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Oclusión selectiva y permanente de la arteria cerebral media en ratas: un enfoque experimental para estudiar déficits de memoria motora y espacial

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DOI:

10.3791/70519

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20 de marzo de 2026

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1Endocrine Physiology and Metabolism Laboratory, State University of Western Paraná, 2Laboratory of Experimental Morphology, State University of Western Paraná

En este artículo

Resumen

El objetivo de este estudio fue establecer un método reproducible para realizar una craneectomía seguida de una oclusión permanente y selectiva de la arteria cerebral media en ratas, para su aplicación en estudios experimentales de déficits de memoria motora y espacial.

Resumen

Con gran relevancia clínica, el ictus isquémico (IS) exige enfoques experimentales que permitan el desarrollo de nuevas terapias adyuvantes. Debido a la similitud de la anatomía vascular cerebral con la humana, las ratas se utilizan ampliamente como modelos experimentales de SI. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de métodos capaces de generar un entorno isquémico que se parezca más al observado en humanos, empleando un enfoque que priorice la oclusión arterial selectiva. En este contexto, el objetivo de este estudio fue establecer un método reproducible para realizar una craneotomía seguida de una oclusión permanente y selectiva de la arteria cerebral media (MCA) en ratas, para estandarizar el modelo y reducir los desafíos técnicos para su aplicación en estudios de déficits de memoria motora y espacial. Las ratas wistar (N = 28) se dividieron equitativamente en dos grupos: uno se sometió a craneectomía sola (SHAM) y el otro a la craneectomía seguida de oclusión selectiva por MCA (MCAO). En el séptimo y octavo día postoperatorio se realizaron la prueba postural y la prueba de memoria de reconocimiento de ubicación del objeto, respectivamente. Tras la eutanasia, se recogieron muestras cerebrales y se prepararon secciones histológicas teñidas con Nissl. Para demostrar la viabilidad y efectividad del método, se desarrolló un protocolo quirúrgico detallado, que incluía preparación preoperatoria, anestesia, posicionamiento, craneectomía, MCAO y cierre. El método aplicado demostró déficits en el grupo MCAO, como lo demuestran la prueba postural (p = 0,015) y la prueba de reconocimiento de memoria de ubicación de objetos (p < 0,001). El análisis histológico confirmó la selectividad del enfoque, con lesiones que involucraron áreas asociadas al hipocampo como las cortezas perirhinal, entorhinal y piriforme, además de la cápsula externa, mientras que se preservaron las estructuras cerebrales más profundas. Este protocolo demostró ser un método reproducible y eficaz para inducir isquemia selectiva de MCA en ratas y representa una herramienta válida y técnicamente accesible para estudios experimentales que investigan los mecanismos fisiopatológicos y terapéuticos en el ictus isquémico.

Introducción

La penumbra isquémica que rodea la zona infartada en el ictus isquémico (IS) puede recuperarse si los tratamientos se administran de manera oportuna, con el objetivo de prevenir o mitigar las alteraciones motoras y de memoria1. Sin embargo, terapias como la trombólisis química y la trombectomía mecánica siguen siendo poco accesibles en la práctica clínica para un gran segmento de lapoblación2, lo que apoya la necesidad de modelos experimentales para investigar estrategias de tratamiento más ampliamente disponibles. Los estudios con animales son indispensables debido a su reproducibilidad y la capacidad de analizar la circulacióncolateral 3, siendo las ratas ampliamente utilizadas en los modelosIS 4. Debido a su estrecha correlación con el IS5 humano y el diámetro de su vaso, la arteria cerebral media (MCA) es el vaso principal objetivo en estudios experimentales de oclusión arterial 6,7,8.

Uno de los modelos animales más utilizados para inducir isquemia cerebral es la oclusión intralumínica basada en filamentos, seguida de lareperfusión 9,10. No obstante, la variabilidad asociada a la posición precisa del filamento dentro del MCA, la oclusión inadvertida de vasos adyacentes al círculo de Willis, los efectos colaterales debidos a la ligadura de la arteria carótida externa (ECA) requerida para el procedimiento y la duración de la oclusión contribuyen a resultados contradictorios en los metaanálisis11,12.

En el entorno clínico, la mayoría de los pacientes con SII no alcanzan repercusión cerebral ni presentan daños hipotalámicos ni secuelas asociadas a la oclusión de la ECA, lo que pone de manifiesto la necesidad de enfoques experimentales que induzcan isquemia selectiva sin reperfusión posterior. Una alternativa es la oclusión permanente de MCA (MCAO) realizada mediante craneotomía. Con la visualización directa del MCA, la oclusión selectiva previene el daño asociado a la ligadura ECA y la lesión de las arterias coroidales anterior, hipotálmica y posteriorcerebral 13, resultando en un efecto isquémico más parecido al observado en el infarto lacunar.

Estudios recientes indican que los modelos animales de IS deberían mostrar una correlación más estrecha entre la zona isquémica y los resultados clínicosdesfavorables 14,15. Desarrollar alternativas técnicas que permitan inducir isquemias de forma selectiva con complicaciones mínimas que interfieran con los resultados parece ser la estrategia más adecuada. En este contexto, el objetivo de este protocolo era establecer un método reproducible para realizar craneectomía seguida de una MCAO permanente y selectiva en ratas, con el objetivo de estandarizar el modelo y reducir los desafíos técnicos, para su uso en estudios de déficits de memoria motora y espacial. Este enfoque fue adaptado a partir de estudiosclásicos 16,17,18,19 que demostraron altas tasas de supervivencia, permitiendo evaluaciones a largo plazo.

Utilizando la vena cerebral inferior (ICV) como un hito anatómico, este protocolo busca desmitificar la dificultad técnica históricamente citada como la principal limitación de este enfoque, permitiendo la investigación de la isquemia cerebral selectiva tanto en fases agudas como crónicas. Se evaluaron la función motora y la memoria espacial para verificar los déficits inducidos por el modelo de lesión propuesto, además del análisis histológico de las regiones isquémicas del cerebro.

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Protocolo

El protocolo siguió las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio establecidas por el Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA) y fue aprobado por el Comité de Ética en Experimentación con Animales (CEUA) de la Universidad Estatal del Oeste de Paraná (UNIOESTE), protocolo número 25-23.

1. Preparación preoperatoria

  1. Preparar instrumentos quirúrgicos, gasas, almohadillas de algodón y colocar el estereomicroscopio (Figura 1).
  2. Limpia la mesa y el equipo quirúrgico con etanol al 70%.

2. Anestesia

  1. Induce anestesia con una mezcla de ketamina (3,75 mL), xilazina (2,5 mL) y cloruro de sodio al 0,9% (3,75 mL). Administrar 0,2 mL de la mezcla por cada 100 g de peso corporal intraperitonealmente. Confirma la profundidad de la anestesia usando una pata trasera o un pellizco en la cola.
  2. Si es necesario, administrar dosis adicionales correspondientes a un tercio de la dosis máxima para evitar una sobredosis.
  3. Administrar el antibiótico profiláctico enrofloxacina (20 mg/kg) y el analgésico tramadol clorhidrato (12 mg/kg) por vía intraperitoneal.
  4. Mide la temperatura rectal y mantén la temperatura corporal en 37°C (± 2°C) usando una almohadilla térmica durante todo el procedimiento.

3. Posicionamiento

  1. Colocar a la rata en decúbito lateral sobre un algodón en el escenario del microscopio (Figura 1A). Sostiene la cabeza con un pequeño rollo suave y alineala a 180° para exponer la superficie lateral izquierda del cráneo. Asegura la cabeza con cinta adhesiva (Figura 2A).
  2. Aplica colirio lubricante y cierra los párpados con cinta.
  3. Revisa la temperatura rectal y ajusta la fuente de calefacción si es necesario.

4. Craneectomía

  1. Realizar una tricotomía entre el canto lateral y el trago (aproximadamente 1,6 cm × 0,5 cm) utilizando un mini tricotomizador o cuchilla de afeitar (Figura 1B).
  2. Desinfecta la zona afeitada con un exfoliante de clorhexidina al 2% y luego clorhexidina acuosa al 0,2%.
  3. Realizar una incisión cutánea y subcutánea de 1 cm usando tijeras rectas (Figura 1C), manteniendo un margen de 0,3 cm posterior al canto lateral y anterior al trago (Figura 2B).
    NOTA: Retrae esta capa con pinzas Adson (Figura 1D) o pinzas hemostáticas.
  4. Identificar y coagular la rama temporal media de los vasos temporales superficiales mediante electrocauterización (Figura 1E).
  5. Palpar el arco cigomático usando un elevador más libre (Figura 1F) e incisar longitudinalmente la fascia del músculo temporal.
  6. Disecciona el músculo temporal craneal y caudal para exponer los huesos temporal y frontal y parte del músculo maseter. Aislar el arco cigomático longitudinalmente y retirar un segmento de aproximadamente 0,5 cm (Figura 2C).
    1. Precauciones:
      1. Controlar el sangrado de la rama temporal anterior profunda de los vasos maxilares mediante compresión o electrocauterización.
      2. Evitar cortes oblicuos posteriores para evitar daños en la articulación temporomandibular.
      3. Evita lesiones en la glándula lagrimalial extraorbitaria situada bajo el arco.
      4. Evita abrir la cavidad orbital.
  7. Perforar el hueso temporal lateral inmediatamente posterior al sitio de extracción del arco cigomático (Figura 2D) utilizando una mueva redonda recubierta de diamante de 3,5 mm de diámetro montada en un motor rotativo de baja velocidad (Figura 1G). Riega de forma intermitente con solución salina al 0,9% para prevenir daños térmicos. Deja pequeños fragmentos óseos adheridos a la duramadre (Figura 2E) y retíralos suavemente con pinzas Halstead (Figura 1H).
    NOTA: Una craneotomía con una broca más pequeña es una alternativa, pero aumenta el riesgo de lesiones durales y cerebrales.

5. Oclusión de MCA (Figura 3)

  1. Abre la duramadre usando una aguja ultrafina de 6 mm × 0,25 mm.
    NOTA: Evitar dañar los vasos corticales adyacentes.
  2. Identifica la vena cerebral inferior (CIV) situada debajo de la ventana de craneotomía y el MCA que cruza perpendicularmente por encima de ella (Figura 3A,C). Identifica la rama basal y la rama más gruesa del MCA situada en el centro del campo de la craneotomía.
  3. Pasar un 8-0 no absorbible Sutura de polipropileno alrededor del MCA usando un soporte fino para agujas (Figura 3B y Figura 1I). Atar tres nudos para ocultar la embarcación (Figura 3C).
    NOTA: Se pueden utilizar otras suturas no absorbibles como el de nailon, el algodón o la seda.
  4. Confirma la ausencia de flujo sanguíneo aguas abajo. Si hay una sucursal adicional de MCA, lógala también.
  5. Riega la cavidad con solución salina y realiza la hemostasia mediante electrocauterización o compresión suave, según sea necesario.
    NOTA: Evita la coagulación del tejido cerebral para prevenir artefactos histológicos o neuroinflamatorios.

6. Cierre

  1. Reaproxima la duramadre cuando sea posible.
  2. Reaproxima la capa muscular profunda y sutura la fascia temporal con sutura absorbible 4-0 (Figura 3D).
  3. Cierra las capas subcutánea y cutánea utilizando suturas absorbibles de poliglactina 4-0 910 en un patrón continuo.
    NOTA: Evita dejar los extremos de sutura expuestos. Se recomienda suturar de forma continua.
  4. Limpia la zona quirúrgica con clorhexidina acuosa al 0,2%.
  5. Mantén a los animales calientes hasta que se recuperen de la anestesia. Controla la temperatura antes de devolverlos a sus jaulas. La duración total de la cirugía, desde la incisión cutánea hasta el cierre de la herida, suele oscilar entre 30 y 45 minutos.
  6. Administra una segunda dosis profiláctica de antibióticos al día siguiente de la cirugía.

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Resultados

Un total de 28 ratas Wistar machos (de 10 a 12 semanas, peso medio 349 g) se dividieron aleatoriamente e equitativamente en dos grupos: MCAO (sometido al protocolo completo descrito) y SHAM (sometido solo a la fase de craneectomía). En este estudio, 3 animales fueron excluidos intraoperatoriamente y reemplazados durante la cirugía debido a hemorragia venosa (2 MCAO) o lesión cortical mínima durante la craneotomía (1 SHAM). Un animal adicional de MCAO murió en el día 5 postoperatorio. La ...

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Discusión

El modelo MCAO en ratas se ha utilizado desde 1975 como paradigma experimental para la isquemia cerebral, y se ha ido perfeccionando a lo largo de los años, demostrando eficacia en la inducción de daños neurológicos 822,23,24,25,26,27,28

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Apoyo de Posgrado (PROAP) a través del Proyecto de Asistencia Financiera para Educación o Investigación, número de proceso 88881.594204/2020-01, subvención número 1359/2020. Agradecemos a los profesores, técnicos y estudiantes de los Laboratorios de Fisiología, Metabolismo y Anatomía Humana de UNIOESTE (Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Cascavel, Brasil) por su apoyo técnico y académico a lo largo del proyecto.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Adson toothed forcepsABC stainlessL47-P4-164Otras opciones pueden estar disponibles de diferentes compañías
Castroviejo needle holderGolgran135-3Otras opciones pueden estar disponibles de diferentes compañías
ElectrocauteryChunguang medical128Otras opciones pueden estar disponibles de diferentes compañías
Freer elevatorABC stainless47P4-819Otras opciones pueden estar disponibles de diferentes compañías
Halsted curvedABC stainlessAI1055Otras opciones pueden estar disponibles de diferentes compañías
Micro drillNail drillZS-710Otras opciones pueden estar disponibles de diferentes compañías
Mini trichotomizerKemeiKM-666Otras opciones pueden estar disponibles de diferentes compañías
ProleneEthicon 8730HSutura de tamaño 8-0
StereomicroscopeAlltionASM-112Otras opciones pueden estar disponibles de diferentes compañías
Straight scissorABC stainlessL23-W4Otras opciones pueden estar disponibles de diferentes compañías
Surgical compresseCremer158595Otras opciones pueden estar disponibles de diferentes compañías
Surgical gauzeCremer198669Otras opciones pueden estar disponibles de diferentes compañías
ThermometerG-TechDMT-2027Otras opciones pueden estar disponibles de diferentes compañías
VicrylEthicon VCP346HSutura de tamaño 4-0

Referencias

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