Artículo de método

Reprogramación de líneas de células madre pluripotentes inducidas a partir de muestras congeladas de capa buffy

DOI:

10.3791/70522

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10 de abril de 2026

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1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Interdisciplinary Neuroscience, University of Georgia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 4Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, 5Division of Pediatric Endocrinology, Emory University School of Medicine, 6Dysautonomia Center, New York University Langone Health, 7Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Emory University School of Medicine, 8Stem Cell Core, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University, 9Department of Cellular Biology, University of Georgia

En este artículo

Resumen

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El protocolo actual detalla los pasos para solucionar la derivación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de muestras de pacientes que han sido difíciles de reprogramar siguiendo las instrucciones del fabricante. Este protocolo es específico para muestras congeladas de capa buffy, pero también puede aplicarse a la reprogramación de PBMCs purificados.

Resumen

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Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) son una herramienta valiosa para la modelización de enfermedades. Otras células madre pueden ser reprogramadas a partir de células somáticas adultas, llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPSC). La tecnología iPSC permite la evaluación de participantes y poblaciones específicas del estudio y se adentra en la medicina personalizada. Se toma sangre de forma rutinaria y se crioreserva para fines de investigación. Estas muestras se procesan ya sea como capas buffy, una muestra de sangre que contiene glóbulos blancos y plaquetas, o como células mononucleares periféricas de la sangre (PBMC), que representan una población más purificada de glóbulos blancos sin eosinófilos, basófilos, plaquetas ni glóbulos rojos. Ambos son una fuente fácilmente disponible y relativamente no invasiva para células somáticas reprogramables. Varios informes detallan la reprogramación a partir de PBMCs, mientras que solo uno describe este proceso a partir de abrigos congelados de color buffy. La experiencia reciente ha revelado que los protocolos de reprogramación PBMC disponibles en la literatura y de los fabricantes no tienen éxito cuando se aplican a muestras congeladas de buffy coat, lo que hace necesarias las adaptaciones y estrategias de solución de problemas descritas aquí. Para muchos investigadores que emplean tecnologías iPSC, es imprescindible contar con protocolos exhaustivos con una alta tasa de éxito, especialmente en casos en los que las muestras de pacientes pueden contener solo unas pocas células, se obtienen en intervalos de tiempo largos, provienen de un grupo limitado de participantes o son de otro modo muy valiosas. Aquí, se identifican puntos de control y estrategias de solución de problemas para aumentar la probabilidad de reprogramar los buffy coats congelados humanos o los PBMCs purificados. En última instancia, este protocolo permitirá a los investigadores identificar predictores del éxito de la reprogramación y diseñar estrategias alternativas para mejorar las probabilidades de una derivación exitosa de iPSC.

Introducción

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La tecnología de células madre pluripotentes humanas (hPSC) es una fuente de células humanas fácilmente escalable y renovable que puede diferenciarse en cualquier tipo celular del cuerpo, permitiendo a los investigadores investigar tipos celulares y de tejidos difíciles de obtener o inaccesibles en pacientes. Además, las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden derivarse directamente de las células somáticas delpaciente 1. Esto permite diferenciar tipos celulares específicos de cada paciente, una herramienta invaluable para la modelización de enfermedades y el descubrimiento de fármacos. Por tanto, métodos rigurosos, reproducibles y exitosos para reprogramar células somáticas en iPSCs son fundamentales.

Los fibroblastos, células urinarias y célulassanguíneas 2,3, cada uno con sus propias limitaciones, son algunas de las fuentes celulares somáticas más utilizadas para la derivación de iPSC. Los fibroblastos, históricamente la opción más popular parareprogramar 3, no son muy fáciles de obtener, por lo que requiere una biopsia cutánea algo invasiva. Las células reprogramables pueden derivarse de muestras de orina, que son fáciles de obtener y no invasivas, pero el proceso de reprogramación debe comenzar con muestras frescas hasta 48 horas después de lacuarta recolección. La sangre es una gran fuente de células reprogramables, ya que es mínimamente invasiva de obtener y fácilmente disponible. Existen muchos protocolos de reprogramación disponibles desde células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células sanguíneas con un solo núcleo, incluyendo linfocitos, monocitos y células asesinasnaturales 5. Como los PBMC son menos densos que otras células sanguíneas, pueden aislarse/purificarse a partir de muestras de sangre entera recién aisladas mediante centrifugación con gradientede densidad 5. Alternativamente, al centrifugarla, la sangre entera se separa en tres capas distintas: plasma, capa buffy y glóbulosrojos 6. Los pelajes buffy contienen PBMCs, así como plaquetas y algunos eritrocitos. Sin embargo, los PBMC son menos accesibles en la mayoría de los biobancos, mientras que los de sangre entera o de piel de color buffy abundany son accesibles 7. A pesar de la disponibilidad de buffy coats en biobancos y la presencia de PBMCs reprogramables en estas muestras, muy pocos protocolos detallan la reprogramación a partir de buffycoats 8 congelados, dejando este recurso sin explotar.

Actualmente, existen muchos protocolospublicados como 1, 8, 9 y kits10 comercialmente disponibles para agilizar la reprogramación; Sin embargo, no investigan en profundidad cómo maximizar el éxito de las células donantes de pacientes que son difíciles de reprogramar. Se acepta comúnmente que algunas células simplemente no se reprograman, y cuando esto ocurre, muchos investigadores pueden intentar con otro tipo de célula donante o con otro paciente. Sin embargo, esto puede no ser una opción viable para muchos investigadores o poblaciones de pacientes. A diferencia de los protocolos8 y 9 publicados anteriormente, este protocolo incluye una guía con puntos de control y criterios, en base a los cuales predecir el éxito de la reprogramación, y adopta un enfoque único purificando las capas buffy congeladas mediante centrifugación por gradiente de densidad al descongelarse.

El proceso comienza con la extracción de sangre de individuos seleccionados y el aislamiento de PBMCs o de pelaje buffy. Para nuevos experimentos, esto probablemente incluirá la contratación de nuevos donantes que se sometarán a nuevas extracciones de sangre bajo la aprobación del IRB y con un consentimiento adecuado. El siguiente paso es la expansión celular somática, en la que las células sanguíneas congeladas se descongelan y cultivan en condiciones que favorecen la proliferación de células madre hematopoyéticas y progenitores eritroides, las células sanguíneas que son las mejores candidatas parareprogramar 11. Tras 10–14 días, las células deberían estar listas para la reprogramación, como lo demuestra una morfología distinta que no se ha discutido en protocolos anteriores, y luego son transducidas mediante inoculación con un virus Sendai que transporta los factores Yamanaka Oct4, Sox2, c-Myc y Klf41. Tras la transducción, las células comenzarán a expresar los factores de transcripción Yamanaka y volverán a un estado pluripotente, nuevamente denotado por un cambio morfológico y proliferación distintivos en colonias de células madre. Las colonias emergentes se seleccionan, expanden y criopreservan individualmente. Tras diez pasajes, la caracterización mediante la confirmación de la expresión de marcadores de tallo y el potencial de diferenciación en las tres capas germinales valida una línea iPSC reprogramada con éxito.

Este protocolo funciona mejor para los pelajes buffy criopreservados, que han estado almacenados durante < 1 mes, o para PBMCs criopreservados almacenados hasta 2 años con al menos 1 millón de células viables al descongelarse. Sin embargo, los puntos de control descritos pueden ayudar a orientar la resolución de problemas de reprogramación a partir de cualquier muestra de sangre de calidad. Además, los detalles sobre cómo adaptar iPSCs reprogramados a condiciones libres de alimentadores pueden ser aplicables a cualquier flujo de trabajo de reprogramación de iPSC, independientemente del tipo de célula somática inicial.

Este protocolo, establecido mediante una resolución práctica de problemas, detalla la reprogramación de iPSCs a partir de capas buffy congeladas e identifica indicadores morfológicos del éxito de la reprogramación, proporcionando una guía viable para reprogramar muestras difíciles. En última instancia, implementar estas estrategias resulta en la conservación de tiempo, dinero, reactivos y muestras.

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Protocolo

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Este protocolo sigue las directrices del comité de ética en investigación humana de la Universidad de Georgia. Todos los estudios con sujetos humanos se realizaron conforme a las directrices de la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial. Según autoinformes, los voluntarios no sufrieron las siguientes enfermedades: fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, tuberculosis, asma, diabetes ni infecciones agudas de las vías respiratorias. Se reclutaron voluntarios de entre 18 y 50 años y de ambos sexos. Las mujeres embarazadas fueron excluidas del estudio.

1. Extracción y criopreservación con capa buffy o PBMC

Criterios de decisión: Si las muestras se almacenarán durante mucho tiempo, lo mejor es elegir la opción 2. Si no están disponibles los reactivos para la purificación de PBMC, o las muestras se almacenan durante un corto periodo de tiempo, la opción 1 es adecuada.

  1. Opción 1: Extracción de Buffy Coat
    1. Realiza una flebotomía (punción venosa para extraer sangre) según las mejores prácticasde la OMS 12 y toma entre 7 y 10 mL de sangre entera en tubos de extracción recubiertos de anticoagulantes. Guarda muestras en hielo.
    2. Transfiere entre 7 y 10 mL de sangre entera a un tubo cónico de 15 mL. Centrifuga la sangre con una centrífuga oscilante a 200 x g durante 15 minutos a 4 °C con los frenos desconectados. Esto debería formar 3 capas con plasma amarillo en la parte superior, la capa blanca de capa buffy en el centro y los eritrocitos rojos en la parte inferior.
    3. Recoge el plasma usando una pipeta sorológica estéril sin alterar la capa de capa buffy. Descarta el plasma. Transfiere la capa blanca de capa buffy a un tubo cónico fresco de 15 mL (aproximadamente 1–2 mL).
      PRECAUCIÓN: Desecha el plasma en el contenedor de residuos biopeligrosos correspondiente.
      NOTA: Parte de la contaminación por plasma del pelaje buffy es aceptable, ya que ayuda a recuperarse tras el descongelamiento.
    4. Añade DMSO a la capa buffy de modo que la composición final sea 10% DMSO v/v y congela en criovial (1 mL/vial) a -80 °C inmediatamente. Al día siguiente, pasa los viales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
      NOTA: Por ejemplo, para 2 ml de capa buffy, añade 200 μl de DMSO, mezcla bien y luego alicuota en 2 viales. Esto suele resultar en 1–3 viales congelados por muestra.
  2. Opción 2: Purificación con PBMC
    1. Realiza una flebotomía (punción venosa para extraer sangre) según las mejores prácticasde la OMS 12 y toma entre 7 y 10 mL de sangre entera en tubos de extracción recubiertos de anticoagulantes. Guarda muestras en hielo.
    2. Añadir 4 mL de solución de gradiente de densidad 1 en un tubo cónico nuevo de 15 mL. Aplicar cuidadosamente 4 mL de sangre sobre la solución 1 del gradiente de densidad.
    3. Centrifuga usando una centrífuga de cubo giratorio a 400 x g en RT durante 30 minutos, apagando los frenos. Esto dará lugar a plasma en la capa superior, PBMCs en la capa media y el resto de la sangre en la inferior.
    4. Recoge la fracción de PBMC en un tubo cónico nuevo de 15 mL, luego lávala 2–3 veces con 1 PBS centrifugando en una centrífuga de cubo giratorio a 350 x g en RT durante 5 minutos con el freno puesto. Descarta el sobrenadante. Para saltarse la criopreservación y comenzar inmediatamente la reprogramación, proceda al paso 2.3.4.
      PRECAUCIÓN: Desecha el sobrenadante en el contenedor de residuos biopeligrosos correspondiente.
    5. Resuspende el pellet en medio de criopreservación (90% suero y 10% DMSO) y congela en criovial (1 mL/vial) a -80 °C inmediatamente. Al día siguiente, pasa los viales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
      NOTA: Se pueden utilizar tubos de extracción de sangre aislantes PBMC en lugar de centrifugación por gradiente de densidad para la purificación PBMC a partir de sangre fresca. También es posible criopreservar utilizando medios alternativos de congelación disponibles comercialmente. El rendimiento típico es de 1–4 viales congelados por muestra.

2. Preparar muestras para la expansión celular somática

  1. Preparación para medios
    1. Preparar el Medio de Expansión (EM)9 alicitando 45 mL de base EM. Añade 127,8 μL de ácido L-ascórbico (50 μg/mL de 100 mM de estopa) y 450 μL de penicilina-estreptomicina (100 veces la estopa).
    2. Preparar EM + citocinasde 13 a 4 ml EM, añadir 2 μL de factor de células madre (SCF) (50 ng/mL de stock de 100 μg/ml), 2 μL de interleucina-3 (IL-3) (10 ng/mL de stock de 20 μg/mL), 16 μL de eritropoyetina (EPO) (2 U/mL de stock de 500 U/mL), 4 μL de factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1) (40 ng/mL de stock de 40 μg/ml), y 4 μL de dexametasona (1 μM de 1 mM de stock). Usa EM + citocinas el mismo día que se prepara.
      NOTA: Se pueden utilizar sistemas alternativos de medios de expansión comerciales.
  2. Opción 1: Purificación PBMC de Frozen Buffy Coat
    Criterios de decisión: si se eligió la opción 1 del paso 1 (es decir, extracción de capa buffy), entonces elige la opción 1 en el paso 2 (es decir, purificación PBMC a partir de capa buffy congelada).
    1. Recuperar la solución del gradiente de densidad 2 y dejar que alcance la temperatura ambiente. Mezcla bien invertiendo la botella. Transfiere asépticamente una solución de gradiente de densidad de 3 mL a un tubo cónico de 15 mL.
    2. Prepara otro tubo cónico de 15 mL con 12 mL de suero tampón de fosfato de Dulbecco (DPBS).
    3. Recupera el frasco de capa buffy congelada del nitrógeno líquido. Mantenlo en hielo hasta que esté listo para descongelarse. Descongela suavemente la muestra girándola en baño maria a 37 °C. Retira cuando solo quede un pequeño cristal de hielo.
    4. Transfiere cuidadosamente (gota a gota) el contenido del vial al tubo cónico que contiene DPBS. Enjuaga el vial con 1 mL de DPBS y añade al tubo cónico que contiene las células recuperadas.
    5. Centrifuga usando una centrífuga de cubo giratorio a 200 x g en RT durante 10 minutos. Retirar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 4 mL de DPBS con suero fetal bovino (FBS) al 1%.
    6. Aplica suavemente la mezcla de capa buffy sobre la solución de gradiente de densidad, teniendo cuidado de no permitir la mezcla. Centrifugar en una centrífuga de cubo oscilante a 800 x g durante 20 minutos en RT con el freno desconectado.
    7. Con una pipeta, retira y descarta la capa superior de plasma sin alterar la interfaz plasma:gradiente. Con una pipeta, retira la capa PBMC en la interfaz (Figura 1A) y transfiere a un tubo limpio de 15 mL.
      PRECAUCIÓN: Desecha las otras capas en el contenedor de residuos biopeligrosos correspondiente.
    8. Lava los PBMC con 3 mL de EM centrifugando a 200 x g durante 10 minutos en RT. Retira cuidadosamente el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en 2 mL EM + citocinas. Placa en un pozo de una placa de 12 pozos.
    9. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C, 5% deCO2 y 20%O2.
  3. Opción 2: Descongelar PBMCs congelados
    Criterios de decisión: si se eligió la opción 2 del paso 1 (es decir, purificación con PBMC), o si existe preocupación de que los abrigos buffy congelados tengan baja viabilidad (es decir, estén almacenados más de 1 mes) (Figura 1B), entonces elige la opción 2 en el paso 2 (es decir, descongelar PBMCs congelados).
    1. Prepara un tubo cónico de 15 mL con 12 mL de DPBS.
    2. Recupera el vial de PBMCs congelados del nitrógeno líquido. Mantenlo en hielo hasta que esté listo para descongelarse. Descongela suavemente la muestra remolinándola en un baño María a 37 °C. Retira cuando solo quede un cristal pequeño.
    3. Transfiere cuidadosamente (gota a gota) el contenido del vial al tubo cónico. Asegúrate de extraer todas las células del vial enjuagándolo con 1 mL de DPBS.
    4. Centrifugar en una centrífuga de cubo oscilante a 200 x g en RT durante 10 minutos. Retirar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet (Figura 1C) en 2 mL EM, luego tomar 10 μL para realizar la prueba de exclusión azul de tripán para comprobar la viabilidad celular y obtener el recuentocelular de 14.
      PRECAUCIÓN: Desecha el sobrenadante en el contenedor de residuos biopeligrosos correspondiente.
    5. Placa 1,0 x 106–2,0 x 106 células/mL en 2 mL EM + citocinas en un pozo de una placa de 12 pozos. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C, 5% deCO2 y 20%O2.

3. Expansión celular somática (1 día después del descongelamiento)

  1. Retira cuidadosamente 1 mL de medio gastado de cada pozo. El medio gastado puede recogerse en otro pozo o tubo centrífuga y comprobarse para asegurarse de que no se han perdido celdas.
  2. Sustituye el medio gastado por 1 mL de EM + citoquinas frescas.
  3. Repite los pasos 3.1 y 3.2 y toma fotos de los PBMC día sí por medio hasta observar un cambio significativo en la morfología, con células brillantes y redondas de tamaño grande y pequeño (Figura 2A, flecha naranja y azul, respectivamente), que son los eritroblastos, el tipo celular a reprogramar. Esto llevará unos 10–14 días.
    NOTA: Las células que no presentan estas morfologías, típicamente sin las celdas redondas más grandes (Figura 2B), tienen pocas probabilidades de reprogramarse con éxito y pueden estar muertas (Figura 2C).

4. Transducción (10–14 días después del deshielo)

  1. Prepara el virus Sendai
    1. Utilizando el valor de título específico del lote, calcula el volumen de cada virus necesario para la transducción de 2,0 × 105 células usando KOS: c-Myc: Klf4 con una multiplicidad de infección (MOI) de 5:5:3, según lo recomendado por el fabricante. La ecuación para este cálculo se encuentra en los documentos del producto proporcionados por el fabricante.
    2. Saca los virus del congelador y mantenlos en hielo hasta que se descongelen. Uno a uno, descongela suavemente los virus arremolinándolos en un baño María a 37 °C.
    3. Preparar alicotas en las que los tres virus se mezclen al volumen adecuado para la transducción de 2,0 × 105 células con MOIs de 5:5:3. Congela las alicuotas a -80 °C hasta que estén listas para usar.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de blanquear bien todos los residuos que hayan entrado en contacto con el virus Sendai.
      NOTA: Las instrucciones del fabricante recomiendan un recuento real de células con cálculo MOI para determinar el volumen de virus añadido, pero la aproximación de 2,0 × 105 ha sido exitosa para los fines de este protocolo. Hacer aliquotas puede ser más rentable y reduce la cantidad de ciclos de congelación/deshielo de los virus.
  2. Día de la Transducción (d0)
    1. Si los PBMC no se alimentaron el día anterior, retirar 1 mL de medio gastado y sustituir por 1 mL de EM + citocinas frescas. Descongela el virus en hielo, luego añade directamente al pozo y remueve el medio.
    2. Envuelve la placa en parafilm y centrifuga la placa en una centrífuga de cubo giratorio a 350 x g en RT durante 90 minutos. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C, 5% deCO2 y 20% deO2 durante la noche.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de blanquear bien todos los residuos que hayan entrado en contacto con el virus Sendai.
  3. 1 día después de la transducción (d1)
    1. Recoge las células en un tubo cónico de 15 mL. Enjuaga bien con 2 mL de EM y revisa bajo el microscopio que todas las células han sido recogidas. Centrifugar las celdas a 300 x g en RT durante 10 minutos.
    2. Retirar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender en 2 mL EM + citocinas. Colócate en un pozo fresco de una placa de 12 pozos y devuelva la placa a la incubadora a 37 °C, 5% deCO2 y 20%O2.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de blanquear bien todos los residuos que hayan estado en contacto con el virus Sendai.

5. Replacar las células transducidas en células alimentadoras

  1. Preparar la celda alimentadora
    1. A 43,5 mL el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco añade 5 mL de FBS (concentración final 10%), 0,5 mL de medio esencial mínimo solución de aminoácidos no esenciales (MEM-NEAA) (de 100x stock), 50 μL de 2-mercaptoetanol (55 μM de stock de 55 mM) y 0,5 mL de antibiótico-antimicótico (de 100x stock).
    2. Preparar placas de 6 pozos recubiertas con gelatina añadiendo 600 μL de gelatina (0,1% del 2% del stock) a 12 mL DPBS y distribuyendo 2 mL por pozo. Incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos.
    3. Extraer el vial congelado de fibroblastos embrionarios (MEFs) irradiados del ratón y descongelarlo suavemente en un baño maria de 37 °C.
    4. Añadir gota a gota a un tubo cónico de 15 mL que contiene 10 mL de DPBS y enjuaga el vial con 1 mL adicional de DPBS. Centrifuga a 200 x g en RT durante 5 minutos.
    5. Retira cuidadosamente el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet celular en un medio de 1 mL de fibroblastos. Retirar 10 μL para realizar la prueba de exclusión azul de tripán y verificar la viabilidad celular y así obtener el recuentocelular 14.
    6. Retirar la solución de gelatina de las placas de 6 pozos y placar MEFs irradiados a 2,5 × 104 células/cm 2. Incubar en incubadora a 37 °C, 5% deCO2 y 20%O2 durante 6–48 horas.
      NOTA: Las placas de las celdas alimentadoras deben prepararse antes de volver a plantar las celdas transducidas. Los mejores resultados se han observado cuando las MEFs irradiadas se incuban durante unos 2 días antes de volver a plantar, pero la incubación durante al menos 6 horas puede ser suficiente.
  2. Células transducidas de replacas
    1. Preparar medios iPSC de 90 mL de DMEM/F12 con 10 mL de FBS (concentración final del 10%), 1 mL de mem-neaa (de 100 mM de stock), 1 mL de L-glutamina (2 mM de stock de 200 mM), 1 mL de penicilina-estreptomicina (de stock 100x), 100 μL de 2-mercaptoetanol (55 μM de stock de 55 mM) y 100 μL de factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) (10 ng/mL de stock de 10 μg/mL). Añade ácido L-ascórbico (50 μg/mL) fresco en cada toma.
    2. En el tercer día tras la transducción, se recoge todos los medios y células del pozo transducido en un tubo cónico de 15 mL. Enjuaga bien con al menos 1 mL adicional de EM y centrífuga en una centrífuga de cubo oscilante a 300 x g en RT durante 10 minutos.
    3. Resuspende el pellet en un medio iPSC de 6 mL. Aspira el medio de 3 pozos de la placa con MEFs irradiados.
    4. Las células transducidas por placas en estos 3 pozos de MEF irradiado (2ml/pozo). Incubar en incubadora a 37 °C, 5% deCO2 y 20%O2.

6. Mantenimiento hasta la aparición de la colonia

  1. En los días 4, 5 y 6 tras la transducción, añade 1 mL de medio iPSC fresco a cada pozo cada día. Esto limita la perturbación innecesaria de las células recién reprogramadas al depositarse en los alimentadores, al tiempo que les proporciona nutrientes frescos.
  2. El día 7 después de la transducción, retira todo el material viejo y sustituye por 2 mL de medio iPSC fresco por pozo. Sigue alimentándote con medios iPSC día sí y día no hasta que empiecen a surgir colonias.
  3. Preparar medios hES 78 mL de DMEM/F12 con 20 mL de suplemento libre de FBS (20%), 1 mL de mem-neaa (100x), 1 mL de L-glutamina (2 mM de stock de 200 mM), 1 mL de penicilina-estreptomicina (100x), 100 μL de 2-mercaptoetanol (55 μM de stock de 55 mM) y 100 μL de FGF2 (10 ng/mL de stock de 10 μg/ml). Añade ácido L-ascórbico (50 μg/mL) fresco en cada toma.
  4. Una vez que las pequeñas colonias han comenzado a emerger, continúa manteniendo las células transducidas alimentándote cada dos días con medio hES (Figura 3A).
    NOTA: Las colonias comenzarán a aparecer tan pronto como 7 días después de la transducción. Si no han surgido colonias en las tres semanas posteriores a la transducción, es poco probable que alguna vez emerjan colonias.

7. Recoger colonias una vez que hayan crecido a un tamaño mayor (Figura 3B)

NOTA: A veces las células transducidas experimentan un cambio morfológico que no da lugar a una colonia similar a una célula madre (Figura 3C). Esto no se considera una colonia que pueda conducir a una línea iPSC exitosa.

NOTA: Desde la emergencia en la colonia, las líneas de iPSC deberán adaptarse a las condiciones preferidas de cultivo de hPSC del laboratorio. Este protocolo demostrará cómo las líneas de iPSC se han adaptado a condiciones libres de alimentación, cultivadas en placas recubiertas de vitronectina (VTN), alimentadas con medios hPSC definidos químicamente y disponibles comercialmente. Si las colonias no se adaptan bien a las nuevas condiciones, pueden necesitar una transición más suave, como ser recogidas en células alimentadoras con medios de hES.

  1. Prepara las placas recubiertas de VTN descongelando y mezclando bien el VTN. Para una placa de 24 pozos, preparar 12 mL de DPBS con 120 μL de VTN (5 μg/mL de material de 500 μg/mL) y distribuir 0,5 mL de solución/pozo de VTN. Incuba a temperatura ambiente durante 1 hora.
  2. Prepara el medio hPSC descongelando 1 botella de suplemento hPSC a 4°C durante la noche. Una vez descongelado, añade 10 mL de suplemento hPSC a una botella de 500 mL de medio basal hPSC.
  3. Prepara las placas para el picking retirando la solución de VTN de los pozos de la placa de 24 pozos y añadiendo un medio hPSC de 0,5 mL con 0,5 μL Y-27632 (10 μM de material de 10 mM) a cada pozo.
  4. Lleva la nueva placa, el de 6 pozos que contiene las células/colonias transducidas, agujas de jeringuilla estériles y una pipeta p200 y puntas a un microscopio de disección en condiciones estériles.
  5. Coloca la placa que contiene las células transducidas y las colonias emergentes en el microscopio de disección y utiliza el microscopio para localizar una colonia a elegir. Levanta la tapa de la placa para exponer el pozo.
  6. Abre la jeringuilla asépticamente y expone la aguja. Guiados por el microscopio, utiliza la punta de la aguja para separar la colonia de las células alimentadoras circundantes trazando el contorno de la colonia con la aguja.
  7. Usa la punta de la aguja para cortar la colonia en varias piezas de tamaño igual. Si las piezas de la colonia aún no se han desprendido de la placa, usa el lateral de la aguja para recogerlas o rasparlas de la placa y que floten.
    PRECAUCIÓN: Descarta la aguja en el recipiente correspondiente para objetos punzantes.
  8. Con el p200, utiliza el microscopio para reubicar la colonia elegida. Aspira la colonia flotante con la pipeta y transfiere a un pozo de la placa preparada de 24 pozos. Intenta meter toda la colonia en el pozo sin que se produzcan otras colonias o células alimentadoras.
  9. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C, 5% deCO2 y 20%O2.
  10. Alimenta a las colonias recogidas con 1 mL de medio hPSC cada día hasta que estén en confluencia.
    NOTA: Las colonias tienen el potencial de ser genéticamente distintas entre sí. Cada pozo de la placa de 24 pozos debe contener solo una colonia seleccionada. A cada colonia seleccionada se le asigna un identificador distinto y, a partir de ahí, se trata como una línea celular diferente a las demás colonias elegidas. Para una ronda rigurosa de reprogramación, elige al menos 24 colonias y amplía y caracterízate al menos 3.

8. Expandir

  1. Mantenimiento hPSC
    1. Las colonias recogidas están listas para dividirse cuando son grandes y redondas con bordes brillantes (Figura 4A). Las colonias se rompen en varias piezas al recogerlas. Si hay varias colonias en un mismo pozo, divídelas antes de que crezcan lo suficiente para que puedan contactarse entre sí y empezar a diferenciarse.
    2. Preparar una placa de 6 pozos recubierta con VTN: Para una placa de 6 pozos, preparar 12 mL de DPBS con 120 μL de VTN (5 μg/mL de material de 500 μg/mL) y distribuir 1 mL de solución/pozo de VTN. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de VTN puede sustituirse por DPBS y almacenarse a 37 °C, 5% de CO2 durante un mes. En los pozos en los que se dividirá, aspira DPBS y reemplácialo por medio de 1 mL hPSC.
    3. Aspira el medio del pozo para que se parta y luego enjuaga una vez con 1 mL de DPBS. Aspirar el DPBS y añadir 500 μL de 0,5 mM de tampón de disociación EDTA (preparado en 500 mL DPBS con 0,9 g de NaCl y esterilizado con filtro)15. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 2 minutos, hasta que las colonias empiecen a aflojarse y las células dentro de cada colonia empiecen a agruparse y separarse unas de otras.
    4. Retira la placa de la incubadora y aspira el buffer de disociación de EDTA. Usando una pipeta p1000, recoge las células con un medio hPSC de 1 mL pipeteando suavemente arriba y abajo hasta que las colonias estén completamente separadas y ligeramente fragmentadas. Transfiere 1 mL de medio y celdas al nuevo 6 pozos que contiene 1 mL de medio hPSC fresco. Esta primera división se realiza con una proporción de división 1:1, todas las celdas de la placa original se trasladan a la nueva placa.
    5. Coloca las células en la incubadora a 37 °C, 5% deCO2 y 20% deO2. Alimenta a los iPSCs diariamente hasta que el pozo esté confluiente y listo para dividirse.
      NOTA: La mala morfología de las células madre (Figura 4B) puede mitigarse ajustando el protocolo de escindido, como escindirse antes, usando un tiempo de incubación EDTA más corto o ajustando la proporción de escindimiento.
    6. Expande hasta un plato de 10 cm.
      1. Una vez que las células están confluyentes en cada pozo de las placas de 6 pozos, recubre una antena de 10 cm con VTN (7 mL DPBS con 70 μL VTN (5 μg/mL de 500 μg/mL), incubado durante 1 hora en RT).
      2. Repetir el protocolo de división, esta vez expandiéndose desde el pozo de 6 pozos hacia la placa de cultivo tisular de 10 cm (relación de división 1:1). Utiliza 7–10 mL de medio hPSC por cada plato de 10 cm.
      3. Una vez que las células de la antena de 10 cm están confluyentes, se repite este proceso de división (paso). En cada pasaje, anota el número del pasaje. La razón de descomposición depende de la morfología y densidad celular. Una proporción típica es de 1:10, donde una décima parte de las celdas de la placa original se trasladan a la nueva placa.
  2. Congelaciones y preparativos de stock
    1. Tras unos 3 pasajes, amplía a cuatro platos de cultivo de tejido de 10 cm para los primeros pases de paso. Una vez que las células de los platos de 10 cm están en confluencia, están listas para ser congeladas.
    2. Prepara los cryovials y colócalos en el congelador para que se enfríen. Asegúrate de que la etiqueta incluya la línea celular, el clon, el número de paso y la fecha de congelación.
    3. Prepara medios congelantes: 90% medio hPSC y 10% DMSO, necesitarás 1 mL/vial (3 viales congelados por plato de 10 cm).
    4. Realizar el protocolo de división como de costumbre, utilizando un buffer de disociación de 4 mL 0,5 mM EDTA para cada antena de 10 cm.
    5. Después de la incubación de EDTA, aspira EDTA. Añade suavemente 10 mL de hPSC medium al plato.
    6. Lava suavemente las células del plato pipeteando el medio. Las células se desprenden fácilmente del suelo del plato y se mezclan con el medio. Solo pipote 2–5 veces para romper suavemente las colonias, pero evitar la disociación en células individuales.
    7. Centrifugar durante 5 minutos a 200 x g en RT. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en medio congelante.
    8. Aisla y congela inmediatamente a -80 °C. Transfiere los viales congelados al tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
    9. Congela más acciones de la misma manera una vez que se haya completado la caracterización.

9. Caracterización de los iPSC:

  1. Expresión de marcadores de tallo. Tras expandirse durante al menos 10 pasajes, cuando las colonias en un 24-pozo estén listas para ser divididas, fijar con paraformaldehído al 4% y teñir mediante inmunohistoquímica para el marcador de tallo NANOG. Se necesitarán al menos 10 pasajes para que las colonias sean negativas al virus de Sendai (SeV), lo cual puede confirmarse mediante inmunofluorescencia (Figura 4C).
  2. Capacidad de pluripotencia de prueba: Tres diferenciaciones de la capa germinal. La pluripotencia de la iPSC se confirma mediante una diferenciación exitosa en cada una de las tres capas germinales. Cada diferenciación parte de una antena confluente de 10 cm que presenta buena morfología hPSC (Figura 4A).
    1. Ectodermo16
      1. El día antes de que comience la diferenciación (día-1): Sembrar iPSCs en placas de 24 pozos recubiertas con matriz a una densidad de 2,6 × 105 células/cm 2 pulgadas de medio hPSC con Y-27632 (concentración final de 10 μM) y XAV-939 (concentración final de 2 μM).
      2. Día 0–día 1: Alimentación con 1 mL/base de diferenciación del pozo con LDN (concentración final de 100 nM), SB (concentración final de 10 μM) y XAV (concentración final de 2 μM).
      3. Día 2–día 7: Alimentar con 1 mL/base de diferenciación del pozo con LDN (concentración final de 100 nM) y SB (concentración final de 10 μM). Desde d3, alimenta día sí y día no.
      4. Día 8: fijar con paraformaldehído al 4% y tinción mediante inmunohistoquímica para el marcador ectodermo PAX617 y confirmar la pérdida del marcador de pluripotencia NANOG (Figura 4D).
    2. Mesodermo 18:
      1. El día antes de que comience la diferenciación (día -1): Sembrar iPSCs en placas de 24 pozos recubiertas con matriz a una densidad de 2,5 × 105 células/cm 2 pulgadas de medio hPSC con Y-27632 (concentración final de 10 μM).
      2. Día 0: Alimentar con DMEM/F12 con ácido L-ascórbico (concentración final de 64 μg/mL), selenita sódica (concentración final de 13,6 ng/mL), holotransferrina (concentración final de 10 μg/mL), concentrado lipídico definido químicamente (100x) y CHIR (concentración final de 5 μM).
      3. Día 1: Alimentar con DMEM/F12 con ácido L-ascórbico (concentración final de 64 μg/mL), selenita sódica (concentración final de 13,6 ng/mL), holotransferrina (concentración final de 10 μg/mL), concentrado lipídico definido químicamente (100x) y heparina (concentración final de 0,6 U/mL).
      4. Día 2: Corregir con paraformaldehído al 4% y tinción mediante inmunohistoquímica para BRACHYURY-T19 y confirmar la pérdida del marcador de pluripotencia NANOG (Figura 4E).
    3. Endoderm20
      1. El día antes de que comience la diferenciación (día -1): Sembrar iPSCs en placas de 24 pozos recubiertas con matriz a una densidad de 1,0 × 105 celdas/cm 2 pulgadas en medio hPSC con Y-27632 (concentración final de 10 μM).
      2. Día 0–día 4: En d0, lavar con DPBS y alimentar con RPMI con sustituto de L-glutamina (100 veces), FBS (0,5% concentración final) y Activina A (concentración final de 100 ng/mL). Desde d0, alimenta diariamente con el mismo medio.
      3. Día 5: Fijar con paraformaldehído al 4% y teñir mediante inmunohistoquímica para el marcador endodermico SOX1721 y confirmar la pérdida del marcador de pluripotencia NANOG (Figura 4F).
        NOTA: Las diferenciaciones se realizaron según protocolos previamente publicados. En nuestra experiencia, los recubrimientos matriciales pueden ser intercambiables.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El éxito de este protocolo puede evaluarse en varias etapas. La Tabla 1 ofrece un resumen de las muestras sobre las que se ha realizado este protocolo. Las muestras iniciales, que son capas buffy criopreservadas almacenadas durante una semana o PBMCs criopreservadas, que presentan buena calidad muestral al descongelarse y la apariencia morfológica distintiva tras la expansión celular, se reprogramaron con éxito 6 de 7 veces (Tabla 1, categoría 1). Dos mu...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tecnología iPSC tiene un potencial inmenso en el campo biomédico en cuanto al descubrimiento de mecanismos de enfermedades, medicina personalizada y "ensayos clínicos en una placa"22,23. Protocolos eficientes y adaptables para la reprogramación de iPSC a partir de muestras de sangre son clave para desbloquear el gran potencial de la tecnología iPSC, ya que son fáciles de recoger y a menudo están disponibles en biobancos. Aunqu...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Declaramos que la investigación se llevó a cabo sin relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se reclutó a los sujetos humanos y se dio consentimiento informado para la donación de sangre según el protocolo IRB UGA# 2012-10769-06, NYU# s21-01701, Emory# 2024P008659 y Emory# 000002114. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales del Instituto Nacional de Salud bajo el número de adjudicación 5T32GM142623 a J. Art, R01MH115174 a V. Michopoulos y R01NS114567 a N. Zeltner. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Platos estándar de cultivo de tejidos de 10 cmHalcón353003
Placas de 12 pozosHalcón353043
Tubos cónicos de 15 mLFisher7200886
Placas de 24 pozosCorning7200740
Solución de paraformaldehído al 4%Termo CientíficaJ19943-K2
Placas de 6 pozosFisher ScientificFB012927
accuSpin1RFisher Scientific75003449
Activina ABio-techne338-AC
AF488-burro y alfa; CabrainvitrogenA11055
AF555-burro y alfa; RBTinvitrogenA31572
AF647-burro y alfa; minvitrogenA31571
AF647-burro y alfa; RBTinvitrogenA31573
Antibiótico-Antimicoótico (100X)Fisher15 240 096 
Pipetas Serológicas de Poliestireno BasixFisher14955233
14955234
14955235
14955236
Jeringuillas de tuberculina BDFisher14-826-87
Tubos de preparación de celdas mononucleares de vidrio (CPT) de vacío BDFisher Scientific02-685-125Tubos de recogida de sangre aislantes PBMC
BD  Tubos de recogida de sangre de plástico Vacutainer con K2EDTA: cierre HemogardFisher Scientific02-657-32Tubos de recolección de sangre recubiertos de anticoagulantes
B-MercaptoetanolFisher21 985 023 
Gelatina bovinaSigmaG1393
IgG policlonal de cabra con anticuerpo Brachyury-TR& DAF2085
CellDrop BFDenovixCellDrop BF
Centrífuga 5702EppendorfEP022628102-1EA
Concentrado lipídico definido químicamenteFisherNC9022744
Chir 99021 R& D4423
Incubadora CO2SanyoMCO-20AIC
Sistema de almacenamiento de criopreservaciónSistemas biogénicos personalizadosV-1500AB
CryoStor CS10Tecnologías de células madre100-1061medio de congelación alternativo
Kit de reprogramación CytoTune-iPS 2.0 SendaiFisherA16517
DexametasonaSigmaD2915
DMEMFisher11965118
DMEM/F12Fisher11330057
DMSOFisherBP231-1
DPBS 1X SIN MG DE CA;FisherMT21031CM
EDTAFisherAM9262
Eritropoeitina (EPO)Bio-Techne287-TC-500
Esencial 6 Medio (E6)FisherA1516401base de diferenciación 
Medio Essential 8 (E8)FisherA1517001Medio basal hPSC
Microscopio EVOS FLTermodinámicaAMF4300
Suero fetal bovinoVWR45000-734
FGF básico (FGF2)Bio-techne233-FB/CF 
GeltrexFisherA1413202Recubrimiento matricial
Solución de aminoácidos no esenciales Gibco MEM (100X)Fisher11140050
GlutamaxFisher35050061Sustituto de L-glutamina  
HeparinaTecnologías de células madre7980
Histopaque 1077Sigma10771solución del gradiente de densidad 1 
HolotransferrinaSigmaT0665
Factor de Células Madre Humanas (SCF)Peprotech300-07-100UG
Factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF1)Peprotech100-11-100UG
Interleucina-3 (IL-3)Peprotech200-03-2UG
Baño-maria Isotemp 210Fisher Scientific210
Reemplazo de suero por eliminación (KSR)Fisher10828028Suplemento gratuito FBS y nbsp;
L-Ácido AscórbicoSigmaA4544-100G
LDN193189Stemgent04-0074
L-GlutaminaFisher25030081
LymphoprepTecnologías de células madre7801Solución del gradiente de densidad 2
MatrigelCorningCB-40234Recubrimiento matricial
Fibroblastos embrionarios de ratónFisherA34964 
IgG policlonal de cabra NanogR& DAF1997-SP
Nunc Biobanca y Tubos Criogénicos de Cultivo CelularFisher Scientific12-565-163N
Penicilina/EstreptomicinaFisher15140122
IgG policlonal purificado de conejo con anticuerpos anti-Pax-6Bioleyenda901301
QBSF-60 Medio Libre de SueroCalidad Biológico160-204-101Base EM
Medio de congelación de cultivos celulares de recuperaciónThermo Fisher Scientific12648010medio de congelación alternativo
rhVitronectin (VTN)FisherA31804
RPMI 1640 MedioFisher11875093
SB431542R& D1614
Virus de Sendai HN Anticuerpo monoclonal Mouse IgG2aInvitrogen14649482
Selenita de sodioSigmaS5261
Sox17 Anticuerpo IgG policlonal de cabraR& Daf1924
Suplemento de expansión eritroide StemSpanTecnologías de células madre2692Suplemento alternativo comercial de medio de expansión
Medio StemSpan SFEM IITecnologías de células madre9605Medio alternativo de expansión comercial
Congelador de ultra baja temperaturaThermo Fisher ScientificTSX60086A
Puntas de pipeta universal - FiltradasVWR76322-132
76322-134
76322-150
76322-156
XAV939Bio-techne3748/10
Y-27632 DihidrocloruroBioGems1293823

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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