C	Estéril, desechable.
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15070063	10.000 U/mL de penicilina, 10.000 y mu; g/mL estreptomicina, estéril y nbsp;
Pentobarbital sódico	Hikma Pharmaceuticals USA Inc.	24201-010-20	Inyectable, para eutanasia (100 mg/kg de peso corporal, intravenosa). ANDA 203619 y nbsp;
Anticuerpos primarios (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD Biociencias	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Para la inmunotinción organoide
Amortiguador de Lisis de Glóbulos Rojos (RBC)	Solarbio	R1010	Si es necesario para aplicaciones posteriores.
Centrífuga refrigerada	Eppendorf	5702R	Se utiliza para pasos de centrifugación a 4 °C.
Rosiglitazona	Cayman Chemical	71740	≥ 98%, PPAR y gamma; agonista para inducción adipogénica
Contenedor de objetos punzantes	Becton Dickinson	305270	Recipiente resistente a pinchazos para cuchillas y tijeras usadas
Sistema de preparación de suspensión de celda única SoniConvert	Docsense	SC-L1W	Se utiliza para la disociación mecánica de tejidos.
Amortiguador de tinción (Buffer de tinción por citometría de flujo)	eBiociencia (Thermo Fisher Scientific)	00-4222-57	200 mL, listo para usar, contiene FBS y azida de sodio al 0,09% como conservante, para dilución de anticuerpos y células, tinción superficial y pasos de lavado en citometría de flujo
Tubo Eppendorf estéril de 1,5 mL	Eppendorf	30121.517	Tubo microcentrífuga Safe-Lock, estéril, para la picada de tejidos
Plato de cultivo estéril	Corning	430167	Plato de cultivo estéril de 100 mm x 20 mm, para recogida de tejidos
Pinzas estériles	Sklar	96-1719	Pinzas estériles para el pulgar, dentadas, para el manejo de tejidos y nbsp;
Gasa estéril	Corporación de Dukal	7060033	Almohadillas de gasa estériles, para desinfección y limpieza
Tijeras oftálmicas estériles	Sklar	10023-580	Tijeras de resorte estilo Vannas, para picar tejido en 1-2 mm y sobre3; Piezas
Afeitadora estéril	3M	9681	Afeitadora de preparación quirúrgica, para la depilación del área operatoria
Bisturí estéril	Integra Miltex	4-415	Bisturí estéril desechable, para hacer incisiones
Tijeras quirúrgicas estériles	Sklar	10022-580	Tijeras de Iris Estériles Merit, para diseccionar vasos sanguíneos y tejido conectivo
Matraz de cultivo celular T25	Corning	430639	Matraz de cultivo de células Falcon T25, tapa ventilada, estéril
Triton X-100 (0,1%)	Sigma-Aldrich	T8787	Grado de laboratorio, para permeabilización y nbsp;
Trippan Blue	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15250061	Solución del 0,4% para el recuento de viabilidad celular.
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	0,25% tripsina, 1 mM de EDTA, para desprender ADSC
β-Glicerfosfato	Sigma-Aldrich	G9422	Sal disódica pentahidratada, para inducción osteogénica