Respiración basal del suelo como método para determinar la influencia del manejo del suelo y la actividad microbiana

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la respiración basal del suelo utilizando un analizador de gases infrarrojos (IRGA), que permite monitorizar de forma controlada y continua la dinámica del CO₂ en el suelo bajo condiciones controladas y la evaluación reproducible de la actividad microbiana.

Resumen

La respiración del suelo representa la transferencia de CO₂ del suelo a la atmósfera y es uno de los mayores flujos de carbono terrestres tras la producción primaria bruta. Debido a que está impulsado principalmente por la actividad metabólica de los organismos del suelo, es ampliamente reconocido como un indicador sensible de la actividad biológica del suelo, la renovación de carbono y los impactos de perturbaciones ambientales o relacionadas con la gestión. La respiración del suelo integra múltiples fuentes de CO₂, incluyendo la respiración autotrófica de raíces de plantas y microorganismos de la rizosfera, y la respiración heterotrófica asociada a la descomposición microbiana de materia orgánica. Cuando se mide en ausencia de sustratos externos o aportaciones recientes de nutrientes, la respiración microbiana se denomina respiración basal del suelo (SBR).

Este artículo presenta un protocolo basado en un analizador de gases infrarrojos (IRGA) para cuantificar la SBR bajo condiciones de laboratorio controladas. Para aislar el componente heterotrófico atribuible únicamente al metabolismo microbiano, se excluyen los flujos de CO₂ derivados de plantas utilizando muestras de suelo preacondicionadas, tamizadas y homogeneizadas incubadas bajo condiciones estandarizadas de humedad y temperatura, permitiendo cuantificar la evolución acumulada de C-CO₂ a lo largo del tiempo y proporcionando un proxy robusto de biomasa microbiana, actividad y salud del suelo. El protocolo incluye preparación del suelo, ajuste de humedad, incubación en vial sellado, medición de CO₂ basada en IRGA y cálculo de la respiración acumulada.

En este estudio, evaluamos la SBR utilizando un analizador de gases infrarrojo (IRGA), que permite monitorizar la dinámica del CO₂ del suelo bajo condiciones controladas. Resultados representativos mostraron que la adición de compost mejoró la respiración microbiana en suelos áridos del desierto de Tabernas, indicando una fuerte estimulación de los procesos microbianos tras la enmienda orgánica. Estos hallazgos destacan la utilidad de la SBR como indicador de los efectos de la gestión del suelo sobre la actividad microbiana, especialmente en ambientes áridos degradados. Metodológicamente, el protocolo basado en IRGA ofrece una herramienta práctica para aplicaciones de investigación y enseñanza relacionadas con la dinámica del carbono en el suelo.

Introducción

La respiración del suelo es un proceso biogeoquímico central que abarca el flujo de dióxido de carbono (CO₂) desde la superficie del suelo hacia la atmósfera. Se estima que es el segundo mayor flujo de carbono terrestre después de la producción primaria^{bruta 1} y contribuye significativamente al ciclo global^{del carbono 2}. Este proceso es clave para la renovación de carbono en ecosistemas terrestres y se utiliza cada vez más como un indicador sensible de la actividad biológica del suelo y la dinámica de la captura de carbono^{en el suelo 3,4}.

La respiración del suelo se obtiene de múltiples fuentes y generalmente se categoriza en dos componentes biológicos principales: la respiración autotrófica, originada por el metabolismo de las raíces de las plantas y microorganismos asociados a la rizosfera, y la respiración heterotrófica, asociada a la descomposición microbiana de la materia orgánica del^{suelo 5,6}. Fuentes no biológicas, como la meteorización^{carbonatada 7} y la^{fotodegradación 8}, también pueden contribuir bajo condiciones específicas. Para aislar el componente heterotrófico atribuible únicamente al metabolismo microbiano, deben excluirse los flujos de CO₂ derivados de plantas.

En este contexto, la respiración microbiana se define como la producción de CO₂ o la captación de O₂ por microorganismos—incluidos bacterias, hongos, protozoos y algas—como resultado de procesos metabólicos aeróbicos^{o anaeróbicos.} Cuando se mide en ausencia de sustratos externos o aportaciones recientes de nutrientes, la respiración microbiana se denomina respiración^{basal 10}. La respiración basal refleja la actividad metabólica endógena de la comunidad microbiana nativa y a menudo se emplea como un indicador de la biomasa microbiana, la actividad y la sensibilidad a alteraciones ambientales o^{antropogénicas 11,12}.

Para evaluar con precisión la respiración basal, se realizan mediciones de laboratorio sobre muestras de suelo preacondicionadas, tamizadas y homogeneizadas. Este pretratamiento elimina eficazmente raíces y macrofauna, eliminando así la respiración autotrófica y permitiendo centrarse en la actividad microbiana heterotrófica. Aunque el tamizado altera la estructura original del suelo, mejora la homogeneidad y reproducibilidad de la muestra, y facilita el estudio de procesos impulsados por microbios en^{aislamiento 9}. La incubación se realiza típicamente bajo condiciones ambientales controladas, como 25 °C y el 60% de la capacidad del campo del suelo, para optimizar la actividad microbiana sin favorecer grupos funcionales específicos^13,14. En este contexto, la humedad del suelo y la capacidad de campo son parámetros críticos porque la respiración microbiana es muy sensible a la disponibilidad de agua, lo que regula la difusión del sustrato, el suministro de oxígeno y el metabolismo microbiano. Por esta razón, las mediciones de respiración basal se realizan comúnmente bajo condiciones de humedad estandarizadas expresadas como proporción de la capacidad de campo. El C-CO₂ evolucionado durante un periodo de incubación se cuantifica como una medida de la respiración^{basal 15}.

Este protocolo es especialmente adecuado para estudios controlados de incubación en laboratorio destinados a evaluar la actividad microbiana mediante la respiración basal en suelos preacondicionados. Es especialmente útil para comparar suelos sometidos a diferentes prácticas de gestión, como enmiendas orgánicas u otras perturbaciones, utilizando muestras homogeneizadas bajo condiciones estandarizadas de temperatura y humedad. Dado que se excluyen los aportes de CO₂ de origen vegetal, el método es más adecuado para evaluar el componente heterotrófico de la respiración del suelo en lugar de la respiración total en condiciones de campo.

Se han desarrollado varias técnicas analíticas para cuantificar la respiración del suelo, cada una variando en sensibilidad, capacidad de rendimiento y complejidad^{operativa 9,16}. Los enfoques clásicos incluyen la absorción de álcalinos seguida de titulación, sistemas conductimétricos, cromatografía de gases y análisis de gases infrarrojos. Los métodos basados en álcalis son robustos y relativamente económicos, pero proporcionan una resolución temporal limitada y pueden verse afectados por una absorción o fuga incompleta de CO₂. Los métodos conductimétricos permiten mediciones continuas, aunque pueden estar influenciadas por la temperatura y la fuerza iónica. La cromatografía de gases proporciona una cuantificación precisa del CO₂ en espacio de carga y permite la determinación simultánea de otros gases, pero requiere instrumentación especializada y personal formado, y el rendimiento puede ser limitado. En cambio, los analizadores de gases infrarrojos (IRGA) permiten un seguimiento rápido y repetido de la concentración de CO₂ bajo condiciones de incubación controladas, lo que los hace especialmente útiles para mediciones resueltas en tiempo de la respiración microbiana. Sin embargo, las mediciones IRGA también requieren una calibración adecuada y un control cuidadoso de las condiciones de incubación para garantizar la reproducibilidad, y pueden verse afectadas por la deriva de la señal, interferencias de vapor de agua y una fiabilidad reducida a concentraciones altas de CO₂. Los desarrollos recientes han ampliado la disponibilidad de sistemas de respiración del suelo basados en infrarrojos y NDIR, incluyendo plataformas basadas en cámaras y sensores de menor coste para aplicaciones de laboratorio y campo ^24,25. En incubaciones con viales cerrados, la relación espacio libre respecto al suelo y el intervalo entre mediciones deben ajustarse según la frecuencia respiratoria esperada para evitar una acumulación excesiva de CO₂ durante la incubación. Protocolos recientes basados en IRGA también se han publicado para apoyar mediciones estandarizadas de laboratorio de la respiración del suelo bajo condiciones de incubación^{controladas 26,27}, y la guía metodológica estandarizada para mediciones de respiración en el suelo también se ha propuesto en el protocolo^{FAO 28.} En este contexto más amplio, la respiración basal también puede considerarse un componente de la evaluación de la salud del suelo en experimentos agrícolas a largo plazo. Refleja la actividad metabólica microbiana y la mineralización del carbono, mientras que indicadores como el lavado de CO₂, el carbono oxidable con permanganato y la captura de carbono orgánico del suelo son aspectos complementarios del funcionamiento del^{suelo 29}. En este estudio, utilizamos un IRGA paracuantificar las tasas de respiración basales a partir de muestras de suelo incubadas. Este método permite monitorizar repetidamente el flujo de CO₂ durante el periodo de incubación, facilitando la evaluación de la actividad metabólica microbiana bajo condiciones definidas de humedad y temperatura. El siguiente protocolo describe el procedimiento de laboratorio utilizado para medir la respiración basal del suelo en suelos sometidos a diferentes condiciones de gestión.

Protocolo

1. Preparativos

1. Recogida de muestras:
   1. Recoger muestras por cada nivel del suelo o entre 0 y 10 cm en caso de estudios superficiales.
      NOTA: Utiliza herramientas y guantes desinfectados para evitar contaminaciones microbianas.
   2. Coloca las muestras en bolsas isotérmicas y transportas al laboratorio en una caja refrigerada.
   3. Si no se puede hacer el preprocesamiento del suelo de inmediato, mantener las muestras a 4ºC (preferiblemente no más de 48 horas).
   4. Deja que las muestras se equilibren a temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de su procesamiento e incubación.
2. Preparación de materiales y preprocesamiento del suelo:
   1. Desinfecta los materiales de laboratorio sumergiéndolos en lejía al 10% o etanol al 70% durante 30 minutos, luego enjuágalos bien con agua destilada y déjalos secar al aire antes de usarlos.
      PRECAUCIÓN: Usa guantes, bata de laboratorio y gafas al usar estos productos químicos.
   2. Deja las muestras a temperatura ambiente durante 2 horas para estabilizarlas.
   3. Muestreo en el tamiz hasta 2 mm. Descarta raíces y restos gruesos con pinzas.
   4. Limpia el colador después de cada muestra con las soluciones desinfectantes y sécate con una toalla de papel.
3. Determinar la humedad del suelo (cantidad de agua presente) y la capacidad del campo (agua que puede retener el suelo⁾¹⁷.
   1. Cálculo de la humedad del suelo: Determinar la humedad del suelo secando al horno (105ºC) 20 g de muestra en una cápsula cerámica durante 24 horas¹⁸ [Eq 1].
      [EQ 1]
   2. Determinar la capacidad de campo utilizando un aparato de membrana de presión "Richards^{" 19}.
      1. Coloca muestras de suelo sobre las placas cerámicas del dispositivo delimitadas por anillos de plástico.
      2. Añade agua dispersa hasta saturación y deja un mínimo de 24 horas. Después, aplica una presión de −0,33 bar (−33 kPa) para otras 24 horas. Luego vuelve a determinar la humedad del suelo según la Ecuación 1.
4. Determinar la densidad del suelo (g·^mL-1). Llena un tarro con tar y con volumen conocido con la muestra de tierra seca al horno y registra el peso del suelo. La densidad del suelo es la proporción peso/volumen del tarro.
5. Preparación de la muestra para incubación:
   1. Ajusta la temperatura de la incubadora a 25 °C. La norma UNE-EN ISO 16072:2002 (Calidad del suelo: métodos de laboratorio para la determinación de la respiración microbiana, https://www.iso.org/standard/32096.html) sugiere que la temperatura es para la comparabilidad entre estudios).
   2. Estimar las condiciones de humedad: Calcular el volumen de destilado necesario para que cada muestra alcance el 60% de la capacidad del campo a partir de su contenido inicial de humedad^{en el suelo 20,21}. Este será el nivel de humedad al inicio del experimento y no será necesario ajustar el agua durante el periodo de incubación.
   3. Selección de la cantidad de suelo: La cantidad de suelo utilizada puede variar en función de su contenido de materia orgánica (cuanto mayor es el contenido de materia orgánica, menos suelo se necesita para el experimento⁾²¹. Sin embargo, se sugiere 20 g como cantidad de referencia.
   4. Coloca muestras en frascos de vidrio de 100 mL y añade agua distila hasta el 60% de humedad de la capacidad del campo. Sella los viales con un septaum y colócalos en la incubadora.

2. Mediciones de concentración de CO₂

1. Intervalo de medición:
   1. Realizar mediciones de_CO2 en intervalos seleccionados según la frecuencia respiratoria esperada del suelo para evitar la acumulación excesiva de CO₂ en la cabecera del vial.
   2. Evitar concentraciones superiores al 10% (100 000 ppm) para evitar la inhibición de la actividad microbiana. Acortar los intervalos de medición si las concentraciones superan este umbral. Realiza mediciones diarias durante la primera semana y cada 3 o 4 días después de eso, en el ejemplo representativo que se muestra más adelante.
2. Mediciones de concentraciones de CO2 (%) con un Analizador de Gases de Espacio Mental Infrarrojo (IRGA)
   1. Calibrar el IRGA antes de cada sesión de medición según las instrucciones del fabricante o utilizando un estándar cero (aire o nitrógeno sin CO₂) y al menos un estándar de tramo con concentración conocida de CO₂ dentro del rango de medición. Verifica la estabilidad del instrumento y corrige la deriva base según las instrucciones del fabricante. Registrar los parámetros de calibración antes de las mediciones de la muestra.
   2. En el dispositivo IRGA descrito en la lista de materiales, conecta una aguja con un capilar al instrumento...
   3. Inserta el neddle a través del tabique hasta el vial para extraer una alitería de gas y registrar la concentración de CO₂ (%).
   4. Realiza lecturas repetidas por muestra hasta que la señal se estabilice.
3. Reacondicionamiento de muestras
   1. Deja los viales abiertos en un área limpia protegida del polvo y del flujo de aire (preferiblemente en una cámara de flujo laminar) durante media hora después de cada medición para renovar el aire y evitar condiciones anaeróbicas. No mezcles ni agites el suelo durante este paso de aireación.
   2. Vuelve a sellar los viales usando el tabique y devuelvo a la cámara de incubación.
4. Corrección de CO₂
   1. Añade un vial sin tierra pero con las mismas condiciones de operación para compensar un vacío.
   2. Resta los valores del blank a las muestras para eliminar las condiciones ambientales de CO₂ .
      NOTA: Ten cuidado al exhalar cerca de los viales abiertos. Esto puede sesgar los resultados.

3. Cálculo de la respiración basal del suelo (SBR)

1. Determina el volumen de espacio libre en el vial (Vhs) restando el volumen ocupado por el suelo (densidad global) y el agua añadida del volumen total del vial [Eq 2].
2. Estima el volumen del suelo utilizando mediciones de densidad global y calcula el volumen de agua a partir de la humedad añadida. Utiliza este volumen de espacio de cabeza corregido en todos los cálculos posteriores.
3. Determinación del volumen de espacio libre en el vial (Vhs): Se refiere al volumen del frasco menos el volumen del suelo y el contenido de agua [Eq 2].
   [Eq 2]
4. Estimación del volumen de CO₂ en el vial
   1. Obtener el volumen de CO₂ en el vial a partir de las lecturas IRGA de la concentración de_CO2 (%), considerando la cabeza efectiva del volumen del vial [Eq 3].
      
      [EQ 3]
5. Estimación de los moles de CO₂ exhalados de las muestras de suelo:
   1. Obtén los moles de CO₂ exhalados de las muestras de suelo resolviendo n en la ecuación de la ley de gases ideales (P ∙ V = n ∙ R ∙ T) [Eq 4], tras reemplazar el V previamente calculado en [Eq 3].
      [EQ 4]
6. Estimación del flujo de CO₂ (mg_{C-CO 2} ^kg-1 suelo seco ^día-1)
   1. Se deben añadir mediciones individuales de %_CO2 y estimar el flujo final de_CO2 usando [Eq 5] con las siguientes consideraciones: i) peso muestral correcto considerando la humedad del suelo; ii) considerar que un mol de_CO2 representa 12 g de C (12000 mg C).
      
      [EQ 5]
      donde:
      P = presión de gas dentro del vial. Esto debería ser equivalente a atmosférico (atm). Correcto para tus valores de ubicación.
      Vhs = volumen de espacio libre de gas en el vial (L)
      [% CO₂ ]= concentración de_CO2 medida con la IRGA
      R = constante de gas = 0,082 L·atm· K⁻¹·mol⁻¹
      T = Temperatura de incubación en kelvin
      Suelo seco = masa de suelo seco en kg
      t = tiempo de incubación en días
      Un flujo de trabajo resumen del protocolo se muestra en la Figura 1.

Figura 1: Flujo de trabajo del protocolo de respiración basal del suelo basado en IRGA, desde el muestreo y preacondicionamiento del suelo hasta la incubación, medición IRGA y cálculos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Resultados

Los resultados mostrados en este artículo corresponden a un experimento en el que suelos de baja fertilidad fueron modificados con compost para aumentar los parámetros de fertilidad y la actividad microbiológica. Los suelos originales fueron estudiados en el "desierto de Tabernas" (sureste de España), una región de clima semiárido y suelos pobres y^{desarrollados.} Aproximadamente se tomaron muestras de 40 kg de los 30 cm superiores de un campo agrícola, se llevaron ...

Discusión

La respiración del suelo es un indicador sensible de la actividad microbiana y la descomposición de materia orgánica, proporcionando información destacada sobre los efectos de la gestión del suelo ^23,24. El enfoque experimental descrito en este artículo proporciona un marco sencillo y potente para cuantificar la actividad microbiana del suelo mediante mediciones de emisiones de CO₂ bajo condiciones de laboratorio

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2 mm sieve
Matrazes o frascos herméticos con septos (100 mL)
Balanza analítica
Extractor de placa de presión de bar	Soil Moisture Equipment Corp, Goleta, CA, USA	1600F1	Para calcular la capacidad de campo
Agua desionizada o agua destilada esterilizada
Equipo de incubación	VWR Inc. Radnor, PA, USA	IL 250R PREMIUM
Marcador indeleble
Medidor de concentración de IRGA CO2	Ametek Inc. Berwin, PA, USA	CheckMate 4	https://www.ametekmocon.com/products/headspacemapgasanalyzers/checkmate-4
Bolsas y cajas isotérmicas			Para transportar suelos al laboratorio
Horno de laboratorio			Debe permitir un ajuste de 105ºC
Cámara de flujo laminar	CRUMA	HZ-1	Opcional en el paso 2.3
Tapón con septo para sellar los frascos herméticamente
Muestras de suelo			Recolectadas de manera representativa del área a estudiar.
Reactivos esterilizantes			Se puede usar lejía (10%) o etanol (70%)