Artículo de método

Aislamiento y aplicación terapéutica de vesículas extracelulares derivadas de agregados de células madre mesenquimales autoensambladas

DOI:

10.3791/70534

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24 de abril de 2026

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1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of Stomatology, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 4The second Department of Surgery, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 5Military Medical Innovation Center, The Fourth Military Medical University, 6School of Basic Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, 7Department of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of The Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este protocolo detalla el aislamiento eficiente de grandes vesículas extracelulares (LEVs) a partir de agregados de células madre autoensambladas y su aplicación terapéutica para la regeneración ósea mandibular.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las vesículas extracelulares (EV) son mediadores vitales de la comunicación intercelular y prometedores agentes libres celulares para la medicina regenerativa. Entre las subpoblaciones de EV, las grandes vesículas extracelulares (LEVs) son especialmente adecuadas para la reparación tisular debido a su carga pro-regenerativa enriquecida. Sin embargo, los métodos estandarizados y reproducibles para generar LEVs funcionales derivados de células madre dentales para caracterización posterior y evaluación terapéutica siguen siendo limitados. Aprovechando el excepcional potencial osteogénico de las células madre de la papilla apical (SCAPs), desarrollamos un modelo de cultivo 3D bajo condiciones de baja adhesión para inducir agregados SCAP autoensamblados. Este modelo imita la condensación mesenquimalesa fisiológica, mejorando significativamente las interacciones célula-célula y aumentando la secreción de LEV. Se proporcionan parámetros clave de cultivo y notas de manejo para mejorar la consistencia agregada y maximizar la producción de LEV, manteniendo la viabilidad de la célula. Aquí presentamos un protocolo estandarizado para la producción eficiente de LEVs funcionales derivados de SCAP, que abarca la generación de agregados 3D, aislamiento mediante centrifugación diferencial, análisis de distribución y concentración de partículas basados en análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), y administración terapéutica utilizando un hidrogel termoreticulado para la reparación de defectos óseos mandibulares. Este enfoque agiliza la producción de LEV para estudios mecanicistas posteriores y evaluaciones preclínicas en la regeneración craneofacial. Este flujo de trabajo optimizado garantiza la preparación reproducible de LEVs bioactivos con rendimientos consistentes y carga proosteogénica enriquecida, facilitando la investigación fundamental y acelerando la traducción clínica de la reconstrucción craneofacial mediada por EV. En aplicaciones representativas, los LEVs cargados con hidrogel proporcionan un depósito localizado en los sitios defectuosos y facilitan un manejo conveniente durante la implantación. En conjunto, este método proporciona una plataforma escalable para preparar LEVs derivados de SCAP y destaca consideraciones clave para la estandarización de informes y el diseño de estudios traslacionales. Este enfoque favorece una adopción más amplia en los laboratorios de vehículos eléctricos craneofaciales.

Introducción

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Las vesículas extracelulares (EV) son nanopartículas unidas a membranas liberadas por las células que median la comunicación intercelular mediante la transferencia de cargas bioactivas como proteínas, miARN y lípidos 1,2,3. Entre las subpoblaciones de EV, las grandes vesículas extracelulares (LEVs) se distinguen por su liberación directa de la membrana celular y el enriquecimiento inherente de moléculas pro-regenerativas, lo que las hace muy adecuadas para la reparación y regeneración de tejidos 4,5. En medicina regenerativa, los EVs derivados de células madre mesenquimales (MSC) son cada vez más reconocidos como una alternativa viable libre de células a la terapia de célulascompletas 6,7,8. Recapitulan los efectos regenerativos paracrinos de las MSC parentales evitando limitaciones del trasplante celular directo, como baja eficiencia de enjerto, inmunogenicidad y variabilidad enlotes 7,8,9,10. Entre las fuentes de MSC, las células madre de la papilla apical (SCAPs) presentan un potencial de diferenciación osteogénico yodontogénico superior 11,12,13, lo que hace que los EVs derivados de SCAP sean especialmente atractivos para la reparación orofacial de hueso y tejido dental 8.

Cabe destacar que la biogénesis y funcionalidad de los VE están profundamente influenciadas por el microambiente celular14,15. Los cultivos monocapa bidimensionales convencionales (2D) se desvían significativamente del contexto tisularnativo 16,17, produciendo frecuentemente EVs con capacidad regenerativacomprometida 18. En contraste, los agregados tridimensionales (3D) autoensamblados de MSC replican aspectos clave de la condensación mesenquimatal fisiológica, una etapa de desarrollo caracterizada por alta densidad celular, contacto intensivo célula-célula y matriz extracelular enriquecida (ECM), que proporciona soporte estructural y proporciona señales bioquímicas y mecánicas que regulan la adhesión, migración y decisiones de destino celular 19,20,21. Este microentorno 3D biomimético no solo mejora la comunicación intercelular y la señalizaciónparacrina 22,23, sino que también promueve la secreción de vehículos eléctricos con mayor rendimiento y perfiles bioactivos de cargamejorados 24,25,26. El uso de agregados MSC autoensamblados en 3D surge así como una estrategia muy prometedora para obtener vehículos eléctricos funcionalmente potentes para aplicacionesregenerativas 18.

A pesar de las claras ventajas de los VE derivados de agregados, los protocolos estandarizados para su aislamiento y caracterización de sistemas 3D siguen poco desarrollados. Las metodologías actuales de aislamiento de VE, como la centrifugación diferencial, están bien establecidas y ofrecen un marco escalable para la producciónde VE. De manera similar, se han informado métodos para generar agregados de MSC, a menudo basados en el curling celular inducido por vitamina C y la agregación a partir de células cultivadas en2D. Sin embargo, la arquitectura de la ECM dentro de estos agregados inducidos por vitamina C puede diferir aún del microambiente espacialmente organizado y similar a la condensación de los tejidos mesenquimales nativos. En cambio, el autoensamblaje libre de andamios bajo condiciones de baja adhesión facilita la formación de agregados compactos y esféricos que se aproximan a características clave de la condensaciónmesenquimalesa 19,29. Actualmente, falta un flujo de trabajo sistemático y reproducible para aislar y aplicar los EVs a partir de agregados SCAP 3D inducidos por baja adhesión. Desde un punto de vista práctico, la producción de LEV a partir de cultivos convencionales de SCAP 2D suele situarse en el rango de ~1011 partículas/mL según el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), y se espera que la agregación 3D de baja adhesión aumente la salida de LEV varias veces mientras mantiene la reproducibilidad para aplicaciones posteriores. Para abordar esta brecha, detallamos aquí un protocolo completo que aprovecha la funcionalidad osteogénica/odontogénica inherente de los SCAP y optimiza el microentorno MSC mediante agregación 3D de baja adhesión. Este protocolo permite la producción fiable de LEVs de alta calidad, proporcionando una herramienta estandarizada para avanzar en terapias regenerativas libres de células en la medicina craneofacial.

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Protocolo

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Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de la Cuarta Universidad Médica Militar y se realizaron en cumplimiento de las directrices de ARRIVE. La recogida y el uso de muestras humanas fueron aprobados por el Comité de Ética de la Cuarta Universidad Médica Militar (nº de aprobación). IRB-REV-2022187). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los donantes antes de la recogida de muestras; Para los donantes que eran menores o que no pudieran dar su consentimiento, se obtenía el consentimiento informado por escrito de sus tutores legales. Todos los reactivos fueron filtrados con estéril, y los procedimientos de cultivo celular se realizaron en un gabinete de bioseguridad para mantener la esterilidad (véase la Tabla de Materiales). Trata todos los materiales de origen humano (dientes, tejidos, células primarias, medios condicionados y preparaciones para EV) como potencialmente infecciosos. Realizar todos los procedimientos que impliquen muestras humanas en un gabinete de bioseguridad certificado utilizando el equipo de protección individual (EPP) adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes y protección ocular. Para la bioseguridad y la eliminación de residuos, seguir las directrices institucionales BSL-2: Manipular todos los materiales de origen humano y desechables contaminados como residuos biohazard BSL-2; Descontamina superficies/equipos con un desinfectante aprobado institucionalmente después de su uso. Recoge los residuos líquidos de riesgo biológico en recipientes etiquetados e inactívalos utilizando métodos aprobados antes de su eliminación. Desecha los objetos punzantes inmediatamente en recipientes aprobados (sin retapar la tapa). Tratar los tejidos animales/cadáveres y residuos anestésicos/químicos como residuos biológicos/químicos regulados y deshacerse de ellos a través de servicios institucionales según la normativa aplicable.

1. Aislamiento y cultura de los SCAPs humanos

NOTA: La P/S es una mezcla bioactiva de antibióticos y puede causar irritación en la piel o los ojos o reacciones alérgicas. Asa en un armario de bioseguridad BSL-2 al abrirla; llevar guantes y protección ocular; evitar la generación de aerosoles; y eliminar los residuos conforme a las directrices institucionales sobre residuos químicos. La colagénasa tipo I (solución) es una enzima bioactiva y puede causar irritación en la piel o los ojos o reacciones alérgicas. Asa en un armario de bioseguridad BSL-2; llevar guantes y protección ocular; evitar salpicaduras y la generación de aerosoles durante el pipeteo; y descontaminar los vertidos de forma rápida según los procedimientos institucionales. Proteger la colagnosa tipo I de la luz durante el almacenamiento y el uso (véase la Tabla de Materiales).

  1. Recoger los terceros molares con ápices inmaduros de donantes sanos (16–21 años) y enjuagar a fondo con solución salina protegida con fosfato (PBS) que contenga 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) (véase la Tabla de Materiales).
  2. Disecciona el tejido de la papilla apical desde el ápice radicular usando pinzas y tijeras oftálmicas estériles, y luego triturarlo en pequeños fragmentos (<1mm 3).
  3. Transfiere todos los fragmentos de tejido a un tubo centrífuga de 15 mL. Digiera los fragmentos con 2 mg/mL de colagnosa tipo I a 37 °C durante 1 hora, agitando suavemente cada 15 minutos.
  4. Detener la digestión añadiendo un volumen igual de medio esencial completo α-mínimo (α-MEM) (véase la Tabla de Materiales).
    NOTA: El tiempo de digestión de la colágenosa tipo I no es fijo y depende del estado digestivo del tejido. Vigila de cerca y termina la digestión cuando los tejidos se corroen parcialmente añadiendo medio. La digestión excesiva puede afectar la viabilidad celular.
  5. Centrifugar la suspensión de la celda a 100 × g durante 5 minutos a 4 °C, descartar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 2 mL de α-EM completo.
  6. Siembra la suspensión de tejido digerido en una placa de Petri de 10 cm y añade 8 mL de α-MEM completo a un volumen final de 10 mL por plato.
  7. Cultiva SCAP a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO₂.
    NOTA: Monitoriza los cultivos continuamente, las células suelen migrar fuera de los fragmentos de tejido y se adhieren al plato en un patrón radial en un plazo de 3 a 7 días. Si la viabilidad tisular es pobre o no se observa migración celular en 5 días, se cambia a α-MEM completo suplementado con suero al 20%.
  8. Para el paso celular, las células fueron lavadas con 5 mL de PBS para eliminar el medio residual una vez que alcanzaron el 80–90% de confluencia. Posteriormente, fueron incubados con 2 mL de tripsina al 0,25% a 1 mM EDTA a 37 °C durante 2 minutos (véase Tabla de Materiales).
    NOTA: La tripsina-EDTA es un irritante y puede dañar la piel y los ojos. Manipula con guantes y protección ocular, evita salpicaduras y formación de aerosoles, y enjuaga inmediatamente con mucha agua si hay contacto. Eliminar los residuos líquidos que contienen tripsina según las directrices institucionales.
  9. Cuando las células se redondean con las uniones intercelulares alteradas bajo el microscopio, despega suavemente las células del plato sin daños estructurales excesivos. Neutraliza la tripsina añadiendo 4 mL de α-MEM completo.
  10. Recoge las celdas pipeteando suavemente y repetidamente en un tubo centrifugador nuevo de 15 mL. Tras centrifugar a 100 × g durante 5 minutos, descartar el sobrenadante y volver a suspender la pastilla en α-MEM completo. Siembra las células resuspendidas en recipientes de cultivo frescos o platos de pozo. Cambia el medium cada dos días.
    NOTA: Asegúrese de que los SCAP utilizados para el cultivo de agregados estén dentro del pasaje 5. La capacidad de formación y de agregación disminuye con el aumento del númerode pasos 30,31, lo que puede reducir la eficiencia agregada de la formación y el rendimiento funcional.

2. Autoensamblaje de agregados SCAP

  1. Cosechar el paso de 3–5 SCAPs por tripsinización, centrifugar a 100 × g durante 5 minutos y resuspender en α-MEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) con 10% de EV y 1% P/S (véase Tabla de Materiales).
    NOTA: Preparar el FBS agotado en EV centrifugando el FBS a 150.000 × g a 4 °C durante la noche para eliminar EVs y otrasimpurezas 32.
  2. Contar las células usando un hemocitómetro y semilla 1 × 105 células por pozo en placas de 24 pozos de unión ultra baja. Ajusta el volumen medio a 500 μL por pozo para mantener el estado de suspensión.
  3. Incubar las placas a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 72 horas y reemplazar el medio de cultivo cada 48 horas.
  4. Monitoriza la formación de agregados diariamente bajo un microscopio óptico invertido. Recogen los VE cuando los agregados alcanzan entre 200 y 400 μm de diámetro y presentan una estructura compacta y de bordes suaves.
    NOTA: Defina un "lote" de producción como LEVs aislados del medio acondicionado agrupado recogido de agregados SCAP sembrados el mismo día desde el mismo paso celular y mantenidos bajo condiciones idénticas de cultivo dentro de una única ventana de recogida (72 horas). Procesa cada lote de forma independiente mediante centrifugación. Sustituye el sustrato de cultivo a las 48 horas tras la siembra y repone con el mismo volumen de sustrato fresco. Para la producción de LEV, se recoge el medio acondicionado a las 48 h y de nuevo a las 72 h tras la siembra, y agrupa el medio cosechado (fracciones de 0–48 h y 48–72 h) en un solo lote. Mantén el medio acondicionado agrupado a 4 °C y procesa para aislar los LEVs.

3. Aislamiento y caracterización de vehículos eléctricos a partir de agregados SCAP

  1. Centrifugación diferencial para aislamiento de grandes LEVs
    1. Recoge el medio de cultivo que contiene agregados SCAP en tubos centrífugas de 15 mL.
    2. Centrifugar a 800 × g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar agregados intactos y restos de celdas grandes.
    3. Transfiere el sobrenadante a nuevos tubos de 15 mL y centrifugar a 2.500 × g durante 15 minutos a 4 °C para eliminar plaquetas residuales y fragmentos celulares pequeños.
    4. Transfiere cuidadosamente el sobrenadante a tubos cónicos estériles de 1,5 mL y centrifugar a 16.800 × g durante 30 minutos a 4 °C para pelletar los LEVs.
      NOTA: Utilice tubos cónicos de 1,5 mL para mejorar el rendimiento de los LEVs.
    5. Descartar el sobrenadante, volver a suspender el pellet en 1 mL de PBS estéril y centrifugar de nuevo a 16.800 × g durante 30 minutos a 4 °C utilizando un rotor de ángulo fijo (compatible con una centrífuga estándar de bancada) para pelletar los LEVs.
    6. Ajusta la desaceleración/freno a un ajuste "lento" o "bajo" (normalmente freno Nivel 1 o 2) para evitar la resuspensión del proyectil LEV durante la fase final de desaceleración.
    7. Desechar el sobrenadante y volver a suspender el último pellet LEV en 50 μL de PBS estéril. Usa la suspensión inmediatamente (en menos de 24 horas) o guárdala a 4 °C. Evita congelar para minimizar la pérdida de bioactividad.
      NOTA: Preparar aproximadamente 80 pozos de agregados para obtener suficientes LEVs para experimentos típicos aguas abajo. Se recomiendan muestras de LEVs para su caracterización inmediata o aplicación terapéutica en lugar de almacenamiento a largo plazo. Si se requiere un almacenamiento más largo, se alicuota la suspensión LEV (por ejemplo, 5–10 μL por tubo) para evitar fluctuaciones repetidas de temperatura y ciclos de congelación-deshielo. Congelar de repente las alicotas sobre hielo seco y almacenarlas a −80 °C para almacenamiento prolongado a corto plazo (por ejemplo, hasta 1–3 meses). Descongela una vez en hielo y úsalo inmediatamente. Ten en cuenta que la congelación puede reducir la bioactividad y puede alterar la recuperación o distribución del tamaño de las partículas; por lo tanto, siempre que sea posible, realizar estudios funcionales utilizando LEVs recién preparados. Para el control de calidad tras el almacenamiento, remide la concentración y distribución de tamaño de partículas usando NTA, y procede solo si los valores permanecen dentro del rango de aceptación predefinido. Además, en este protocolo, la concentración de partículas NTA se utiliza como método principal de cuantificación para evitar la pérdida de vesículas asociadas a ensayos basados en proteínas como el BCA, maximizando así el rendimiento para aplicaciones posteriores.
  2. NTA para tamaño y concentración de partícula
    NOTA: El NTA se realiza utilizando un analizador de seguimiento de nanopartículas disponible comercialmente (véase Tabla de Materiales) para evaluar la distribución de tamaño y la concentración de partículas.
    1. Diluir 1 μL de la suspensión de LEVs (de la Sección 3.1, Paso 6) en 1.499 μL de PBS estéril en un tubo cónico estéril de 1,5 mL y mezclar bien.
    2. Inicia el software compatible y llena la celda de muestra con 10 mL de agua ultrapura. Confirma que el recuento de partículas de fondo es < 10 por fotograma para asegurar que el sistema esté limpio (véase Tabla de Materiales).
    3. Calibra el instrumento con una solución estándar preparada. Configura los parámetros del software en: Sensibilidad 70, Obturador 70, Área mínima 5 y Brillo mínimo 20. Realiza el "AutoAlineamiento" para asegurarte de que el láser está enfocado. Ajusta la dilución estándar hasta que el recuento de partículas mostrado en el software sea 50–400 (preferiblemente ~200) y luego ejecuta el programa de calibración.
      NOTA: Prepara la solución estándar reconstituyendo 1 μL de perlas de calibración en 1 mL de agua destilada para obtener una solución primaria. Diluir 100 μL de la solución primaria en 25 mL de agua destilada (dilución 1:250.000) y almacenarla a 4 °C durante hasta 1 semana.
    4. Enjuaga la celda de muestra con 5 mL de agua destilada antes del análisis.
    5. Lava el canal con 1 mL de agua destilada y confirma que el recuento de partículas en la interfaz de detección es <10.
    6. Inyectar 1 mL de la muestra diluida de LEVs a una velocidad constante de 0,5 mL/s usando una jeringuilla estéril de 1 mL.
      PRECAUCIÓN: Controla manualmente la jeringuilla para mantener una velocidad de inyección estable.
    7. Realizar análisis de partículas y generar informes. En el software, crea una nueva medición y selecciona el modo Tamaño/Concentración. Ajusta la adquisición a 3 grabaciones, 60 s por grabación, a 25 °C usando los mismos parámetros de detección que en el Paso 3 (Sensibilidad 70, Obturador 70, Área mínima 5, Brillo mínimo 20).
    8. Inicia la adquisición y verifica que el recuento de partículas en pantalla se mantenga dentro de 50–400 partículas/fotograma (preferiblemente ~200); si está fuera de este rango, detén y ajusta la dilución de la muestra, luego repite el Paso 6. Tras la adquisición, realiza el análisis para obtener el tamaño medio, el tamaño del modo, D10/D50/D90 y la concentración de partículas (partículas/mL). Luego exporta los gráficos de distribución de resultados y tamaños como .csv y .pdf (o formatos de informe equivalentes) y guarda el archivo de medición para el registro.

4. Aplicación terapéutica de los LEVs en la regeneración del hueso mandibular

  1. Preparación de hidrogel cargado con LEV
    1. Prepara la culata del Pluronic F-127 (20% en mano/v). Añadir polvo de F-127 plurónico a PBS estéril hasta una concentración final del 20% (p/v) y remover a 4 °C durante la noche hasta que esté completamente disuelto y homogéneo (véase la Tabla de Materiales). Mantén la solución a 4 °C durante toda la preparación para evitar la gelificación prematura.
      NOTA: El F-127 plurónico al 20% (p/v) es líquido a 4 °C y sufre termogelación a ~20–25 °C (dependiente del tubo/habitación); se convierte en un gel estable a 37 °C.
    2. Carga LEVs en condiciones de frío. Preenfría los tubos, las puntas de la pipeta y el hidrogel a 4 °C. Mezclar LEVs de 50 μg (equivalentes a LEVs de dos placas de agregados de 24 pozos) con 1 mL de F 127 plurónico al 20% mediante pipeteo suave y vórtices breves a baja velocidad para asegurar una distribución uniforme. Mantén la mezcla sobre hielo o a 4 °C hasta la implantación.
    3. Guía de manejo/uso (para reproducibilidad). Realiza la carga y la carga con jeringuilla/punta rápidamente sobre hielo. Si la mezcla se calienta por encima de ~20–25 °C, la viscosidad aumenta y puede comenzar la gelificación; en ese caso, volver a 4 °C hasta que el material vuelva a ser completamente fluido antes de su uso. Tras la colocación en el defecto, permite que la gelificación ocurra in situ a temperatura corporal (37 °C).
  2. Establecimiento del modelo de defecto óseo mandibular murino
    1. Anestesiar ratones C57Bl/6 de 8 semanas (machos o hembras) mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg) (véase Tabla de Materiales).
      PRECAUCIÓN: El pentobarbital sódico es un sedante/anestésico potente y es tóxico para las personas si se inyecta, ingiere o inhala accidentalmente. Prepara y administra usando prácticas seguras para los punzantes (no recapchar las agujas; desechar inmediatamente en un recipiente para punzantes), usar guantes y protección ocular, evitar el contacto con la piel y almacenar/registrar su uso según las políticas institucionales de drogas controladas. Confirma la anestesia adecuada en los ratones comprobando la ausencia del reflejo corneal y la ausencia de retiro de las extremidades por pinzadura de las almohadillas. Aplica una pomada oftálmica protectora para evitar el resecamiento corneal.
    2. Afeitar el pelaje de la región mandibular izquierda y desinfectar alternativamente con 10% de povidona-yodo y 75% etanol.
      PRECAUCIÓN: El etanol al 75% es altamente inflamable; Úsalo lejos de las fuentes de encendido y asegura una buena ventilación. El yodo de povidona puede causar irritación en la piel o los ojos o reacciones alérgicas; Lleva guantes, evita el contacto con los ojos o la mucosa y limpia los derrames rápidamente.
    3. Realiza una incisión longitudinal de 1 cm a lo largo del borde mandibular y disecciona de forma directa los tejidos blandos para exponer el ángulo mandibular.
    4. Crea un defecto óseo circular (2 mm de diámetro) utilizando un taladro dental con irrigación salina continua para evitar daños térmicos (véase la Tabla de Materiales).
      PRECAUCIÓN: Vigila de cerca el sangrado intraoperatorio, controla la hemorragia con pequeñas bolas de algodón para mantener el campo quirúrgico despejado y reduce el riesgo de infección. Evita contactar con los tejidos blandos circundantes con el taladro para evitar que se enreden.
  3. Implantación de hidrogel cargado con LEV
    1. Carga la mezcla de LEV-hidrogel en una jeringuilla estéril e inyecta en el defecto óseo, asegurando el llenado completo.
      NOTA: Administrar ~10 μg LEVs por ratón. Se requieren dos placas de 24 pozos de agregados SCAP para obtener suficientes LEVs para un experimento con n = 5 ratones.
    2. Para el grupo de control, inyectar un volumen igual de hidrogel F-127 plurónico sin LEVs.
    3. Sutura la incisión con suturas absorbibles 4-0 y administra analgesia subcutánea (Carprofeno, 5 mg/kg) para aliviar el dolor postoperatorio (véase la Tabla de Materiales).
      PRECAUCIÓN: El carprofeno es un AINE farmacológicamente activo y puede ser perjudicial si se inyecta accidentalmente o si entra en contacto con la piel o los ojos. Lleva guantes, evita lesiones punzantes, desecha las agujas/jeringuillas en un recipiente para objetos punzantes y desecha los medicamentos no utilizados y materiales contaminados según los procedimientos de residuos farmacéuticos institucionales.
    4. Coloca a los ratones sobre una manta recalentadora hasta que se recuperen de la anestesia, luego transfírelos a jaulas individuales con acceso libre a comida y agua.
      NOTA: No dejes a los ratones sin supervisión hasta que recuperen suficiente conciencia para mantener la reclinación esternal. Devuelva a los ratones a alojamientos grupales solo después de una recuperación completa.

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Resultados

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Según el flujo de trabajo experimental, se ejecutaron con éxito pasos clave como el aislamiento de SCAP, la formación de agregados, la extracción de LEVs y la implantación terapéutica (Figura 1). Los terceros molares impactados clínicos de donantes mostraron ápices inmaduros con tejido papilar apical intacto adherido alrededor de los orificios abiertos del conducto radicular, confirmando la fuente adecuada de SCAP (Figura 2A). C...

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Discusión

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El creciente interés en terapias regenerativas libres de células ha posicionado a los LEVs derivados de células madre mesenquimales como alternativas prometedoras al trasplante de células completas, debido a su capacidad para entregar moléculas bioactivas sin los riesgos asociados a los enfoques basados en células. Sin embargo, la traducción clínica de las terapias basadas en LEV se ha visto dificultada por la falta de sistemas de cultivo fisiológicamente relevantes que puedan preservar ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2021YFA1100600), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82471011, 82401201), el Proyecto del Laboratorio Estatal Clave de Reconstrucción y Regeneración Oral y Maxilofacial (2024MS04), la Fundación Científica Postdoctoral de China (BX20230485) y el Proyecto del Programa de Cooperación e Intercambio de Laboratorios Socios de la Cuarta Universidad Médica Militar (2024HB014).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 mL de jeringuilla con agujaBD300841Anestesiación
Plato de cultivo celular de 10 cmCorning353003Cultivo celular
Tubo centrífugo de poliestireno de 15 mLCorning352095Cultivo celular
Desinfectante de etanol al 75%Hai Shi Hai NuoHS-750Funcionamiento
Sutura absorbible 4-0Jinhuan MedicalR413Funcionamiento
Centrífuga de mesaWIGGENSCE187Aislamiento de vehículos eléctricos
Incubadora de CO2, 150 L, tipo universalThermoFisher51032874Cultivo celular
Colagenasa Tipo IThermoFisher17100017Cultivo celular
Bolas de algodónDeroyal30-033Funcionamiento
Tijera de Operación CurvaInstrumento Quirúrgico JZJ21040Funcionamiento
Unidad de Turbina Móvil DentalKaVoS609CFuncionamiento
Balance electrónicoZhi KeZK-DSTCultivo celular
Tubo de EppendorfEppendorf3810XAislamiento de vehículos eléctricos
Pinza, bienInstrumento Quirúrgico JZJD1020Funcionamiento
Crema depilatoriaVeet1.00097E+11Funcionamiento
Bufón de bola de alta velocidadDentsply SironaE0123Funcionamiento
Pieza de mano de alta velocidadKaVoKV-1-008-1644Funcionamiento
Microscopio invertidoMshotMF53-NCultivo celular
MEM y Alpha; (Medio Esencial Mínimo &alfa;)ThermoFisher12561056Cultivo celular
Microscopio de vídeo de seguimiento de nanopartículas PMX-120Particle MetrixZetaView PMX120Análisis de seguimiento de nanopartículas
Penicilina-estreptomicina (P/S)ThermoFisher15140122Cultivo celular
Pentobarbital sódicoSigma-Aldrich57-33-0Anestesiación
Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS)ThermoFisher10010023Cultivo celular
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443Implantación de EV
Solución de Yodo PovidonaBaxter PROSL500Funcionamiento
Suero Fetal Bovino Especial (FBS)ThermoFisher12664025Cultivo celular
Bloque de gasa estérilVictorias10-000-681Funcionamiento
Microcentrífuga de alta velocidad de mesaHitachiCT15EAislamiento de vehículos eléctricos
Trephine DrillMicrofijación Biomet01-9182Funcionamiento
Tripsina-EDTAThermoFisher25200072Cultivo celular
Placa de fijación ultra-baja de 24 pozosCorning3473Cultivo celular
Genio mezclador de vórticesIndustrias científicasSI0425Implantación de EV

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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