Un protocolo estandarizado para evaluar la toxicidad por cadmio en organoides colorrectales humanos mediante un ensayo de viabilidad basado en luciferasa

Resumen

El protocolo tiene como objetivo establecer organoides colorrectales humanos y evaluar un ensayo de bioluminiscencia ATP basado en luciferasa para detectar toxicidad inducida por cadmio. Evalúa la viabilidad y sensibilidad del ensayo cuantificando los cambios en la viabilidad organoide dependientes de la dosis y del tiempo.

Resumen

El cadmio (Cd) está clasificado como carcinógeno de Grupo 1 y constituye un grave problema ambiental global. Este estudio tenía como objetivo establecer un modelo de organoide colorrectal humano y evaluar la viabilidad y sensibilidad de un ensayo de bioluminiscencia con ATP basado en luciferasa para detectar respuestas tóxicas de organoides colorrectales (COs) a la exposición a CDs. Las células madre se aislaron de tejido colorrectal humano y se cultivaron en una matriz tridimensional de la membrana basal para generar COs. Los organoides se trataron con una serie graduada de concentraciones de Cd para diferentes duraciones de exposición. Se añadió un reactivo de viabilidad luminiscente a un volumen igual, mezclado suavemente meciéndolo a temperatura ambiente para promover la lisis y la penetración del reactivo, y luego incubado para permitir que la reacción bioluminiscente avanzara. La luminiscencia se registraba en modo luminiscencia en un lector de microplacas multimodo. Se utilizó ajuste de la curva dosis-respuesta para calcular la concentración inhibitoria media máxima y evaluar cambios en la viabilidad o viabilidad relativa. Las células madre primarias se aislaron con éxito del tejido colorrectal humano y se utilizaron para generar COs. La exposición a la CD produjo disminuciones en la actividad metabólica organoide dependiente de la dosis y del tiempo; El análisis dosis-respuesta arrojó curvas de supervivencia y valores de IC50 para los organoides. Este estudio ofrece orientación metodológica y conocimientos prácticos para utilizar COs humanos en estudios de toxicología ambiental de metales pesados.

Introducción

El CD es un metal pesado de origen natural clasificado como carcinógeno de Grupo 1 y se ha convertido en una preocupación ambiental^{global 1}. La exposición humana al CD ocurre principalmente por inhalación y ingesta dietética. Aunque la exposición crónica a dosis bajas se asocia con una variedad de efectos adversos para la salud, reducir sustancialmente su uso y liberación ambiental sigue siendo un reto ^2,3. Los cultivos bidimensionales tradicionales crecen sobre sustratos planos y carecen de arquitectura tisular, polaridad celular y microambiente tumoral. En consecuencia, poseen una capacidad limitada para recapitular la heterogeneidad in vivo y respuestas toxicológicas auténticas a la exposición al^{cadmio 4}. Estos sistemas no pueden modelar adecuadamente las interacciones célula-célula, el crecimiento dependiente de la matriz ni los procesos biológicos que subyacen al desarrollo de la resistencia a^{fármacos 5}. Los sistemas organoides tridimensionales derivados de tejidos de pacientes ofrecen una plataforma más relevante fisiológicamente en comparación con las líneas celulares bidimensionales^{convencionales 6}. Los organoides conservan las características genómicas, la organización histológica y los estados funcionales del tejido primario. Esto permite un modelado más preciso del crecimiento, evolución y sensibilidad tumoral a la toxicidad por cadmio, proporcionando claras ventajas para la modelización de enfermedades y la investigación^{toxicológica 7}. Los CO poseen una arquitectura tridimensional compleja, heterogeneidad celular y capacidades intrínsecas para la autorrenovación y autoorganización ^8,9. El trasplante de COs en ratones receptores puede promover la autorrenovación de las células madre intestinales y modular el microambiente inmunológico del huésped, produciendo efectos^{protectores 4}. En 2009, Sato et al. demostraron por primera vez que una sola célula madre intestinal adulta Lgr5⁺ puede autoorganizarse y diferenciarse espontáneamente para formar estructuras criptovellosidades que abarcan todas las líneas celulares^{intestinales 10}.

El epitelio intestinal constituye la primera línea de defensa contra la toxicidad por CD tras la ingestión. De hecho, la biodisponibilidad oral del Cd suele estar por debajo del 5%. La toxicidad intestinal inducida por CD se caracteriza por la alteración de las uniones intercelulares, el aumento de la permeabilidad paracelular y la inducción de respuestas inflamatorias. Además, el Cd perturba la función inmunitaria intestinal y altera la composición y homeostasis de la microbiota^{intestinal 11}. Dependiendo de la dosis y duración de la exposición, el CD puede causar desregulación del ciclo celular, promoviendo fenotipos oncogénicos en algunos contextos y induciendo apoptosis en otros. La CD puede estimular indirectamente la producción de ROS (especies reactivas de oxígeno), desencadenando estrés oxidativo y desequilibrio redox. La función de receptores, quinasas, fosfatasas, proteasas, moléculas de adhesión y factores de transcripción puede modularse mediante señalización redox. Cd también perturba las cascadas de señalización, alterando el estado de activación de ERK1/2, JNK (quinasa N-terminal c-Jun) y p38 MAPK (proteína quinasa activada por mitógeno p38) en múltiples tipos^{celulares 12}. Al activar ERK1/2 dentro de la cascada MAPK, Cd puede promover la proliferación y supervivencia celular, suprimir la muerte celular programada y contribuir a la hiperproliferación^{aberrante 13}. La CD puede regular directa o indirectamente la expresión y actividad de proteínas efectoras clave. Por ejemplo, regula a la baja el supresor tumoral p53 y alza proteínas antiapoptóticas como Bcl-2 y Bcl-xL, alterando finalmente la apoptosis y la homeostasis del ciclo^{celular 14}.

En los modelos de CO utilizados para evaluar los efectos citotóxicos de la Cd, la medición del contenido de ATP se emplea ampliamente para evaluar la viabilidad de los organoides. El ATP, la molécula central del metabolismo energético, refleja directamente el estado metabólico general y la viabilidad de los organoides. Al exponerse al cadmio en los COs, el Cd induce principalmente disfunción mitocondrial, agrava el estrés oxidativo y altera la homeostasis de la energía organoide. Estos eventos en conjunto afectan la producción de ATP y, en última instancia, reducen la viabilidad organoide. Por lo tanto, los cambios en los niveles de ATP sirven como una lectura funcional robusta de la citotoxicidad inducida por el cadmio. Los ensayos convencionales de citotoxicidad incluyen ensayos colorimétricos MTT/CCK-8, tinción viva/muerta y análisis basados en citometría de flujo. En comparación con estos métodos, los ensayos basados en ATP ofrecen ventajas claras en sistemas organoides tridimensionales. Debido a la complejidad estructural y la pronunciada heterogeneidad espacial de los organoides, los enfoques tradicionales de tinción e imagen suelen estar limitados por una penetración inadecuada del tejido y una precisión cuantitativa reducida. En cambio, los ensayos de ATP se basan en una reacción bioluminiscente mediada por la luciferasa, lo que permite la cuantificación directa sin alterar la estructura organoide. La medición de ATP muestra una alta sensibilidad y un amplio rango dinámico. Esto permite la detección de respuestas biológicas continuas, que van desde la supresión metabólica temprana hasta la muerte de organoides, facilitando análisis precisos dosis-respuesta a diferentes concentraciones de cadmio. Los niveles de ATP reflejan de manera integral el estado funcional general de los organoides, superando a los enfoques basados en la evaluación morfológica o en marcadores moleculares individuales. Por ello, este ensayo es especialmente adecuado para el cribado de toxicidad de alto nivel, ofreciendo mejor estabilidad y reproducibilidad.

El principio fundamental subyacente al uso de la bioluminiscencia de ATP para evaluar la sensibilidad de los COs a la exposición a Cd es que la luciferasa luciferasa de luciérnagas cataliza la oxidación de D-luciferina en presencia de ATP, Mg²⁺ y O₂ para producir oxiluciferina y emitir fotones. La intensidad de la luz emitida es proporcional al contenido medible de ATP en la muestra dentro de un rango lineal definido. Por lo tanto, la luminiscencia actúa como un sustituto cuantitativo indirecto para la actividad o viabilidad metabólica celular. Los organoides están incrustados en una matriz extracelular y poseen una estructura tridimensional multicapa. Para acomodar esto, los reactivos de ensayo ATP cuentan con composiciones y procedimientos optimizados de lisis-tampón. Estas optimizaciones mejoran la alteración de las células organoides internas, promueven la liberación de ATP y estabilizan la señal^{bioluminiscente 15}. Es importante destacar que la bioluminiscencia del ATP informa de actividad metabólica en lugar de un recuento celular exacto. Por ejemplo, los inhibidores mitocondriales pueden reducir notablemente los niveles celulares de ATP en intervalos cortos, incluso cuando las células siguen siendo viables. Por el contrario, algunas formas tempranas de muerte celular pueden conservar temporalmente niveles relativamente altos de ATP.

A pesar de demostrar una relevancia fisiológica superior en las evaluaciones de toxicidad por cadmio (Cd), los modelos organoides colorrectales presentan varias limitaciones prácticas. En comparación con las líneas celulares bidimensionales (2D) tradicionales, el cultivo de organoides es más laborioso y costoso. Además, su dependencia de matrices derivadas de animales introduce variabilidad de lote a lote, lo que limita su utilidad en el cribado de toxicidad a gran escala y alto consumo. Aunque estos modelos son muy apropiados para evaluar los efectos toxicológicos directos de los metales pesados sobre el epitelio intestinal, aún no pueden reemplazar completamente los modelos in vivo para evaluar toxicidad sistémica o procesos toxicocinéticos complejos.

En este estudio, se utilizó tejido colorrectal humano como material fuente para aislar células madre colorrectales y establecer COs in vitro. Los organoides estuvieron expuestos a CD en diversas concentraciones y durante diferentes duraciones de exposición. La luminiscencia se medía entonces usando el lector de microplacas multimodo en modo de detección de luminiscencia. Se calcularon y visualizaron los valores de viabilidad de las celdas o IC50 utilizando software operativo para un lector específico de microplacas.

Protocolo

El experimento fue aprobado por el Comité de Ética del Colegio de Salud Profesional de Suzhou (Aprobación nº SWYXLL202516) y se llevó a cabo conforme a los estándares éticos médicos. Todos los sujetos de esta investigación proporcionaron su consentimiento informado por escrito.

1. Aislamiento del tejido colorrectal humano y establecimiento de COs

1. Transporte y conservación de muestras de tejido
   1. Antes del experimento, descongela lentamente la matriz de membrana basal a 4 °C y equilibra el medio de cultivo requerido a la temperatura ambiente.
   2. Colocar inmediatamente tejido colorrectal humano extraído de procedimientos clínicos en una solución de preservación de tejido preenfriada (2–8 °C).
      NOTA: Asegúrese de que el tejido permanezca completamente sumergido durante el transporte. Transfiere las muestras al laboratorio.
2. Debajo de un armario de bioseguridad, coloque el tejido en un plato de cultivo de 6 cm para su evaluación. Retira cuidadosamente el tejido adiposo visible y las capas musculares usando un bisturí y pinzas, manteniendo los componentes epiteliales.
3. Transfiere el tejido a una bandeja de 6 cm que contenga 3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con 300 μL de antibióticos. Corta el tejido en fragmentos de 2 mm × 5 mm.
4. Transfiere los fragmentos de tejido a un tubo centrífuga de 50 mL.
5. Añadir 10 mL de PBS preenfriado y 200 μL de 0,5 M EDTA (concentración final ~10 mM) al tubo.
6. Coloca el tubo sobre un shaker a temperatura ambiente y agita suavemente a 0,072 g durante 15 minutos.
7. Utiliza pinzas para transferir el tejido al recipiente de cultivo y examinarlo al microscopio. Procede al siguiente paso una vez que las estructuras de la cripta sean visibles o comiencen a desprenderse.
   NOTA: Cuando las estructuras criptóticas se vuelven visibles bajo observación microscópica tras el tratamiento con EDTA, la digestión generalmente ha alcanzado un nivel suficiente para aislar criptas, y las criptas comienzan a desprenderse de fragmentos de tejido epitelial aflojados. Las criptas intactas suelen conservar una morfología glandular o tubular bien definida con un lumen central discernible, mientras que una digestión excesiva produce un gran número de células individuales disociadas y restos necróticos.
8. Terminar la digestión una vez que numerosas criptas intactas sean visibles y los fragmentos de tejido parezcan sueltos y translúcidos, permitiendo que el pipeteo suave libere fácilmente las criptas.
   NOTA: La incubación prolongada de EDTA altera la integridad de la cripta, aumenta la acumulación de residuos celulares y reduce la viabilidad de las células madre intestinales, disminuyendo así la eficiencia posterior de la formación de organoides.
9. Añade 15 mL de PBS suplementado con antibióticos para detener la digestión de EDTA. Mezcla suavemente.
10. Centrifuga la muestra a 300 × g durante 3 minutos a 4 °C.
11. Quita el sobrenadante.
12. Añade 1 mL de medio celular completo y transfiere la suspensión a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
13. Centrifuga la suspensión a 300 × g durante 3 minutos y descarta el sobrenadante.
14. Añade 500 μL de la matriz de membrana basal a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL y mezcle bien.
15. Minimizar la exposición a la temperatura ambiente durante la mezcla y mantener la matriz de la membrana basal sobre hielo para evitar una solidificación prematura.
16. Añadir 25 μL de la mezcla gota a gota en cada pozo de la placa de 24 pozos para formar una gota.
17. Invierte la placa de 24 pozos e incubala a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 20 minutos.
18. Añade 600 μL de medio de cultivo de CO a cada pozo.
19. Obtén medio de cultivo organoide colorrectal y reactivos de disociación de fuentes comerciales y úsalos estrictamente conforme a las instrucciones del fabricante.
20. Para preparar el medio de cultivo celular completo, se suplementa 500 mL de medio basal DMEM con 50 mL de suero fetal bovino (FBS) y 5 mL de penicilina-estreptomicina. Mezcla la solución bien mediante una inversión suave.

2. Ensayo de sensibilidad de COs expuestos a Cd

1. Enchapado y cultivo de COs en placas de 96 pozos
   1. Descarta el medio de cultivo de cada pozo y añade 500 μL de solución de disociación organoide. Pipetea suavemente arriba y abajo para dispersar la matriz de membrana basal.
   2. Coloque la placa tratada en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ para la digestión, con un tiempo inicial de digestión de 10 minutos.
   3. Recoge la solución digestiva de cada pozo de la placa de 24 pozos en un tubo centrífuga de 15 mL y añade 10 mL de medio completo de cultivo celular.
   4. Centrifugar a 300 × g durante 3 minutos para recoger el organoide y desechar el sobrenadante.
   5. Añade 1 mL de medio de cultivo celular completo, mezcla bien pipeteando y transfiere la suspensión a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
   6. Centrifuga a 300 × g durante 3 minutos y luego descarta el sobrenadante.
   7. Añade 100 μL de la matriz de membrana basal y mezcla bien pipeteando.
   8. Disociar los organoides y estimar el número de células individuales bajo un microscopio antes de sembrar aproximadamente entre 3.000 y 5.000 células individuales por pozo.
   9. Mantener una densidad de siembra relativamente constante en todos los grupos experimentales para asegurar el crecimiento reproducible de organoides y los resultados experimentales.
   10. Ajustar el rango de siembra basándose en la evaluación microscópica tras la disociación de organoides y en condiciones previamente reportadas comúnmente utilizadas en estudios de cultivo de organoides.
   11. Añade 6 μL de la mezcla al centro de cada pozo de una placa de 96 pozos. Utiliza un total de 30 pozos, con tres réplicas técnicas.
   12. Invierte la placa e incubala a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂ durante 15 minutos.
   13. Añade 100 μL de medio de cultivo organoide a cada pozo de la placa de 96 pozos.
   14. Inicia el tratamiento con cadmio exactamente 7 días después de la siembra.
       NOTA: Este periodo de cultivo de 7 días permite que las células individuales se desarrollen completamente en COs estructuralmente intactos.
2. Dilución de la concentración de CD
   1. Disuelva 3,67 mg de polvo de cloruro de cadmio en 2 mL de agua ultrapura estéril para preparar una solución de 10 mM con un volumen final de 2 mL.
   2. Esteriliza los 2 mL de solución de cadmio de 10 mM pasándolos por un filtro de 0,22 μm.
   3. Alicuota la solución de cadmio esterilizada en tubos centrífugos de 1,5 mL y alódalos a 4 °C, protegidos de la luz.
   4. Lleva el equipo de protección individual (EPI) adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes protectores y gafas de seguridad, durante todo el experimento.
   5. Realizar todas las operaciones relacionadas dentro de una campana extractora química para minimizar los riesgos de exposición.
   6. Clasificar y gestionar todos los residuos que contienen Cd, incluidos los medios de cultivo suplementados con cadmio, puntas de pipeta, tubos de centrífuga y platos de cultivo, como residuos químicos peligrosos.
   7. Desecha estos materiales en recipientes designados para la recogida de residuos líquidos o sólidos de metales pesados.
   8. Eliminar todos los residuos estrictamente conforme a las directrices institucionales y a las normativas medioambientales locales.
   9. Nunca trates los residuos de CD como basura de laboratorio general ni los tires por el fregadero.
   10. Etiqueta la tapa de una placa de 24 pozos como 4, 3, 2, 1 y 0.
       NOTA: Tratar los organoides con Cd a concentraciones finales de 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM y 0 μM. La dilución de la solución de stock de cadmio se calculó usando la fórmula estándar:
               C₁ V₁ = C₂ V₂
3. Para preparar 4 mL de la concentración de trabajo de 20 μM, añadir 8 μL de la solución original de 10 mM a 3992 μL de medio de cultivo completo. Mezcla bien la solución para asegurar una distribución uniforme.
   1. Añade 1,4 mL de medio de cultivo a los 4 pozos etiquetados y añade 700 μL de medio de cultivo a cada uno de los pozos restantes.
   2. Retirar 5,6 μL de medio de cultivo del pozo 4 etiquetado y añadir 5,6 μL de solución de cadmio. Mezcla bien.
   3. Transfiere 700 μL de la solución del pozo etiquetado '4' al pozo etiquetado '3' y mezcle bien.
   4. Repite el proceso de transferencia y mezcla de cada pozo al siguiente pozo con números más bajos (de '3' a '2', '2' a '1' y '1' a '0'), mezclando a fondo en cada paso.
      NOTA: No realices ninguna operación en el pozo etiquetado 0.
   5. Retira la placa de 96 pozos de la incubadora y descarta el medio de cultivo existente.
   6. Etiqueta la tapa de la placa de 96 pozos de izquierda a derecha como 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM y 0 μM.
   7. Añadir 100 μL de medio de cultivo que contenga cadmio a cada pozo etiquetado correspondiente.
   8. Coloca el plato en la incubadora.

3. Adición del reactivo de viabilidad luminiscente

1. Retira el reactivo de viabilidad luminiscente del congelador de −20 °C y déjalo descongelarse a temperatura ambiente. Añade el reactivo de viabilidad luminiscente en una proporción de volumen 1:1.
2. Añade 2,5 mL de reactivo de viabilidad luminiscente a un depósito de reactivo desechable.
3. Añade 2,5 mL de medio de cultivo organoide colorrectal y mezcla bien pipeteando.
4. Utiliza un sistema de aspiración de residuos para extraer el medio de cultivo organoide de cada pozo de la placa de 96 pozos. Evita aspirar la matriz de membrana basal de los pozos.
5. Transfiere 200 μL de la solución desde el yacimiento desechable del reactivo a cada pozo de la placa de 96 pozos que contiene COs, y mezcla a fondo mediante pipeteo vigoroso. Evita introducir burbujas de aire durante el pipeteo.
6. Incuba el plato a temperatura ambiente durante 25 minutos. Incuba a temperatura ambiente protegido de la luz.

4. Medición de reactivos de viabilidad luminiscente

1. Abre el software operativo para el lector específico de microplacas (Figura suplementaria 1A).
2. Haz clic en Leer ahora (Figura suplementaria 1B).
3. Haz clic en Nuevo (Figura suplementaria 1B).
4. Haz clic en Leer (Figura suplementaria 1C).
5. Seleccione luminiscencia (Figura suplementaria 1D).
6. Seleccione fibra de luminiscencia (Figura suplementaria 1D).
7. Haz clic en OK (Figura suplementaria 1D).
8. Seleccione la plancha completa (Figura suplementaria 1E).
9. Haz clic en Borrar todo (Figura suplementaria 1F).
10. Seleccione las posiciones correspondientes en la placa objetivo de 96 pozos, para un total de 15 pozos (Figura suplementaria 1G).
11. Haz clic en OK (Figura suplementaria 1G).
12. Coloque la placa de 96 pozos en el instrumento (Figura suplementaria 1H).
13. Seleccionar Usar tapa (Figura suplementaria 1I).
14. Haz clic en OK para comenzar la medición (Figura suplementaria 1I).
15. Tras completar la medición, haga clic en Exportar para exportar los datos a Excel (Figura Suplementaria 1J).

5. Procesamiento y análisis de datos

1. Software abierto de análisis estadístico de datos capaz de regresión no lineal. (Figura suplementaria 2A).
2. Seleccione una tabla de datos XY (Figura suplementaria 2A).
3. Ajusta X a números (Figura suplementaria 2A).
4. Configura Y para introducir valores replicados en subcolumnas lado a lado e introduce 3 réplicas (Figura suplementaria 2A).
5. Introduce los datos (Figura suplementaria 2B).
6. Análisis de clics (Figura suplementaria 2C).
7. Haz clic en análisis XY (Figura suplementaria 2D).
8. Haz clic en regresión no lineal (ajuste de curva) (Figura suplementaria 2D).
9. Haz clic en OK. (Figura suplementaria 2D).
10. Selecciona dosis-respuesta – Inhibición (Figura suplementaria 2E).
11. Seleccione la respuesta logarítmica vs. normalizada – pendiente variable (Figura suplementaria 2E).
12. Haz clic en OK para ejecutar el análisis (Figura suplementaria 2E).
13. Haz clic en archivo (Figura suplementaria 2F).
14. Haz clic en Exportar (Figura suplementaria 2F).
15. Haz clic en OK (Figura suplementaria 2G).

Resultados

Establecimiento de oficiales humanos
Aislamos con éxito las estructuras de cripta colorrectal de muestras de tejido, y la morfología típica de cripta se observó claramente tanto en microscopía de baja como de alta aumentación. Durante el cultivo in vitro, las criptas aisladas se expandieron gradualmente y mostraron un proceso ordenado de maduración morfológica (Figura 1A,B). Para el día 3 y 6 de cultivo, se habían formado organoides colorrectales estructuralmente intactos, predominantemente mostrando estructuras esféricas o similares a brotes tempranos (Figura 1C,D).

Sensibilidad de los COs a la exposición a CDs
Los COs se sembraron en placas de 96 pozos y se cultivaron durante 5 días adicionales, seguidos de un tratamiento con cadmio a concentraciones de 0, 5, 10, 20 y 40 μM. Tras 72 horas de exposición, se realizó un ensayo de luminiscencia basado en ATP para medir las unidades relativas de luminiscencia (RLU), y los datos fueron analizados y visualizados. Los resultados demostraron un descenso significativo en la viabilidad organoide dependiente de la dosis con el aumento de las concentraciones de cadmio (Figura 2A). Los COs expuestos a cadmio de 10 μM, 20 μM y 40 μM mostraron valores de RLU notablemente reducidos (Figura 2B). No observamos toxicidad significativa en organoides colorrectales expuestos a 5 μM de Cd. En consonancia con los datos de viabilidad, el análisis morfológico reveló alteraciones estructurales pronunciadas en organoides colorrectales tratados con cadmio, incluyendo reducción del tamaño de los organoides, alteración severa de la arquitectura epitelial y fragmentación estructural progresiva (Figura 2C). Estos hallazgos indican que los organoides colorrectales son altamente sensibles a la citotoxicidad inducida por el cadmio.

Figura 1: Aislamiento de criptas colorrectales humanas y establecimiento de cultivos organoides colorrectales. (A) Imagen representativa de criptas colorrectales humanas aisladas. (10×). (B) Vista de alta ampliación de una sola cripta (20×). (C) Imagen representativa de los COs tras 3 días en cultivo (4×). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Alteraciones citotóxicas y morfológicas inducidas por CD en COs. (A) Curva dosis-respuesta relativa de COs expuestos a concentraciones variables de Cd. El eje x representa las concentraciones de Cd y el eje y indica la viabilidad relativa del organoide. (B) Valores relativos de RLU de COs tras el tratamiento con concentraciones variables de Cd. El eje X representa las concentraciones de Cd y el eje Y indica los valores relativos de RLU. ANOVA unidireccional *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. (C) Imágenes representativas en campo claro de COs no tratados (0 μM) y tratados con CD a 5 μM, 10 μM, 20μM, 40μM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Un flujo de trabajo detallado de 16 pasos para la detección de RLU utilizando el software operativo de un lector de microplacas específico. (A) Icono de software. (B) Interfaz de lanzamiento por software. (C) Menú de ajustes. (D) Interfaz de selección de ensayo. (E) Menú de configuración de la disposición de las placas. (F) Disposición predeterminada de la placa. (G) Configurar las posiciones del pozo según la disposición experimental de la placa. (H) Cargando la microplaca. (I) El instrumento inicia la medición de la LU. (J) Exportación de datos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Tras la exportación de datos, el procesamiento de datos y el análisis estadístico se realizan en software de análisis estadístico. (A) Pantalla de inicio. (B) Tabla de introducción de datos. (C) Diálogo de análisis. (D) Menú de parámetros de análisis. (E) Menú de configuración para regresión no lineal. (F) Menú de opciones de archivo. (G) Diálogo de exportación de datos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este estudio establece un protocolo estandarizado para los ensayos de exposición al cadmio y viabilidad del ATP utilizando COs para evaluar el impacto del cadmio en la viabilidad de los organoides. Este protocolo optimiza específicamente los pasos de disociación de organoides y de placado de 96 pozos para mejorar la reproducibilidad experimental y la estabilidad de las lecturas posteriores de ensayos de ATP. Aunque el protocolo experimental actual se centra principalmente en establecer un modelo 3D de organoides colorrectales para la evaluación de toxicidad por CD, una amplia investigación ha demostrado que los cultivos celulares 2D tradicionales y los modelos organoides 3D difieren significativamente en respuestas a fármacos, interacciones célula-célula, arquitectura tisular y perfiles toxicológicos. En comparación con las monocapas 2D, los organoides recapitulan con mayor fidelidad la arquitectura espacial, la heterogeneidad celular y el microambiente in vivo de los tumores, ofreciendo una relevancia fisiológica superior. Debido a la ausencia de interacciones complejas célula-célula y matriz extracelular (ECM), la respuesta de los cultivos 2D a la exposición a metales pesados puede no capturar con precisión los procesos toxicológicos genuinos in^{vivo 16}. Por el contrario, el modelo de CO establecido en este estudio simula eficazmente la dinámica tridimensional del crecimiento de los tejidos tumorales, proporcionando una plataforma altamente relevante fisiológicamente para evaluar la toxicidad inducida por Cd.

Durante el paso organoide, el tiempo de disociación se mantuvo estrictamente en aproximadamente 10 minutos. Esta optimización previene la disociación incompleta, que conduce a agregados celulares excesivamente grandes, y también evita la sobredisociación, que produce un número excesivo de células individuales. Al controlar con precisión el grado de disociación, logramos estructuras organoides relativamente uniformes, mejorando la consistencia de los tratamientos farmacológicos posteriores y los ensayos de viabilidad de ATP.

Empleamos un sistema de cultivo de alto rendimiento de 96 pozos y estandarizamos el volumen de la matriz de la membrana basal a 6 μL por pozo. Esta estandarización minimiza la variabilidad entre pozos al garantizar la consistencia de la densidad y características de crecimiento de los organoides en todos los pozos, mejorando en última instancia la reproducibilidad experimental y la comparabilidad de los datos. Al acoplar ensayos de luminiscencia de ATP con análisis de la curva dosis-respuesta utilizando software de análisis estadístico de datos, logramos una evaluación cuantitativa robusta de los cambios en la viabilidad de los organoides tras la exposición al Cd. En conjunto, este estudio establece un protocolo experimental altamente reproducible para la aplicación de modelos organoides en toxicología ambiental y exposición a metales pesados.

Durante el cultivo de COs, la mezcla exhaustiva del pellet cripto con la matriz de membrana basal es un paso crítico para asegurar la formación adecuada de COs y un crecimiento estable. La proporción de la matriz de membrana basal debe mantenerse por encima del 70% (el volumen de la matriz basal > 70%). Los volúmenes recomendados de la matriz de membrana basal son 6 μL por pozo para placas de 96 pozos, 20 μL por pozo para placas de 48 pozos y 25 μL por pozo para placas de 24 pozos. Tras la polimerización matricial, se añaden los siguientes volúmenes a los pozos: 100 μL por pozo para placas de 96 pozos, 300 μL por pozo para placas de 48 pozos y 500 μL por pozo para placas de 24 pozos. Se debe tener cuidado para evitar el pipeteo directo del medio sobre las cúpulas de la matriz de membrana basal, ya que esto podría alterar la arquitectura tridimensional. Para preservar la estabilidad fenotípica y genética, este estudio limitó el uso de organoides colorrectales a un máximo de 4 vías.

Cuando las criptas o COs alcanzan un diámetro aproximado de 600 μm o presentan oscurecimiento y detención del crecimiento, el paso debe realizarse rápidamente para permitir análisis de sensibilidad posteriores. Durante la disociación enzimática de COs, la digestión debe monitorizarse bajo un microscopio. Si los COs no se disocian suficientemente en pequeños grupos celulares o células individuales, el tiempo de digestión puede extenderse gradualmente en función del tamaño del organoide y el estado de disociación. Se debe evitar la digestión prolongada en un solo paso para minimizar el riesgo de sobredigestión y pérdida de viabilidad celular.

Calcula la viabilidad relativa de cada pozo usando la siguiente ecuación y utiliza el porcentaje medio de pozos replicados como valor de respuesta para cada concentración

 

El ensayo de bioluminiscencia ATP se basa en la oxidación catalizada de luciferasa luciferasa de luciérnagas de D-luciferina, que da lugar a la emisión de fotones. Debido a su alta sensibilidad, compatibilidad con formatos de placa de alto rendimiento y disponibilidad de kits comerciales estandarizados, este método se ha aplicado ampliamente para el cribado preliminar de toxicidad en modelos^{organoides 17}.

Deben considerarse varios factores de confusión. Ciertos compuestos pueden inhibir directamente la reacción enzimática luciferasa mediante interferencia química o supresión enzimática, lo que conduce a la extinción de la señal. La luminiscencia de fondo de la matriz extracelular tridimensional, la heterogeneidad en el tamaño y densidad de los organoides, y la lisis incompleta pueden introducir una variabilidad considerable entre pozos e interlotes. La luminiscencia basada en ATP por sí sola no puede distinguir con precisión las modalidades de muerte celular ni aclarar los mecanismos toxicológicos^{subyacentes 18}.

Para mejorar la fiabilidad metodológica, se recomiendan medidas sistemáticas de control de calidad. utilizando buffers de lisis recomendados por el fabricante o previamente validados, y ciclos de lisis extendidos, disociación mecánica o congelación-descongelación cuando sea necesario para mejorar la eficiencia de la lisis celular dentro de la matriz. En segundo lugar, realizar experimentos de recuperación por pico de ATP durante la optimización del ensayo para evaluar la posible inhibición directa de la reacción luminiscente por parte de los compuestos de prueba o el entorno de lisis. Tercero, confirmar el rango de detección lineal usando una curva estándar ATP y controlar estrictamente el tiempo entre la adición de reactivos, incubación y lectura de placas para minimizar la variabilidad técnica. Por último, incluir controles en blanco, vehículos y negativos en cada ensayo e incorporar réplicas técnicas suficientes para evaluar y corregir los efectos de borde y la variación relacionada con lotes. Recientemente, se han desarrollado varios ensayos de viabilidad optimizados para organoides con una química de lisis mejorada y una mayor estabilidad de la señal, y estas formulaciones han demostrado generalmente un rendimiento superior en ensayos de toxicidad^{tridimensional 19}. En resumen, este estudio empleó COs humanos como modelo in vitro de toxicología ambiental de metales pesados y estableció un ensayo de alto rendimiento y sensible basado en bioluminiscencia de ATP para evaluar la susceptibilidad de los organoides a la exposición al CD. Este trabajo proporciona una referencia experimental práctica y una guía metodológica para la evaluación de toxicidad en sistemas de investigación basados en organoides.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150
1mL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-well plates	Corning Incorporated	3524
50 mL centrifuge tubes	CLUXCELL	321050
96-well plates	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	El software operativo para lector específico de microplacas.
Cadmium chloride,10g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability Assay	Vazyme	DD1102-01/02/03	Reactivo de viabilidad celular luminiscente en una proporción de volumen 1:1.
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	thermo fisher	6125552
Forceps	Beyotime	FS019
Ice box	Beyotime	FBX078
Low-temperature high-speed centrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	La matriz de la membrana basal
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	Solución de disociación de organoides
Penicillin-Streptomycin	Beyotime	C0222
Phosphate-buffered saline (1XPBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032
Pipettes	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		El software operativo para lector específico de microplacas.
Scissors	Beyotime	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S