Artículo de método

Evaluación de esferoides 3D para estudios de transducción con AAV

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DOI:

10.3791/70517

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14 de agosto de 2026

 , 
1Office of Gene Therapy, Office of Therapeutic Products, Center for Biologics Evaluation and Research

En este artículo

Resumen

Los sistemas de cultivo de esferoides tridimensionales mejoran los modelos convencionales en 2D para el desarrollo de la terapia génica con AAV. Esta metodología permite la detección sensible de la transducción por AAV a bajas dosis, una mayor relevancia fisiológica y un monitoreo robusto a largo plazo. La plataforma facilita la evaluación de potencia, el cribado de alto rendimiento y la optimización de vectores en diversas líneas celulares y serotipos de AAV.

Resumen

Los virus adenoasociados (AAV) son vectores potentes utilizados para la entrega génica en productos de terapia génica. Su desarrollo requiere sistemas in vitro  que puedan detectar de manera confiable diferencias en el diseño del vector, el desempeño del serotipo, la fuerza de los elementos reguladores y la cinética de expresión. Estos sistemas también deben permitir aplicaciones como la evaluación de la potencia y la optimización del vector. Aquí describimos una plataforma optimizada en tres dimensiones basada en esferoides, diseñada para evaluar la potencia de los AAV, la cinética de expresión del transgén y la eficacia de transducción específica por serotipo en diversas líneas celulares. Los esferoides uniformes se generan utilizando placas con adherencia ultrabaja y se mantienen en condiciones que favorecen una arquitectura estable y un imagenado a largo plazo. Tras la transducción con AAV, las señales fluorescentes o luminiscentes se monitorean en tiempo real mediante sistemas de imagenado de células vivas. Esto permite la evaluación cuantitativa de la señal del reportero, la respuesta a la dosis, la actividad de los elementos reguladores y el tiempo de inicio mediante imagenado cinético continuo. La plataforma discrimina eficazmente entre diseños de genoma vectorial potentes y débiles, así como entre múltiples serotipos de AAV. Este método demuestra un desempeño robusto tanto en líneas celulares de división lenta como rápida. Estos resultados establecen su utilidad como un sistema escalable y fisiológicamente relevante para la evaluación y el desarrollo preclínicos de terapias génicas.

Introducción

Los vectores de AAV se han convertido en uno de los sistemas preferidos de entrega génica para aplicaciones in vivo debido a su perfil de seguridad y su capacidad para lograr una expresión génica persistente1. La terapia génica con AAV está mostrando éxito en el tratamiento de múltiples indicaciones de enfermedades raras, con cientos de productos en la fase de desarrollo2. Además, las aplicaciones emergentes incluyen la entrega in vivo de componentes de edición del genoma, como Cas9, con un gran potencial para ayudar en el tratamiento de indicaciones difíciles de tratar3. Los desafíos clave en el desarrollo incluyen los altos costos de fabricación y la capacidad limitada de predicción de los ensayos in vitro actuales para determinar la calidad del producto y la eficacia clínica4.

El avance de los tratamientos con AAV está fundamentalmente limitado por la falta de ensayos de actividad estandarizados y predictivos que puedan predecir con precisión el rendimiento clínico4,5. Estos ensayos son un componente crítico del proceso de desarrollo, ya que se utilizan con múltiples fines, incluyendo el cribado de bibliotecas de vectores modificados, la optimización de modificaciones del capside para mejorar el direccionamiento y la evaluación del tropismo tisular específico. También sirven para caracterizar la influencia de las secuencias reguladoras en la expresión del transgén6. Más allá de la selección de candidatos, los ensayos de transducción con AAV también apoyan el control de calidad crítico en la fabricación mediante ensayos de potencia utilizados para la liberación de lotes, estudios de comparabilidad entre lotes y evaluaciones de estabilidad6,7.

El desafío científico consiste en desarrollar ensayos que capturen la complejidad de las interacciones vector-huésped manteniendo al mismo tiempo la viabilidad práctica para su uso rutinario7,8. Los enfoques actuales incluyen el uso de líneas celulares inmortalizadas que representan el órgano diana en cultivos tradicionales en monocapa bidimensional. Estas condiciones de cultivo carecen de relevancia fisiológica y requieren dosis elevadas de fármacos. Esto genera una brecha significativa entre las predicciones de laboratorio y la transladabilidad clínica. Las líneas celulares modificadas novedosas, como los sistemas con sobreexpresión de AAVR o activados mediante CRISPR, representan avances importantes, pero no logran reproducir la arquitectura tridimensional ni las interacciones con la matriz extracelular características de los tejidos nativos9,10,11. Los modelos de nueva generación que simulen mejor los microentornos in vivo podrían cerrar esta brecha translacional12,13,14.

Recientemente desarrollamos un sistema de esferoides tridimensionales optimizado para la transducción con AAV, con el fin de mejorar la trasladabilidad de los ensayos de transducción con AAV. Este sistema mejora significativamente la eficiencia de transducción con AAV en múltiples líneas celulares y serotipos de AAV en comparación con los ensayos bidimensionales considerados estándar de oro. Además de la mayor sensibilidad y conservación del producto utilizado en el ensayo, estos modelos superan a las monocapas bidimensionales al proporcionar interacciones realistas entre células que varían según la ubicación celular dentro del esferoide. Asimismo, permiten investigar de forma significativa la penetración de fármacos, simulando condiciones reales de los órganos11,15,16. Además, este enfoque con esferoides ofrece ventajas prácticas frente a sistemas más complejos, como organoides o cultivos mixtos, ya que utiliza equipos de laboratorio estándar y evita la necesidad de medios especializados o andamios. Esta simplicidad garantiza la reproducibilidad y escalabilidad, lo que lo hace especialmente adecuado para pruebas rutinarias de terapia génica y para flujos de trabajo en el desarrollo de vectores17.

Esta plataforma de esferoides tridimensionales es particularmente adecuada para aplicaciones que requieren detección sensible de la transducción por AAV a bajas dosis y evaluación comparativa de diseños de genomas virales. También permite la evaluación del tropismo dependiente del serotipo. Es especialmente ventajosa para líneas celulares con eficiencia de transducción relativamente baja, que requieren altas dosis de AAV en cultivos convencionales en 2D. En estos contextos, la mayor sensibilidad y la mejor relevancia fisiológica de la plataforma 3D son fundamentales. Sin embargo, este sistema podría ser menos apropiado para estudios que requieran componentes inmunitarios, administración vascular o complejidad tisular completa. Esto se debe a que los esferoides no recapitulan completamente el entorno in vivo .

Por lo tanto, presentamos un protocolo sencillo de esferoides tridimensionales optimizado para ensayos de transducción con AAV, con dos lecturas críticas y complementarias: eficiencia de transducción (definida aquí como la señal total del marcador por esferoide) y cinética de transducción. Este método proporciona una plataforma rentable, fisiológicamente relevante e informativa para la evaluación de la potencia de AAV, el diseño de vectores y los ensayos de neutralización.

Protocolo

Este estudio utilizó líneas celulares humanas establecidas (HEK293T, HeLa, Huh7, HEP3B, HEPG2 y A375) obtenidas de fuentes comerciales o previamente publicadas. No se utilizaron muestras primarias de humanos ni de animales, y por lo tanto no se requirió aprobación ética.

1. Configuración estéril del experimento y preparación inicial de la cabina

  1. Active el gabinete de seguridad biológica.
  2. Enciende el gabinete de seguridad microbiológica de flujo laminar Clase II 15 min antes de comenzar, para permitir tiempo suficiente para la estabilización del flujo de aire.
  3. Rocía todas las superficies interiores del capó con etanol al 70% (v/v).
  4. Prepara una solución desinfectante de lejía al 5% (v/v) en un vaso de precipitados de vidrio de 500 mL para la eliminación del sobrenadante celular y los restos celulares.
  5. Limpia el equipo desinfectando completamente todas las micropipetas y cajas de puntas con etanol al 70% (v/v).

2. Preparación de medios de cultivo celular

  1. Prepare 500 mL de medio base de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) con alta concentración de glucosa.
  2. Suplemente el medio base con 10 mL de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 1 mL de solución de penicilina/estreptomicina (100 unidades/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina) y 5 mL de L-glutamina 2 mM.
    NOTA: Se debe mantener la técnica aséptica durante todos los procedimientos. Es necesario preparar medio fresco para cada experimento. Consulte la Tabla de Materiales para conocer las especificaciones específicas del equipo.

3. Preparación de esferoides

  1. Prepare el medio DMEM completo como se describió anteriormente.
  2. Caliente el medio de cultivo en un baño de agua a 37 °C durante 10–15 min.
  3. Extraiga las líneas celulares de interés del tanque de nitrógeno líquido.
  4. Descongele rápidamente las células criopreservadas HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 y HeLa colocándolas en un baño de agua a 37 °C.
  5. Retírelas inmediatamente del baño de agua tan pronto como se derrita el último cristal de hielo.
  6. Diluya 1 mL de células descongeladas en 9 mL de medio DMEM completo.
    NOTA: Todas las líneas celulares utilizadas en este protocolo se mantienen en el mismo medio DMEM y condiciones de cultivo.
  7. Centrifugue las células a 350 × g. durante 5 min a temperatura ambiente.
  8. Deseche el sobrenadante.
  9. Resuspenda el sedimento en 5 mL de medio DMEM completo.
  10. Siembre las células en un frasco de cultivo celular T75.
  11. Coloque los frascos sembrados en una incubadora de cultivo celular mantenida a 37 °C, 5 % de CO2 y 95 % de humedad.

4. Monitoreo del crecimiento celular

  1. Añada 15 mL de medio de cultivo cada 3 días.
  2. Pasee las células HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 y HeLa cuando alcancen una confluencia del 70 %, aspire el medio DMEM completo de los matraces T75. 
  3. Lave las células añadiendo 5 mL de PBS a los matraces T75 que contengan las células. 
  4. Aspire los 5 mL de PBS 30 s después de añadirlos a los matraces T75. 
  5. Repita este paso de lavado una vez más.  
  6. Tripsinice las células con 5 mL de tripsina-EDTA al 0,05 % durante 5 min. 
  7. Incube los matraces en un incubador a 37 °C durante 5 min para permitir la desprendimiento completo de las células. 
  8. Añada 5 mL de medio DMEM completo para neutralizar la tripsina. 
  9. Centrifugue las células a 350 × g. durante 5 min para eliminar la tripsina. 
  10. Resuspenda el sedimento celular en 5 mL de DMEM. 
  11. Divida las células en una dilución 1:10 para el pase rutinario. 
    NOTA: Se recomienda realizar dos pases celulares antes de llevar a cabo experimentos, para permitir que las células alcancen la fase logarítmica y se vuelvan metabólicamente activas. 
  12. Continúe la incubación bajo estas condiciones controladas hasta que las células alcancen una confluencia del 70 %, luego proceda con los procedimientos experimentales subsiguientes.
    NOTA: La morfología celular y los patrones de crecimiento deben monitorearse regularmente. Asegúrese de posicionar adecuadamente los matraces para un intercambio gaseoso óptimo. Es esencial mantener condiciones estériles durante todo el periodo de incubación.

5. Recolección de células y preparación inicial de las células

  1. Retire el medio de cultivo aspirando el medio existente de los frascos T75.
  2. Lave las células HEK293T, Huh7, HEP3B, A375, HEPG2 y HeLa tres veces con PBS para eliminar el medio residual y los restos celulares.
  3. Añada 5 mL de solución de tripsina 1× previamente calentada a estas células para desprender las células adherentes de la superficie del frasco.
    NOTA: Asegúrese de que la tripsina esté previamente calentada para mantener una actividad enzimática óptima. Coloque los frascos en un incubador a 37 °C durante 5 min para permitir la completa disociación celular. Controle cuidadosamente el tiempo de tripsinización para evitar una digestión excesiva.
  4. Añada 5 mL de medio de cultivo completo para inactivar la enzima tripsina.
  5. Pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar la solución.
  6. Recoja cada suspensión celular transfiriendo toda la suspensión a tubos de centrífuga etiquetados individualmente.
    NOTA: Las células deben manipularse con cuidado durante la resuspensión para mantener su viabilidad.
  7. Centrifugue las células a 350 × g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener un sedimento celular.
  8. Deseche el sobrenadante y resuspenda suavemente el sedimento celular en 5 mL de medio de cultivo fresco.

6. Recuento de células y evaluación de viabilidad mediante un contador de células

  1. Homogenice la suspensión pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para asegurar una distribución uniforme de las células en todo el tubo de centrífuga.
  2. Prepare tubos para el recuento de células HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 y HeLa.
  3. Prepare una dilución 1:10 de la muestra en medio de cultivo DMEM completo. Por ejemplo, 40 µL de suspensión celular en 360 µL de medio DMEM completo.
  4. Pipetee suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo cuatro veces para asegurar una dilución homogénea.
  5. Etiquete la muestra en el registro e indique el tipo de célula utilizado, la dilución y el nombre de la muestra.
  6. Cargue la muestra en el contador de células y coloque el tubo que contiene la suspensión celular diluida en el número asignado.
    NOTA: El contador de células es un dispositivo automático que aspira las muestras celulares y las mezcla con azul de tripano, reduciendo la variabilidad entre operadores.
  7. Deje reposar la suspensión celular durante 1 min antes de contar la muestra.
  8. Resuspenda las células de manera uniforme antes del recuento para obtener resultados precisos.
  9. Calcule el número total de células.
  10. Utilice la concentración total de células viables para determinar la siembra celular en los experimentos.
  11. Utilice células viables con > 90% de viabilidad.
  12. Distinga entre células viables (sin tinción) y no viables (teñidas de azul).
    NOTA: Se deben mantener criterios de recuento consistentes en todas las muestras.

7. Siembra de esferoides y optimización del tamaño

  1. Pipetee la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar la solución.
  2. Siembre diferentes densidades celulares de células HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2 o HeLa.
  3. Comience sembrando 1 x 104 células en 200 µL en una placa de 96 pocillos redonda de fondo y adherencia ultra baja (ULA).
  4. Diluya seriamente las 1 x 104 células/pocillo en diluciones de 2 veces hasta alcanzar la densidad celular deseada para los experimentos.
  5. Agregue 1 volumen de medio completo a todas las filas (1B-1H), excepto a la fila superior.
  6. Agregue 2 volúmenes de 1 x 104 células/pocillo en la fila 1A (fila superior).
  7. Diluya seriamente la fila 1A agregando 1 volumen de la fila 1A a la 1B y así sucesivamente. Vea el ejemplo del diseño experimental a continuación en Supplementary Figure 1.
    NOTA: Asegúrese de una resuspensión uniforme golpeando suavemente los lados de la placa.
  8. Centrifugue la placa ULA a 350 × g durante 5 min para concentrar las células en el centro y promover el contacto célula a célula.
    NOTA: Si utiliza líneas celulares distintas a las aquí descritas, puede ser necesario optimizar los parámetros, ya que diferentes líneas celulares presentan tasas variables de crecimiento y formación de esferoides.
  9. Evite mover las placas durante las primeras 24–48 h para permitir la formación inicial de esferoides. Deje que los esferoides maduren durante 3 días hasta alcanzar un diámetro de ~400 µm.
  10. Verifique la uniformidad del tamaño de los esferoides. Asegúrese de que las células estén resuspendidas uniformemente y de que las placas no estén deformadas.
    Nota: No utilice placas con esferoides de tamaños inconsistentes. Asegúrese de que los esferoides tengan un diámetro relativamente uniforme dentro de cada pocillo.
  11. Observe la morfología de los esferoides.
    Nota: Los esferoides bien formados presentan forma redonda con bordes definidos.
  12. Forme esferoides maduros que exhiban una fuerte adhesión célula-célula, no agregados celulares sueltos.
  13. Aumente la densidad de siembra o prolongue el tiempo de formación. Si los esferoides no son compactos, aumente la densidad de siembra o prolongue el tiempo de formación.
  14. Minimice múltiples agregados pequeños reduciendo la densidad de siembra o prolongando el paso de centrifugación.

8. Monitoreo en tiempo real de esferoides en células vivas

  1. Una vez que las suspensiones celulares hayan sido centrifugadas, transfiera la placa a un incubador a 37 °C (5% CO2, 95% de humedad) que contenga un instrumento de imagen en tiempo real para la adquisición automatizada de imágenes de células vivas.
  2. Establezca los parámetros para la imagen en tiempo real de esferoides según sea necesario para el experimento:
    NOTA: Los siguientes parámetros se utilizaron para todas las líneas celulares evaluadas.
  3. Inicie sesión en el software de adquisición.
  4. Seleccione los siguientes comandos:|Programar adquisición | Iniciar agregar recipiente | Escanear según programación | Crear recipiente: Nuevo.
  5. |Seleccionar tipo de escaneo|: Esferoide. |Seleccionar los canales de interés|: Fase + Campo claro (para seguir el crecimiento del esferoide), Verde/Rojo (para seguir la transducción con AAV, tiempo de adquisición de 300 ms o 400 ms, respectivamente).
  6. Seleccione la ampliación deseada: 10x.
  7. Seleccione el modelo de placa y su posición en el cajón.
  8. Seleccione las posiciones de los pocillos a imaginar y cuántas imágenes desea por pocillo.
  9. Introduzca la descripción del experimento: nombre, tipo de células, número de células.
  10. Para la configuración del análisis, seleccione Posponer análisis hasta más tarde.
  11. Haga clic derecho sobre la línea de tiempo y seleccione la opción Establecer intervalo del grupo de escaneo seleccionado.
  12. Establezca agregar escaneos cada 6 h y escanee indefinidamente. Establezca la hora de inicio deseada (al menos 1 h después de la incubación en el aparato de imagen automatizado).
  13. Revise diariamente el crecimiento de los esferoides iniciando sesión en el software de imagen.
  14. Seleccione la opción Ver escaneos recientes y haga doble clic en el experimento deseado. |Seleccione Campo claro en el panel de canales de imagen| y luego utilice la |Medir imagen| herramienta de funciones para medir el diámetro de los esferoides.
    NOTA: Puede ser necesario ajustar el tiempo óptimo de maduración para obtener esferoides compactos a partir de las células de interés.
  15. Retire la placa el día de la formación óptima de esferoides y utilícela para la transducción con AAV.

9. Transducción con AAV

  1. Adquiera o fabrique serotipos de AAV3 y transgenes de interés.
  2. Prepare medio DMEM suplementado con 2% de SFB añadiendo 10 mL de SFB a 490 mL de medio DMEM.
    NOTA: Para el cribado de cápsides o elementos reguladores genómicos, un transgen GFP es altamente efectivo, como se muestra en la sección de resultados representativos. Diluya el AAV de interés en medio DMEM suplementado con 2% de SFB, sin antibióticos.
  3. Diluya en una placa redonda designada de 96 pocillos para realizar diluciones seriadas.
  4. Realice diluciones 1:10 desde la MOI inicial para titular AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 y AAV9.
  5. Consulte el diseño experimental de ejemplo a continuación en la Figura Suplementaria 2. Calcule la MOI necesaria para la transducción con AAV, como se muestra en la sección de Discusión.
  6. Añada 33 µL de stock de AAV a 297 µL de medio para obtener un volumen total de 330 µL con una MOI de 1 × 106.
  7. Realice diluciones seriadas de 10 veces, comenzando con una MOI de 1 × 106, añadiendo 33 µL a 297 µL de medio DMEM suplementado con 2% de SFB.
    NOTA: Se recomienda evitar MOIs altas para prevenir la reducción de la viabilidad celular. Puede ser necesario optimizar las condiciones experimentales para cada tipo celular y serotipo de AAV, ya que pueden influir significativamente en la MOI óptima. No todos los genomas virales son infecciosos; los títulos funcionales pueden diferir del valor de vg/mL.

10. Dosis de AAV

  1. Aspire todo el medio de la placa de esferoides ya preparada utilizando una pipeta multicanal.
  2. Añada 100 µL del MOI deseado transfiriendo este volumen desde la placa de dilución a la placa de tratamiento, utilizando una pipeta multicanal.
  3. Coloque las placas nuevamente en el instrumento de imagen y comience a monitorear la transducción mediante el seguimiento de la intensidad fluorescente verde durante 72 h.
  4. Añada 100 µL de medio DMEM completo por pocillo cada 3 días para reponer los nutrientes, si el monitoreo dura más de 3 días.

11. Imagen en células vivas, monitoreo de la transducción y análisis de datos

  1. Coloque la placa nuevamente en el instrumento después de agregar el AAV y la MOI deseados al grupo de tratamiento.
  2. Comience a registrar la eficiencia de transducción cada 6 h.
    NOTA: Por lo general, se tarda entre 3 y 5 días en lograr una expresión óptima de GFP. Esto depende del promotor y de la configuración del genoma utilizada.
  3. Analice los datos creando una definición de análisis específica para las células y los genes reporteros de interés.
    NOTA: Alternativamente, mantenga la placa en un incubador estándar a 37 °C y evalúe la eficiencia de transducción mediante qPCR, inmunotransferencia (western blotting) o ELISA.
  4. Defina los parámetros de análisis realizando un análisis de campo claro para la detección de esferoides primarios.
  5. Optimice los parámetros de segmentación de la siguiente manera:
    1. Tipo de análisis: "Spheroid Brightfield."
    2. Método de segmentación: "Umbral adaptativo."
    3. Rango de umbral: 0,3–0,8 (se recomienda ajuste automático inicialmente)
    4. Filtro top-hat: 200–500 µm (elimina la iluminación desigual)
  6. Optimice los parámetros de campo claro de la siguiente manera:
    1. Cargue imágenes representativas de diferentes puntos temporales.
    2. Pruebe el rango de umbral (0,2–0,9) para encontrar la detección óptima.
    3. Ajuste los filtros de tamaño según el rango esperado de tamaño de los esferoides.
    4. Valide la segmentación mediante inspección visual de superposición.
  7. Optimice el canal verde para la evaluación de la transducción por AAV de la siguiente manera:
    1. Determine los niveles de fondo de los pocillos no tratados (MOI=0).
    2. Establezca el umbral 2–3× por encima del ruido de fondo.
    3. Pruebe con la muestra tratada con la MOI más alta.
  8. Optimice el tiempo de exposición para evitar la saturación mientras se mantiene la señal
    NOTA: Para las transducciones por AAV, informe la señal total de fluorescencia por esferoide como medida de la eficiencia de transducción.

12. Análisis de datos

  1. Seleccione los parámetros correctos, ajustando los filtros y máscaras, de modo que seleccione las células en la imagen y no el ruido de fondo.
  2. Seleccione una imagen representativa para entrenar el software.
  3. Aplique los parámetros optimizados a todas las imágenes del estudio.
  4. Extraiga los datos ya sea con valores individuales o agrupados y transfiera estos a un sistema de análisis estadístico para su posterior presentación.

13. Cálculo del tiempo de inicio

  1. Calcule el tiempo que tarda en detectarse la primera señal de GFP por MOI.
  2. Realice una interpolación en los pocillos no tratados promedio (MOI = 0) + 3 desviaciones estándar (DE).
  3. Copie la intensidad de fluorescencia verde de cada esferoide en cada punto temporal desde el software de imagen en tiempo real a un software estadístico.
  4. Promedie los réplicas.
  5. Calcule las señales media y DE de todos los pocillos con esferoides no tratados (MOI = 0).
  6. Utilice el ajuste de curva sigmoidea asimétrica de 5 parámetros (5PL) para interpolar el tiempo de inicio para cada MOI.
  7. Por ejemplo, los siguientes valores de interpolación se utilizaron en Tabla 1:
    1. Para scGFP: 254.955 (media) + 3 × 288.055 (DE) = 1.412.120 (señal de interpolación)
    2. Para ssGFP: 2.417.941(media) + 3 × 26.093  (DE) =  3.200.746 (señal de interpolación)

14. Mida la fluorescencia con un lector de placas con capacidades de fluorescencia.

  1. Inicie el software del lector de placas fluorescente en la computadora conectada al lector de placas.
  2. Navegar a Archivo > Abrir Protocolo y seleccione el tipo de placa (por ejemplo, de 96 pocillos, de 384 pocillos) y asegúrese de elegir la distribución correcta de los pocillos. 
  3. Establezca el tiempo de integración para la detección de fluorescencia, que determina cuánto tiempo el lector recopila fluorescencia de cada pocillo.
  4. Ajustar cualquiera ganancia o sensibilidad ajustes
    si el ensayo requiere más alto o inferior señal detección
  5. Establezca los parámetros fluorescentes para GFP de la siguiente manera: excitación: 485 nm y emisión: 528 nm.
  6. Haga clic en Ejecutar en el software para iniciar la medición.
  7. Medir fluorescencia desde cada bien.
    NOTA: Después de la corrida, el software muestra los valores brutos de fluorescencia, que pueden utilizarse para generar gráficos calculando promedios y restando el fondo.
  8. Exportar resultados en el preferido formato para más análisis o informe.
    NOTA: Si se modificó el protocolo de la muestra, utilice Archivo > Guardar como para crear una versión única, preservando la original para uso futuro.

15. Transducción de transgén luminiscente

  1. Siga el mismo protocolo de siembra y dosificación de AAV detallado anteriormente.
  2. Añada 100 µL de AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 y AAV9 que porten un transgén de nano luciferasa con diferentes MOI que varían desde 0–106 a 100 µL de esferoides de HeLa ya crecidos en placas ULA.
  3. Incube las placas en un incubador normal a 37 °C y evalúe la eficiencia de transducción tras 3 días de transducción.

16. Preparar el inhibidor de luminiscencia extracelular y el sustrato de luminiscencia para la detección en ensayos en células vivas

  1. Retire las placas de ensayo del incubador al día 3 (punto final).
  2. Agregue el inhibidor de luminiscencia extracelular y el sustrato directamente a las células.
    NOTA: No se requiere la eliminación del medio.
  3. Retire el inhibidor extracelular del almacenamiento a −20 °C y déjelo descongelar a temperatura ambiente.
  4. Centrifugue brevemente para recoger el líquido del tapón y las paredes del tubo.
  5. Prepare la cantidad deseada del inhibidor de luminiscencia extracelular reconstituido al 15X combinando 1 volumen de inhibidor extracelular con 14 volumenes de medio DMEM completo.
    1. Por ejemplo, si el experimento requiere 1,0 mL de reactivo, agregue 67 µL de inhibidor a 933 µL de DMEM. Para 1 placa, prepare 1 mL de DMEM y agregue 67 µL de inhibidor.
  6. Transfiera el inhibidor preparado del paso 16.5 a un reservorio estéril de reactivo.
  7. Utilice una pipeta multicanal para dispensar 10 µL de inhibidor en los pocillos transducidos con AAV.
  8. Retire el sustrato para células vivas del almacenamiento a −20°C y mezcle.
  9. Centrifugue brevemente para recoger el líquido del tapón y las paredes del tubo.
  10. Prepare la cantidad deseada del reactivo para células vivas reconstituido al 3,6X.
  11. Prepare 4 mL de DMEM y agregue 144 µL de sustrato para 1 placa.
  12. Transfiera el sustrato preparado del paso 16.11 a un reservorio estéril de reactivo.
  13. Utilice una pipeta multicanal para dispensar 50 µL de sustrato en los mismos pocillos transducidos con AAV.
    NOTA: Es posible que sea necesario ajustar el volumen de los reactivos si se realizan varias placas de ensayo simultáneamente.
  14. Agite la placa a 300 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
  15. Lea la placa con un instrumento de sistema de imagen in vivo dentro de las 2 h posteriores a la adición de los reactivos de detección de luminiscencia.
    NOTA: La intensidad de luminiscencia disminuirá gradualmente durante 2 h.

17. Imagen por bioluminiscencia

  1. Encienda el sistema de imagen de bioluminiscencia al menos 30 minutos antes de la adquisición de imágenes para permitir que la cámara CCD se enfríe (−90 °C).
  2. Asegúrese de que las placas estén listas para la imagen (por ejemplo, que se haya añadido el sustrato para imagen de células vivas para la lectura de bioluminiscencia).
  3. Retire la tapa de la placa para evitar reflexiones y dispersión de la luz.
  4. Limpie la parte inferior de la placa si va a realizar la imagen desde abajo.
  5. Coloque la placa en la cámara de imagen sobre la plataforma.
  6. Posicione la placa centrada debajo de la cámara.
  7. Configure los parámetros de imagen para luminiscencia: exposición automática o establezca el tiempo de exposición (típicamente 1–60 s), binning (se recomienda medio), número f (1 para máxima sensibilidad).
  8. Tome una fotografía como referencia anatómica.
  9. Adquiera la imagen luminiscente.

18. Análisis de datos de imágenes de bioluminiscencia

  1. Utilice herramientas de ROI para delimitar los pocillos o las áreas de interés.
  2. Asegúrese de que el tamaño del ROI sea consistente entre muestras para su comparación.
  3. Mida el flujo total (fotones/segundo) para la bioluminiscencia.
  4. Mida la eficiencia radiante.
  5. Exporte los datos a una hoja de cálculo para su análisis estadístico.
  6. Guarde los archivos de imagen y los resultados del análisis.
  7. Exporte las imágenes en formato TIFF o JPEG para presentaciones.

Resultados

Aquí, mostramos que los esferoides tridimensionales pueden utilizarse como una herramienta para evaluar la transducción por AAV, distinguir diseños de genomas virales como los auto-complementarios (sc) y los de cadena sencilla (ss), y evaluar la cinética de transducción. En la Figura 1 se muestra un resumen del proceso. Breve­mente, primero se amplifican las células en cultivos bidimensionales y se siembran en placas de adherencia ultra baja (ULA) para formar esferoides compactos (Figura 1A). Luego, las placas se centrifugan para favorecer la agregación (Figura 1B) y se transfieren a un sistema de imagenología de células vivas para el monitoreo en tiempo real de la formación de los esferoides (Figura 1C). En el día 3, los esferoides se transducen con AAV a diferentes MOI (Figura 1D). La cinética de transducción se sigue longitudinalmente mediante imagenología de células vivas (Figura 1E), y se realiza un análisis final mediante lecturas de fluorescencia o luminiscencia basadas en placas (Figura 1F).

Figura 2 muestra la morfología de esferoides de 6 líneas celulares diferentes, demostrando una variedad de densidades, redondez y forma. Todas las líneas celulares se cultivaron en medio DMEM completo durante varios pases antes de ser utilizadas en cualquier experimento. Una vez que las células alcanzaron la fase logarítmica, las células HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 y Huh7 se recolectaron y diluyeron seriamente en placas redondas de fondo ULA, comenzando con una densidad celular de 10.000 células por pocillo, y diluyendo seriamente por un factor de 2 (diseño de la placa incluido en Suplementario Figura 1 y se muestran resultados representativos en Figura suplementaria 2). El tamaño del esferoide puede ser tan pequeño como 50 µm aunque manteniendo aún la estructura de esferoide y una excelente susceptibilidad a la transducción. Después de la siembra celular, la placa redonda de fondo ULA se centrifugó a 350 × g. durante 5 min, lo que permitió que las células se agruparan en el centro del pocillo y se autoensamblaran en esferoides. Este paso es particularmente beneficioso para células que no se agregan naturalmente. El centrifugado puede prolongarse de 5 a 15 min para células altamente resistentes, como los linfocitos. Los esferoides bien formados presentan un fenotipo redondo y compacto, como el observado en las células HEK293T y Huh7, mientras que los esferoides mal formados están débilmente agregados y son propensos a desintegrarse durante los cambios de medio.

A continuación, la placa se transfiere a un incubador a 37 °C equipado con un instrumento para el monitoreo de células vivas. Las placas se monitorean diariamente a intervalos de 6 h para evaluar la formación de esferoides en cada una de las líneas celulares descritas aquí. La mayoría de las líneas celulares requieren 3 días para autoensamblarse en un esferoide. Como se muestra en Figura 2, cada línea celular exhibió características morfológicas distintas y niveles variables de compactación tras 3 días de siembra. Las líneas celulares hepáticas (Huh7, HEPG2 y HEP3B) formaron esferoides más compactos y densos que las otras líneas celulares. HEK293T formó una apariencia esférica muy redonda con un núcleo necrótico definido, mientras que A375 formó un agregado celular de forma irregular (descrito previamente como un esferoide deformado)18,19. Se considera que estas diferencias morfológicas son indicadores de estados fisiopatológicos de enfermedad, lo que refuerza aún más la utilidad de los modelos 3D en comparación con los sistemas de cultivo 2D18,19. El protocolo de ensamblaje de esferoides es altamente reproducible en las seis líneas celulares evaluadas y se aplicó a todas las transducciones mostradas aquí.

Después de optimizar la concentración celular, el tiempo de formación de esferoides y el estado de la autofluorescencia verde/roja (mostrado en la Figura Suplementaria 3), procedimos a evaluar la transducción con AAV en esferoides utilizando un sistema de imagen en células vivas y un lector de placas (un ejemplo del diseño de la placa para la titulación de AAV se muestra en la Figura Suplementaria 4). La Figura 3 muestra el protocolo optimizado de esferoides aplicado en cuatro líneas celulares diferentes (HEK293T, Huh7, HEP3B y HEPG2). En el día 3 de formación de esferoides, estos fueron transducidos con dos vectores AAV2 que portan diseños distintos de genoma vectorial, marcados con GFP, a diversas multiplicidades de infección (MOI). Estos dos diseños de transgén AAV representan variantes de GFP de alta potencia (scGFP) y de baja potencia (ssGFP). Una vez transducidas las células, las placas se colocaron en un sistema de imagen en células vivas para el monitoreo en tiempo real de la transducción con AAV. En el punto temporal de 72 horas, se detectó la intensidad de fluorescencia verde mediante un software de imagen en células vivas. En la Figura 3, las líneas azules representan genomas sc-GFP, mientras que las líneas rojas representan genomas ss-GFP. Los esferoides mostraron alta susceptibilidad a la transducción con AAV, con una transducción fuerte detectada a títulos muy bajos de AAV y en diferentes líneas celulares para scGFP. Videos representativos de la transducción con AAV en diversas líneas celulares y MOI, capturados en tiempo real, se muestran en Película Suplementaria 1, Película Suplementaria 2, Película Suplementaria 3, Película Suplementaria 4, Película Suplementaria 5 y Película Suplementaria 6. Por otro lado, la transducción de esferoides con AAV ssGFP se observó a niveles más bajos, lo cual refleja la transducción más débil y lenta esperada para este tipo de elemento regulador20,21. Esto demuestra la utilidad de los esferoides tridimensionales para evaluar transducciones fuertes y débiles con AAV, así como para discriminar entre genes altamente transductores, como sc-GFP, y genes menos potentes, como ss-GFP. Observamos una diferencia de 100 veces en la fluorescencia relativa entre los transgenes sc y ss a una MOI de 106 en células HEK293T, y una diferencia de 3 veces en líneas celulares más difíciles de transducir, como HEP3B.

A continuación, procedimos a evaluar la transducción de AAV de diversos serotipos de manera dependiente de la dosis, tanto en esferoides de HEK293T como en esferoides de Huh7. Como se muestra en Figura 4, los esferoides tridimensionales fueron susceptibles a la transducción con AAV-scGFP de cuatro serotipos diferentes. Tras 72 h de transducción, se midió scGFP mediante un lector de placas fluorescente (Figura 4A,B) y un software de imagen en células vivas (Figura 4C,D). Los cuatro serotipos se detectaron con éxito utilizando ambos instrumentos. El sistema de imagen en células vivas mostró un rango mayor entre la señal y el ruido en comparación con el lector de placas fluorescente, aunque la señal normalizada no mostró diferencias significativas. Encontramos que AAV2 presentó la mayor eficacia de transducción en ambas líneas celulares, seguido por AAV1, mientras que AAV5 y AAV9 mostraron una transducción significativamente menor.

A continuación, evaluamos la transducción mediante luminiscencia utilizando el protocolo de esferoides. Para probar esto, las células HeLa se cultivaron en esferoides tridimensionales siguiendo el protocolo optimizado descrito aquí. En el día 3, los esferoides de células HeLa se transdujeron con 5 serotipos diferentes de AAV que codifican un gen reportero de nano luciferasa. Después de 72 h de transducción con AAV, las células se trataron con sustrato para células vivas y se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, se midió e imagenó la luminiscencia utilizando un sistema de imagen de bioluminiscencia (Figura 5A). Se observó una transducción eficiente para todos los serotipos de AAV mediante este sistema. Se detectó una discriminación sensible entre la eficacia de transducción de los diferentes serotipos de AAV, lo que indica que el protocolo no se limita a lecturas de fluorescencia. En concordancia con las tendencias observadas en la Figura 5, la transducción con AAV-nano luciferasa en células HeLa mostró que AAV2 es el serotipo más potente, tal como se observó con los vectores AAV-GFP. De manera similar, la menor eficacia de transducción se observó para el serotipo AAV9, según lo demostrado por ambos vectores de fluorescencia y luminiscencia (Figura 4 y 5). Se muestra una imagen representativa de la transducción con AAV-nano luciferasa en la Figura 5B.

Además de la intensidad de la transducción, los protocolos con esferoides en 3D permiten el monitoreo cinético de la transducción. Figura 6 muestra resultados representativos de la cinética de transducción de esferoides 3D de HEK293T con AAV2-scGFP y AAV2-ssGFP, transducidos a diferentes MOI (0-106) (Figura 6A-G). Encontramos que la transducción con AAV2-scGFP es detectable a MOI tan bajos como 101, con un aumento en la señal de GFP detectable aproximadamente a las 34 h en comparación con células no tratadas, utilizando un sistema de imagen en células vivas. La señal de AAV2-ssGFP es mucho más débil y lenta que la señal de AAV2-scGFP. Para comparar aún más la velocidad de transducción, calculamos el tiempo de inicio en el que la señal de GFP se vuelve detectable. Observamos que scGFP transduce células, en promedio, 4 veces más rápido que ssGFP. Los tiempos individuales de inicio se indican en Tabla 1. Estas mediciones cinéticas muestran un aspecto adicional de la eficacia de la transducción útil para la optimización de ensayos.

Diagrama del flujo de trabajo de cultivo celular; formación de esferoides, transducción y análisis utilizando IncuCyte.
Figura 1: Resumen de las transducciones con AAV utilizando cultivos 3D. (A) Las células se amplifican en cultivo 2D y se siembran en placas de adherencia ultra baja (ULA) para formar esferoides. (B) Las placas se centrifugan para favorecer la agregación y se transfieren a un (C) sistema IncuCyte S3 para el monitoreo en tiempo real de la formación de esferoides. (D) Al tercer día, los esferoides se transducen con AAV a diferentes MOI. (E) La cinética de transducción se rastrea longitudinalmente mediante imágenes de células vivas, y (F) se puede realizar un análisis final mediante lecturas de fluorescencia o luminiscencia en placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Comparación de esferoides en cultivo celular; imagen de microscopía de seis líneas celulares diferentes en el montaje del experimento.
Figura 2: Caracterización morfológica de esferoides en múltiples líneas celulares. Las imágenes representativas de esferoides generados a partir de células HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 y Huh7 muestran variabilidad en tamaño, morfología y compacidad, al tiempo que presentan una alta reproducibilidad entre réplicas (barra de escala, 50 µm). Todas las líneas celulares se sembraron a una densidad de 1 x 104 células/pocillo durante 3 días. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Análisis de expresión génica en células marcadas con GFP; MOI frente a fluorescencia, múltiples líneas celulares, gráfico, imágenes.
Figura 3: Comparación de la eficiencia de transducción de AAV entre vectores auto-complementarios (scGFP) y de cadena sencilla (ssGFP) en distintas líneas celulares. Esferoides tridimensionales de (A) HEK293T, (B) Huh7, (C) HEP3B y (D) HEPG2 se autoensamblaron y se transdujeron con diferentes MOI de AAV2-scGFP (azul) y AAV2-ssGFP (rojo). La intensidad total de fluorescencia verde se cuantificó a las 72 h posteriores a la transducción. Imágenes representativas de esferoides tratados con el MOI más alto para cada AAV, obtenidas a las 72 h mediante un sistema de imagen en células vivas. Las barras de escala representan 200 µm. Las barras de error representan la desviación estándar (SD). Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura. 

Gráficos de intensidad de fluorescencia para serotipos de AAV en células HEK293T y Huh7; MOI, variable temporal.
Figura 4: La transducción con AAV en esferoides 3D distingue la actividad de diferentes serotipos de AAV. Los esferoides 3D derivados de (A,C) HEK293T y (B,D) Huh7 fueron transducidos con AAV1, AAV2, AAV5 y AAV9, y el transgén scGFP, en un rango de MOI. Las unidades de intensidad fluorescente se midieron a las 72 h mediante un lector de placas basado en fluorescencia (A,B) y un sistema de imagen en células vivas (C,D). Las barras de error representan la desviación estándar (SD). Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Gráfico de eficiencia de transducción por AAV y mapa de calor; MOI frente a flujo total; análisis de vectores virales.
Figura 5: Transducción por AAV en esferoides tridimensionales con reporteros luminiscentes. Los esferoides de HeLa fueron transducidos con AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 y AAV9 que codifican un transgén reportero de nanoluciferasa a MOIs crecientes. La luminiscencia fue visualizada y medida mediante una lectura de punto final con el sistema de imagen de luminiscencia 72 h después de la transducción. (A) Valores de Flujo Total. (B) Lectura representativa de punto final con imágenes de luminiscencia de placas de esferoides que muestra la distribución de la señal a través de los diferentes MOIs y serotipos. Cada vector AAV se realizó en dos réplicas horizontales. Las barras de error representan la desviación estándar (SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis de expresión génica; gráficos de MOI frente a tiempo; intensidad de fluorescencia de sgGFP; resultados experimentales.
Figura 6: Evaluación de la cinética de transducción en esferoides 3D. Los esferoides de HEK293T fueron transducidos con AAV2-scGFP (azul) y AAV2-ssGFP (rojo) a lo largo de un rango de 7 MOI (A–G). La intensidad verde total se midió durante un período de 72 h, con intervalos de 6 h, utilizando el sistema Monitor de formación/crecimiento de esferoides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

MOIscGFP (horas)ssGFP (horas)
1>72hrs>72
1034.2>72
10016.554.2
10005.623.1
100003.313
1000001.98

Tabla 1: Tiempo de inicio para la detección de GFP.

Figura suplementaria 1: Distribución de la placa para la titulación de esferoides. (A) Distribución representativa de la placa que muestra el esquema de dilución para esferoides de HEK293T, Huh7, HEP3B y HEPG2, generados a partir de densidades iniciales de siembra que varían desde 10.000 hasta 78 células. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Formación de esferoides en un rango de densidades de siembra. Imágenes microscópicas representativas de esferoides de HEK293T y Huh7 generadas a partir de densidades iniciales de siembra que variaron desde 10.000 hasta 78 células el día 3. La barra de escala representa 50 µm.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Información de las líneas celulares para la formación de esferoides en 3D.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Distribución de la placa para diluciones seriadas de AAV. (A) Distribución representativa de la placa que muestra el esquema de dilución seriada de AAV utilizado para AAV1, AAV2, AAV5 y AAV9, comenzando con una MOI de 106. El control negativo se muestra en la fila H, que representa esferoides no tratados.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Película suplementaria 1: Imagen en tiempo real de células vivas de la transducción de AAV2-scGFP en esferoides de HEK293T a una MOI de 106.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Película suplementaria 2: Imagen en tiempo real de células vivas de la transducción de AAV2-scGFP en esferoides de Huh7 a una MOI de 106.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Película suplementaria 3: Imagen en tiempo real de células vivas de la transducción por AAV2-scGFP en esferoides HEP3B a una MOI de 106.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Película suplementaria 4: Imagen en tiempo real de células vivas de la transducción de AAV2-scGFP en esferoides de HEK293T a una MOI de 106, como parte de un estudio de dependencia de la dosis.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Película suplementaria 5: Imagen en tiempo real de células vivas de la transducción de AAV2-scGFP en esferoides de HEK293T a una MOI de 104.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Película suplementaria 6: Imagen en tiempo real de células vivas de la transducción de AAV2-scGFP en esferoides de HEK293T a una MOI de 101.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: Cálculo de la MOI necesaria para la transducción con AAV.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Presentamos aquí una plataforma 3D in vitro optimizada para el desarrollo y la evaluación de la potencia de AAV. Esta plataforma aprovecha una transducción mejorada, alta sensibilidad y una mayor predictibilidad translacional mediante el uso de cultivos celulares tridimensionales que se asemejan más estrechamente a la arquitectura del tejido humano. Este sistema logra diferenciar con éxito la eficacia de transducción entre serotipos de AAV y elementos reguladores, incluyendo vectores de cadena sencilla y auto-complementarios, en múltiples líneas celulares. Observamos que, en contraste con los ensayos convencionales en 2D, donde la eficiencia de transducción suele definirse como el porcentaje de células positivas para el transgén, el sistema de esferoides 3D no permite fácilmente la cuantificación con resolución a nivel individual de células. Por lo tanto, en este estudio la eficiencia de transducción se define como la intensidad del señal global del reportero (fluorescente o luminiscente), que refleja las contribuciones combinadas de la proporción de células transducidas y del nivel de expresión del transgén por célula. La alta sensibilidad de los esferoides reduce considerablemente la necesidad de grandes cantidades de producto, lo que la convierte en una herramienta rentable, versátil y fisiológicamente relevante para la investigación y el desarrollo de AAV.

Este enfoque aborda los principales desafíos de los ensayos tradicionales de cultivo celular en 2D, que dependen de la adhesión a superficies artificiales y carecen de organización celular, lo que posiblemente conduce a predicciones deficientes del rendimiento del vector en entornos clínicos. El sistema de esferoides en 3D imita mejor la estructura del tejido y los patrones de distribución de fármacos, proporcionando datos sobre el comportamiento del vector que se asemejan más a las condiciones biológicas reales22,23. El protocolo utiliza placas sencillas de adherencia ultrabaja, lo que facilita su reproducción en condiciones de laboratorio estándar.

Este sistema adaptable podría utilizarse para ensayos de neutralización de AAV, para estudiar la penetración de AAV y para desarrollar experimentos de co-cultivo más complejos con el fin de investigar los efectos de diferentes entornos celulares sobre la transducción por AAV. Además, plataformas de cribado de fármacos y vectores de alto rendimiento pueden integrarse fácilmente con la plataforma de esferoides, lo que permite la automatización y la reducción de costos en los flujos de trabajo de descubrimiento de vectores para el desarrollo de productos más dirigidos.

Una ventaja práctica importante de los esferoides es su capacidad para crecer continuamente durante semanas sin necesidad de pase celular, lo que permite estudios prolongados de la actividad del AAV. Este sistema de cultivo estable mantiene interacciones importantes entre células y componentes de la matriz, evitando las interrupciones causadas por la recolección repetida de células necesaria en cultivos en 2D24. El entorno celular preservado favorece la organización natural de proteínas y estructuras de membrana que son esenciales para evaluar la unión y entrada del AAV en las células25.

Aunque los esferoides tridimensionales muestran un gran potencial para la evaluación de la transducción por AAV, también presentan algunas limitaciones traslacionales en comparación con modelos in vivo , principalmente debido a su estructura simplificada en relación con los tejidos nativos. Los esferoides carecen de componentes fisiológicos críticos, incluyendo vasculatura para la administración del vector, células inmunitarias para evaluar la inmunogenicidad y barreras específicas del tejido, como la barrera hematoencefálica, que podrían afectar significativamente el desempeño del AAV26. Estas limitaciones indican que los esferoides, a pesar de ofrecer un nivel intermedio de complejidad entre los cultivos convencionales en 2D y los modelos animales in vivo, siguen siendo insuficientes para recapitular completamente el microentorno fisiológico necesario para una evaluación exhaustiva del AAV.

El protocolo de esferoides presentado aquí describe un solo tipo celular a la vez. Este protocolo puede desarrollarse para incluir de 2 a 3 tipos celulares adicionales que se agregan en una estructura tridimensional básica. Los modelos 3D más complejos, como los organoides o la microfluídica, son sistemas multicelulares que recapitulan la diversidad celular y la organización de órganos específicos, conteniendo 10 o más tipos celulares distintos dispuestos en patrones similares a los de tejidos. Dichos organoides 3D avanzados pueden incluir múltiples células27, cultivos embebidos en hidrogel, técnicas de gota colgante y plataformas microfluídicas11,27,28. Aunque estos métodos proporcionan una arquitectura tisular más compleja que podría ayudar a profundizar en el conocimiento de la biología de los AAV, suelen requerir reactivos y equipos más especializados, así como una considerable experiencia técnica. Por otro lado, los esferoides 3D formados en placas de adherencia ultra baja son considerablemente más sencillos y adecuados para muchos laboratorios debido a su bajo costo y reproducibilidad.

Los pasos críticos para la implementación exitosa de este protocolo incluyen mantener una viabilidad celular alta, ya que las células comprometidas pueden afectar negativamente la formación de esferoides y la eficiencia de transducción. El uso de placas con adherencia ultrabaja y la optimización de la centrifugación también son fundamentales para lograr una compactación adecuada de los esferoides. Es esencial optimizar la MOI para cada tipo celular y serotipo de AAV con el fin de evitar señales débiles o saturación. La selección del método de detección adecuado también es crítica, particularmente para análisis cinéticos, donde se requiere compatibilidad con sistemas de imágenes continuas en células vivas. Varias consideraciones técnicas son importantes para la interpretación precisa de la transducción por AAV en esferoides tridimensionales.

Una señal de transducción débil o ausente puede deberse a una titulación viral baja, una MOI subóptima o un tiempo de incubación insuficiente; esto puede resolverse verificando los títulos virales, optimizando la MOI y prolongando el tiempo de incubación (típicamente de 3 a 5 días). Señales débiles de fluorescencia o luminiscencia pueden reflejar una baja expresión del transgén o una penetración limitada del reactivo dentro de la estructura tridimensional, lo cual puede mejorarse optimizando los ajustes de exposición o permitiendo tiempo adicional para la difusión del sustrato. Un desafío importante en ciertas líneas celulares, como las células HeLa, es la autofluorescencia, que puede provocar una señal de fondo elevada y una sensibilidad reducida en ensayos basados en fluorescencia. Para abordar esta limitación, implementamos un sistema de reportero basado en nanoluciferasa con luminiscencia, que proporciona una relación señal-ruido mejorada y permite una detección más precisa de la transducción en fondos autofluorescentes. Además, la señal de fondo puede originarse por umbralización inadecuada o por fluorescencia relacionada con el medio, y debe controlarse mediante pozos no tratados (MOI = 0) para definir los niveles basales. Finalmente, la saturación de la señal a altas MOI puede ocurrir debido a una entrada viral excesiva o a limitaciones del detector; esto puede mitigarse reduciendo el rango de MOI y optimizando los ajustes de exposición del detector para mantener las mediciones dentro del rango dinámico lineal.

En general, esta metodología de esferoides tridimensionales proporciona un sistema optimizado y reproducible para evaluar la transducción, potencia y cinética de los AAV. Al cerrar la brecha entre los ensayos convencionales en 2D y los estudios in vivo, permite un desarrollo de vectores más informado y apoya el avance de estrategias de terapia génica clínicamente relevantes.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Morten Seirup y Trish Hoang por proporcionar el plásmido para la producción de nanoluciferasa AAV y los reactivos sustrato vivos. Este proyecto fue apoyado por una designación al Programa de Participación en Investigación de ORISE en el CBER, Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos, administrado por el Instituto Oak Ridge para la Educación en Ciencia y Tecnología bajo un acuerdo interinstitucional entre el Departamento de Energía de los Estados Unidos y la FDA.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Incubadora a 37 °CThermoFisher Scientific#51025983Condiciones estándar de cultivo
Células A375ATCCCRL-1619Línea celular
Plásmido AAV1Addgene112862Plásmido AAV
Plásmido AAV2Addgene104963Plásmido AAV
Plásmido AAV5Addgene104964Plásmido AAV
Plásmido AAV8Addgene112864Plásmido AAV
Plásmido AAV9Addgene112865Plásmido AAV
Lector de placas BioTek GEN5Agilent TechnologiesNALectura final para fluorescencia o luminiscencia
CentrífugaThermoFisher Scientific#TSO-MX1RMantener la suspensión de esferoides
Solución salina tamponada con fosfato para cultivo celular Corning™ (1X)Fisher Scientific#MT21040CMXPBS para lavar las células
DMEM con alta glucosa, suplemento GlutaMAX y piruvatoThermoFisher Scientific#10569010Medio de crecimiento completo
Inhibidor extracelular de NanoLuc PromegaN235BApaga cualquier señal de Nanoluc® proveniente del entorno extracelular  
Suero bovino fetal (FBS)Sigma-Aldrich#F4135-500mLProporcionar factores de crecimiento
Células HEK293TATCCCRL-3216Línea celular
Células HeLaATCCCRM-CCL-2Línea celular
Células HEP3BATCCHB-8064Línea celular
Células HEPG2ATCCHB-8065Línea celular
Células Huh7ABMT8973Línea celular
Microscopio invertido IncuCyte S3SartoriusNAMonitorear la formación y el crecimiento de esferoides
Imagen de IVIS SpectrumSpectralinvivoNALectura final para luminiscencia
Ensayo Nano-Glo® para células vivas PromegaN2013Reactivo sustrato luminiscente para detección en células vivas
Penicilina-Estrepotomicina (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific# 15140122Prevenir contaminación bacteriana
Frascos de cultivo de tejidos T75 con ventilaciónFisher Scientific#NC0509296 Frascos para cultivar células
Tripsina-EDTA (0,05 %)ThermoFisher Scientific#25300120Desprendimiento enzimático de células
Placas con baja adhesiónCorning#7007Evitar la adhesión celular para promover la formación de esferoides

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