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Artículo de método

Secuenciación de ARN unicelular del tejido pulmonar en un modelo de rata del síndrome de dificultad respiratoria aguda

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DOI:

10.3791/70491

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7 de abril de 2026

 ,  , 
1Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un protocolo estandarizado para el análisis de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) de tejido pulmonar en un modelo de rata con Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (SDRA). Detalla los pasos desde el establecimiento del modelo inducido por LPS hasta el análisis bioinformático, identificando 21 grupos celulares y 6 subpoblaciones de macrófagos, y destaca las principales vías inflamatorias implicadas en la patogénesis del SDRA.

Resumen

El Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (SDRA) es una enfermedad inflamatoria pulmonar grave con alta mortalidad, caracterizada por respuestas inmunitarias desreguladas y daño alveolares, aunque su heterogeneidad celular sigue siendo incompletamente comprendida. La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) ofrece una resolución sin precedentes para diseccionar mecanismos específicos de cada tipo celular, pero su aplicación en el SDRA se ve dificultada por la variabilidad técnica. Aquí presentamos un protocolo estandarizado para el análisis de SCRNA-seq de tejido pulmonar en un modelo de SDRA inducido por lipopolisacáridos (LPS) en ratas. Este método incluye disociación tisular optimizada, control de calidad riguroso, eliminación de dobletes, corrección de efectos por lotes y canalizaciones bioinformáticas completas para agrupamiento, anotación y análisis de expresión diferencial. Nuestro enfoque identifica de forma fiable 21 poblaciones celulares distintas y revela seis subpoblaciones de macrófagos/monocitos con firmas transcripcionales únicas en el ARDS. El análisis específico de expresión diferencial de subcúmulos génicos y el análisis de enriquecimiento funcional identificaron además genes y vías clave que subyacen a la patogénesis del SDRA. Este flujo de trabajo reproducible permite una caracterización profunda de la diversidad celular, las vías inflamatorias y los objetivos terapéuticos candidatos, proporcionando una base sólida para estudios mecanicistas y traslacionales en SDRA.

Introducción

El Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (SDRA) es una enfermedad respiratoria aguda caracterizada por inflamación pulmonar difusa y edema pulmonar no cardiogénico, que se manifiesta principalmente como hipoxemia progresiva e insuficienciarespiratoria 1,2. Los mecanismos patológicos del SDRA implican cascadas inflamatorias desreguladas, alteración de la barrera alveolar-capilar, y activación e interacciones anómalas de múltiples tipos de célulasinmunitarias 3,4. Durante la progresión del SDRA, las células inmunitarias dentro del tejido pulmonar impulsan cascadas inflamatorias mediante la secreción de mediadores inflamatorios y la modulación de las respuestas inmunes, alterando así el endotelio pulmonar, activando la cascada de coagulación extrínseca y agravando la lesión pulmonar 5,6,7. Sin embargo, el conocimiento actual de los mecanismos patológicos a nivel celular en el SDRA sigue siendo limitado, lo que limita el desarrollo de terapias farmacológicas específicas, mientras que las estrategias de manejo actuales consisten principalmente en diversas modalidades de soporte de ogénito y ventilaciónmecánica 1. La caracterización en profundidad de la heterogeneidad celular y los cambios dinámicos durante la patogénesis del SDRA es de suma importancia para identificar nuevos objetivos terapéuticos y desarrollar nuevas estrategiasde tratamiento 8,9,10.

La aparición de la tecnología de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) ha supuesto avances revolucionarios en la investigación de secuenciación de ARN, permitiéndonos diseccionar la heterogeneidad celular y la dinámica funcional en la patogénesis de la enfermedad: 11,12. En comparación con la secuenciación tradicional de ARN a granel, la tecnología scRNA-seq puede identificar subpoblaciones celulares raras pero críticas, revelar procesos dinámicos de transiciones de estado celular y descubrir redes de interacción intercelular complejas, información que a menudo se oculta en análisis a nivelpoblacional 13,14,15. Estudios recientes de scRNA-seq en SDRA han logrado avances significativos, incluyendo la identificación de firmas específicas de expresión génica de monocitos, el descubrimiento de patrones anormales de polarización de macrófagos y la elucidación de redes de comunicación intercelularprofibróticas 16,17,18,19 . Estos hallazgos no solo profundizan nuestra comprensión de los mecanismos fisiopatológicos del SDRA, sino que también proporcionan nuevas perspectivas sobre el desarrollo de biomarcadores, la estratificación de enfermedades y la terapia de precisión20,21.

Sin embargo, la investigación actual sobre SCRNA-seq de ARDS enfrenta desafíos, incluyendo una estandarización metodológica insuficiente, diferencias sustanciales en los protocolos de procesamiento de muestras y canales de análisis de datos inconsistentes, que limitan la reproducibilidad de los resultados de la investigación y sus aplicaciones traslacionalesclínicas 22,23. Este protocolo aborda los desafíos técnicos asociados al análisis de SCRNA-seq en el tejido pulmonar de ARDS optimizando los procedimientos para el procesamiento de tejidos, el control de calidad y el análisis de datos, proporcionando así una base para estudios mecanicistas y desarrollo terapéutico. El enfoque estandarizado garantiza la reproducibilidad entre diferentes laboratorios y facilita estudios comparativos en la investigación del SDRA sobre la heterogeneidad celular.

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Protocolo

Doce ratas machos Sprague-Dawley (SD) libres de patógenos específicos (SPF), de entre 6 y 7 semanas y con un peso de 220 g ± 10 g, fueron adquiridos a Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Número de licencia animal: SCXK (Jing) 2025-0008). Las ratas fueron alojadas en el Centro de Animales de Laboratorio del Hospital Dongzhimen, Universidad de Medicina China de Pekín, en cumplimiento con la norma nacional "Requisitos de Animales de Laboratorio para el Medio Ambiente y las Instalaciones de Vivienda" (GB 14925-2010, emitida por el Comité Técnico Nacional de Normalización de Animales de Laboratorio de China). Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal y Ética del Hospital Dongzhimen, Universidad de Medicina China de Pekín (Número de aprobación: 24-54). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Establecimiento de modelos y recogida de muestras

NOTA: Antes del experimento, someta a todas las ratas a un periodo de aclimatación de 1 semana para minimizar los efectos inducidos por el estrés.

  1. Disolver lipopolisacáridos de Escherichia coli (LPS) en solución al 0,9% de suero para obtener una solución de LPS de 0,4 mg/mL.
  2. Dividir aleatoriamente 12 ratas Sprague-Dawley (SD) machos SPF en dos grupos: un grupo de control (n = 6) y un grupo modelo ARDS (n = 6).
  3. Administrar solución salina al 0,9% por inyección intratraqueal a una dosis de 0,5 mL/100g de peso corporal al grupo de control.
  4. Administrar la solución de LPS de 0,4 mg/mL mediante inyección intratraqueal al mismo volumen (0,5 mL/100g) al grupo modelo ARDS y, tras 16 horas, anestesiar a las ratas usando isoflurano (siguiendo protocolos institucionalmente aprobados).
  5. Recoge sangre a través de la aorta abdominal y luego centrifuga (4 °C, 1000 × g, 30 min) para obtener suero.
  6. Abre la cavidad torácica y extrae tejido pulmonar.
  7. Realizar lavado broncoalveolar mediante el muñón bronquial usando una jeringuilla para obtener Líquido de Lavado Broncoalveolar (BALF)24,25.
  8. Extrae el lóbulo del pulmón derecho y enjuágalo con PBS para un examen patológico posterior.
  9. Extraer el lóbulo pulmonar izquierdo y enjuágarlo con PBS para posteriores experimentos de secuenciación unicelular ybiología molecular 26,27.

2. Evaluación histopatológica del tejido pulmonar

  1. Sumergir el tejido del pulmón derecho extraído de las ratas en paraformaldehído al 4% para fijarlo durante 12 horas.
  2. Tras la fijación, deshidrata el tejido mediante una serie graduada de etanol (70%, 80%, 90%, 95%, 100% y 100%), permitiendo 2 horas en cada concentración.
  3. Trata el tejido deshidratado con xileno hasta que se vuelva transparente.
  4. Infiltra el tejido transparente con parafina fundida en un horno a 60 °C durante 2 horas.
  5. Coloca el bloque de tejido infiltrado en un molde de incrustación, vierte parafina fresca y deja que se enfríe y solidifique en un bloque de parafina.
  6. Secciona el bloque de parafina en rodajas de 4 μm de grosor usando un microtomo, haz flotar las secciones en un baño maria a 45 °C para extenderlas y luego recógelas con portaobjetos recubiertos de poli-L-lisina.
  7. Hornea las láminas en un horno a 60 °C para asegurar una adherencia firme de las secciones a las láminas.
  8. Desparafina las secciones por inmersión en xileno y rehidratalas mediante un gradiente descendente de etanol (100%, 95%, 90%, 80% y 70%).
  9. Enjuaga las secciones con PBS, realiza tinciones de hematoxilina y eosina (HE), y monta las cubiertas usando resina neutra.
  10. Evalúa la lesión pulmonar en secciones escaneadas por portaobjetos completos utilizando un sistema de puntuación estandarizado basado en la infiltración de neutrófilos, inflamación intersticial, edema y congestión.
    NOTA: Cada parámetro fue puntuado de 0 a 4 según el grado de implicación patológica: 0 (ninguno); 1 (≤25%); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 (>75%)28,29.

3. Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas

NOTA: Las muestras pueden mantenerse a -80 °C si no se puede realizar el análisis inmediatamente después de la adquisición.

  1. Disuelve los estándares y déjalos reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego realiza la dilución en serie según las instrucciones del fabricante.
  2. Prepara la solución de trabajo de anticuerpos biotinilados, la solución de trabajo conjugada enzimática y el tampón de lavado según las instrucciones del manual.
  3. Añadir 100 μL de cada muestra o 100 μL de enormes diluidos en serie a los pozos recubiertos de anticuerpos, e incubar a 37 °C durante 90 minutos.
  4. Lava la placa 4 veces con una arandela de placas, añade 100 μL de solución activa de anticuerpos biotinilados y incuba a 37 °C durante 30 minutos.
  5. Lava la placa 4 veces, añade 100 μL de solución de trabajo conjugado enzimático e incuba a 37 °C durante 30 minutos.
  6. Añadir 100 μL de solución de sustrato por pozo, incubar protegido de la luz a 37 °C durante 10 minutos.
  7. Añade 100 μL de solución de parada por pozo, mezcla suavemente y mide la densidad óptica (OD) a 450 nm usando un lector de microplacas.
  8. Genera una curva estándar representando los valores de OD frente a concentraciones estándar usando el software diseñado.
  9. Determinar las concentraciones de la muestra basándose en los valores de OD medidos y la curva estándar.

4. Preparación de suspensiones de celda única para secuenciación

NOTA: Tras obtener tejido pulmonar, debe colocarse en hielo y procesarse rápidamente para mantener la viabilidad celular.

  1. Lava el tejido pulmonar 3 veces con PBS pre-enfriado a 4 °C.
  2. Añade 2 mL de PBS preenfriado y pícalos aún más en fragmentos más pequeños usando tijeras estériles hasta que midan aproximadamente 0,5mm 3 pulgadas.
  3. Utiliza una pipeta Pasteur para transferir el tejido picado junto con PBS a un tubo centrífugo de 15 mL.
  4. Añadir 1 mL adicional de PBS preenfriado a 4 °C en la placa de cultivo, enjuagar y volver a suspender los fragmentos de tejido restantes, y transfiere la suspensión al mismo tubo.
  5. Ajusta el volumen a 6,5 mL con PBS preenfriado a 4 °C, digiera fragmentos de tejido en una solución enzimática que contenga colagénasa I (100 U/mL) y Dispase II (1 U/mL), e incube con suaves agitaciones a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  6. Cuando los fragmentos de tejido se vuelven translúcidos y no quedan piezas sólidas distintas, filtrar el tejido digerido a través de coladores celulares de 70 μm y 40 μm, luego centrifugar (4° C, 500 × g, 5 min) y descartar el sobrenadante.
  7. Inmediatamente resuspende el pellet en 3 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC), mezcla suavemente pipeteando y lisa sobre hielo durante 10 minutos.
  8. Cuando el sobrenadante aparece de un amarillo pálido o casi incoloro, se añaden 7 mL de PBS para terminar la reacción, centrifugar (4 °C, 500 × g, 5 minutos) y descartar el sobrenadante.
  9. Añade 3 mL de PBS para resuspender las células y determinar la concentración y viabilidad celular usando tinción con azul tripán.
    NOTA: Si la viabilidad celular es inferior al 70%, realiza un procedimiento de extracción de células muertas.
  10. Lava las células dos veces con un tampón de lavado que contiene albúmina sérica bovina (BSA) al 0,04% preparada en DPBS.
  11. Suspende las células para contar y ajusta la concentración a 1.000 celdas/μL para la carga y detección posteriores.

5. Control de calidad para datos de secuenciación de una sola célula

NOTA: Las bibliotecas de ARN unicelular se prepararon a partir de suspensiones celulares utilizando un método de construcción de bibliotecas unicelulares basado en gotas. Las bibliotecas se secuenciaban en una plataforma de alto rendimiento utilizando la química de secuenciación basada en nanobolas de ADN. Se cargaron aproximadamente 21.000 celdas por biblioteca, con un objetivo de una tasa de recuperación de celdas del ~60%. La secuenciación generó un total de 5,0 ×10 8 lecturas por biblioteca, con una profundidad media de 30.000-40.000 lecturas por celda. Los datos de secuenciación en bruto se procesaron utilizando la correspondiente cadena de análisis de ARN unicelular para producir la matriz de expresión génica de cada muestra.

  1. Construir la biblioteca Oligo mediante PCR y etiquetado por código de barras, asegurando una concentración de >10 ng/μL y un tamaño máximo de 180 pb ±10 pb.
  2. Construir la biblioteca de ADNc mediante fragmentación, reparación de extremos, ligadura de adaptadores y PCR, asegurando una concentración >10 ng/μL y un tamaño máximo de 350–550 pb.
  3. Genera un objeto Seurat para cada muestra a partir de la matriz de expresión génica usando la función Read10X en el paquete Seurat (v4.3.0) en el software R (v4.2.0).
  4. Eliminar las células de baja calidad filtrando aquellas con proporción de genes mitocondriales >10% o proporción de genes de hemoglobina >5%.
  5. Normaliza los datos usando el método "LogNormalize" con un factor de escala de 10.000.
  6. Identificar características altamente variables utilizando el método "vst" y conservar los 2.000 genes superiores para análisis posteriores.
  7. Realizar la puntuación del ciclo celular utilizando los genes marcadores del ciclo celular incorporados de Seurat y regresar los efectos del ciclo celular (G2M. Score y S.Score) durante la escalada de datos.
  8. Detectar y eliminar dobletes potenciales usando DoubletFinder (v2.0.3) con pN = 0,25, pK = 0,09 y una tasa esperada de doblete de 0,06, y excluirlos del procesamiento posterior.
  9. Correcta los efectos por lotes entre muestras usando el paquete Harmony (v0.1.1) con theta = 2 y max.iter.harmony = 20.
  10. Añade columnas de información para nombres de muestras individuales y detalles de agrupación del grupo de modelos ARDS y grupo de control a los metadatos del objeto Seurat.

6. Reducción de dimensionalidad, agrupamiento y anotación de tipos de celda

  1. Realizar análisis de componentes principales (PCA) en genes altamente variables utilizando la función RunPCA en Seurat.
  2. Determinar el número óptimo de componentes principales mediante la visualización ElbowPlot.
  3. Identifica los principales clústeres celulares aplicando el algoritmo de Leiden mediante la función FindClusters y FindNeighbors de Seurat con una resolución de 0,1.
  4. Realizar la reducción de dimensionalidad de UMAP utilizando los componentes principales seleccionados.
  5. Anota los tipos celulares identificando genes marcadores con la función FindAllMarkers.
  6. Visualiza la expresión génica de marcadores entre tipos celulares usando la función DotPlot.
  7. Añade una nueva columna de información de los resultados de las anotaciones de celdas a los metadatos y visualiza la anotación por tipo de celda con Umap.
  8. Calcular la proporción de cada grupo experimental dentro de cada tipo celular identificado usando funciones dplyr para contar celdas y calcular porcentajes.
  9. Genera gráficos de barras apiladas con ggplot2 para ilustrar la composición de grupos por tipo de celda, incluyendo etiquetas porcentuales y comparaciones estadísticas entre grupos.

7. Análisis de subpoblaciones

  1. Extrae la subpoblación de la célula objetivo usando la función de subconjunto y crea un objeto Seurat correspondiente para el análisis a nivel de subpoblación aguas abajo.
  2. Renormalizar y reescalar los datos de la subpoblación mientras se regresan los genes mitocondriales, genes de hemoglobina, recuentos de UMI y puntuaciones del ciclo celular.
  3. Realizar un análisis secundario de PCA y aplicar la corrección por lotes de Harmony específicamente para la subpoblación.
  4. Realizar reagrupamiento utilizando funciones FindNeighbors y FindClusters para identificar subtipos distintos dentro de subpoblaciones celulares objetivo.
  5. Generar nuevas incrustaciones UMAP y visualizar los grupos de subpoblaciones con anotaciones de tipo celular siguiendo el mismo enfoque descrito anteriormente.

8. Análisis diferencial de expresión génica

  1. Identificar genes expresados diferencialmente (DEGs) entre el grupo modelo ARDS y el grupo de control para cada subgrupo utilizando el método estadístico MAST.
  2. Incorporar regresión de variables latentes para controlar los efectos de profundidad de secuenciación durante las pruebas de expresión diferencial.
  3. Filtrar los DEGs basándose en umbrales de cambio de pliegue logarítmico predefinidos y valores p ajustados usando la función FindMarkers.
  4. Genera gráficos volcánicos con la función ggplot para cada subcúmulo para visualizar patrones diferenciales de expresión génica con etiquetado de significación.
  5. Exportar los resultados de la DEG y crear tablas resumidas completas para facilitar el enriquecimiento funcional y otros análisis posteriores.

9. Análisis de enriquecimiento

  1. Mapea símbolos genéticos a IDs ENTREZ usando la organización. Rn.eg.db base de datos de anotaciones para compatibilidad con el análisis de vías.
  2. Combinar los DEGs de todos los subclústeres y filtrar genes significativos basándose en los umbrales de cambio de pliegue logarítmico y valores p ajustados (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, logfc.threshold = 0,25, p_val < 0,05).
  3. Realizar análisis de enriquecimiento por Ontología Génica (GO) utilizando la función GO enriquecida con categorías de ontologías de Proceso Biológico, Función Molecular, Componentes Celulares y método de corrección de Benjamini-Hochberg.
  4. Realizar análisis de enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) utilizando la función de enriquecer KEGG con la base de datos de organismos de ratas y aplicar umbrales de significación estadística.
  5. Genera gráficos de puntos para los resultados de enriquecimiento GO y KEGG usando la función de dotplot, mostrando los 15 términos más enriquecidos significativamente con proporciones génicas y valores p ajustados.
  6. Exporta los resultados del enriquecimiento como archivos CSV y guarda gráficos de visualización para una interpretación completa del análisis de vías.

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Resultados

La tinción con HE del tejido pulmonar de rata mostró estructuras alveolares claras con inflamación mínima en los controles, mientras que el grupo modelo ARDS mostró cavidades alveolares deformadas, paredes engrosadas e infiltración significativa de células inflamatorias, como se muestra en las correspondientes puntuaciones de lesión pulmonar (Figuras 1A–E). Los niveles elevados de IL-6, TNF-α e IL-1β en BALF y suero confirmaron un modelado e...

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Discusión

Este protocolo presenta un enfoque estandarizado para el análisis de secuenciación de ARN unicelular del tejido pulmonar en un modelo de rata del síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA). Estos resultados demuestran el establecimiento exitoso del modelo de SDRA inducido por LPS, confirmado por el examen histopatológico, puntuaciones elevadas de lesión pulmonar y niveles incrementados de citocinas inflamatorias en BALF y suero. El análisis transcriptómico de una sola célula reveló...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer el apoyo del Proyecto Horizontal del Hospital Dongzhimen, Universidad de Medicina China de Pekín (HX-DZM-202114).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución azul de tripán al 0,4%Gibco, EE. UU.15250061
4% de paraformaldehídoServicebio, ChinaG1101
Albúmina sérica bovina (BSA)Sangon Biotech, ChinaA600332-0005
Colagenasa IYEASEN, China40507ES60
CurveExpertDesarrollo de Hyamsv1.4
Dispasa IIYEASEN, China40104ES60
Escherichia coli lipopolisacárido (LPS) Sigma, EE. UU.L6511
Tinción de hematoxilina y eosina (HE)Solarbio, ChinaG1120
Secuenciador de genes de alto rendimiento  MGI Tech Co., LtdMGISEQ-2000RS
Inhibidor de fosfatasaBeyotime Biotechnology, ChinaP1081
Solución tamponada con fosfatoSolarbio, ChinaP1020
PMSFSolarbio, ChinaR0010
R software Lucent Technologies, EE. UU.v4.2.0
rat IL-1 y beta; Kit ELISA4abio, ChinaCRE0006
Kit IL-6 ELISA de rat4abio, ChinaCRE0005
rata TNF-y alfa; Kit ELISA4abio, ChinaCRE0003
Búfer de lisis de glóbulos rojos (glóbulos rojos)Solarbio, ChinaR1010
Amortiguador de lisis de glóbulos rojosTiangen Biotech, ChinaRT122-1
Agua libre de RNasaAmbion, EE. UU.AM9937
Buffer TE, pH 8,0Ambion, EE. UU.AM9858
Tampón de transferencia de tris-glicinaServicebio, ChinaG2017

Referencias

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