Method Article

Descifrando el epitranscriptoma: Perspectivas en Silico sobre la red reguladora m6A en el cáncer de mama

DOI:

10.3791/70545

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June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo presenta un enfoque para realizar análisis genéticos, moleculares y pronósticos in silico de reguladores de modificación de m6A integrando perfiles de mutaciones, alteraciones en el número de copias, expresión génica y resultados clínicos utilizando conjuntos de datos públicos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA), el proyecto Genotype-Tissue Expression (GTEx) y plataformas de microarrays.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La N6-metiladenosina (m6A) es la modificación interna de ARN más abundante en los transcritos eucariotas y desempeña un papel fundamental en el metabolismo del ARN, la expresión génica y la homeostasis celular. La desregulación de los reguladores m6A, incluidos los "escritores", "gomas de borrar" y "lectores", se ha implicado cada vez más en la biología del cáncer; Sin embargo, sus funciones integrales en el cáncer de mama aún están por comprenderse. El objetivo principal de este artículo de métodos es proporcionar a los principiantes en bioinformática un marco paso a paso para utilizar conjuntos de datos públicos de cáncer para realizar análisis mutacionales, evaluar alteraciones en la expresión génica y examinar sus asociaciones con la supervivencia del paciente. Como estudio de caso, los reguladores m6A en cáncer de mama fueron analizados utilizando conjuntos de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA), el proyecto Genotype-Tissue Expression (GTEx) y plataformas de microarrays. Los perfiles transcriptómicos se analizaron sistemáticamente para demostrar los flujos de trabajo para evaluar la relevancia pronóstica de los componentes reguladores de m6A en el cáncer de mama. Utilizando este marco analítico, se identificaron patrones distintos de alteraciones genéticas y expresión diferencial entre los principales reguladores de m6A. Varios reguladores, incluyendo METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 y RBMX, se asociaron con una mejor supervivencia de los pacientes, mientras que YWHAG se asoció con una baja supervivencia global. Este estudio ofrece una visión integral de la genómica de sistemas sobre los genes reguladores m6A en el cáncer de mama, demostrando al mismo tiempo un flujo de trabajo práctico y reproducible en bioinformática basado en la web. Estos hallazgos avanzan en la comprensión de la regulación epitranscriptómica en el cáncer de mama y proporcionan una base para el desarrollo de nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas basadas en m6A.

Introduction

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Las modificaciones epitranscriptómicas representan una capa importante de regulación génica post-transcripcional y contribuyen a diversos procesos celulares y estados patológicos. Entre más de 170 modificaciones de ARN identificadas hasta la fecha, la N6-metiladenosina (m6A) es la más prevalente y mejor caracterizada en los ARNmeucariotas 1. Instalado por complejos "escritores" como METTL3/METTL14, eliminado por "borradores" como FTO y ALKBH5, e interpretado por proteínas "lectoras" que incluyen miembros de las familias YTH e IGF2BP, m6A orquesta el empalme, la estabilidad, el transporte y la traducción del ARN, influyendo así en procesos biológicos clave como el desarrollo, la diferenciación y la respuesta alestrés 2,3.

Se han reportado alteraciones en los componentes reguladores de m6A en un amplio espectro demalignidades 4. En muchos cánceres, la actividad aberrante de m6A impulsa fenotipos malignos; por ejemplo, la expresión elevada de METTL3 promueve la iniciación y progresión del cáncer de próstata modulando la vía del erizo y la metilación del ARNMYC 5,6. Inicialmente se encontró implicada en efectos oncogénicos en la leucemia mieloide aguda, pero la FTO demostró impulsar la progresión tumoral en cánceres de hígado, pulmón ycolorrectal 7,8,9,10. Sin embargo, se identificaron roles dependientes del contexto de FTO y ALKBH5 que ilustran la doble naturaleza de la regulación mediada por m6A, que puede promover tanto la señalización oncogénica como la supresoratumoral 11,12,13,14. También se ha encontrado que los lectores de M6A, incluyendo YTHDF1/2/3, ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNPs) y proteínas que se unen a mRNAm (IGF2BP1-3) similar a la insulina (-3), también están asociados con carcinogénesis 15,16,17.

En el cáncer de mama, cada vez hay más evidencia que sugiere que los reguladores de m6A suelen estar desregulados y pueden estar asociados con subtipos tumorales, características relacionadas con el sistema inmunitario y resultadosclínicos 18,19. Múltiples estudios mecanicistas sitúan a METTL3 como un factor pro-oncogénico frecuentemente aumentado en el cáncer de mama. La instalación de m6A mediada por METTL3 puede estabilizar o mejorar la traducción de transcritos que promueven la proliferación, la transición epitelial-mesenquimata (EMT), la metástasis y laquimiorresistencia 20. También se ha demostrado que METTL3 promueve la progresión del cáncer de mama al dirigirse aBcl-21. ALKBH5 ha estado implicado en la regulación de los programas de stemness del cáncer a través de NANOG y otras moléculas relacionadas con la stem, pero su influencia puede variar según el contextotumoral 22.

A medida que la lista de reguladores de m6A sigue ampliándose en los últimos años, es necesaria una actualización sobre cómo los reguladores recién identificados podrían estar desregulados en el cáncer de mama. La Tabla 1 ofrece una lista de reguladores m6A que incluyen escritores, lectores y borradores de modificaciones m6A. Además, se han identificado reguladores novedosos de m6A, incluyendo LRPPRC y YWHAG, con implicaciones en la progresión delcáncer 23,24,25. Por ello, se realizó una caracterización genética y molecular exhaustiva de todos los reguladores m6A conocidos en el cáncer de mama utilizando herramientas que pueden emplear investigadores con conocimientos bioinformáticos limitados.

El objetivo de este artículo de Métodos es presentar un protocolo de bioinformática basado en plataformas paso a paso para analizar reguladores m6A en cáncer de mama utilizando recursos de genómica del cáncer disponibles públicamente. Utilizando conjuntos de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), el proyecto Genotype Tissue Expression (GTEx) 26 y plataformas analíticas basadas en la web como cBioPortal y UCSC Xena, este protocolo demuestra flujos de trabajo reproducibles para evaluar perfiles mutacionales, alteraciones en la expresión génica y asociación con la supervivencia del paciente. Este enfoque visualizado y accesible está destinado a facilitar la adopción del análisis de datos epitranscriptómicos por parte de investigadores nuevos en bioinformática del cáncer.

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Protocol

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NOTA: La lista de genes que codifican reguladores de metilación m6A, categorizados como escritores, lectores y borradores, se presenta en la Tabla 1. Todos los genes listados se incluyeron en los análisis posteriores de mutaciones, patrones de expresión y supervivencia global. Todo el software y herramientas utilizados en este estudio están listados en la Tabla de Materiales.

1. Identificación de alteraciones genéticas en reguladores m6A

  1. Accede al cBioPortal para genómica del cáncer. Navega a la página web del cBioportal (www.cbioportal.org)27,28. Desde la página principal, selecciona la pestaña "Consulta" para comenzar un nuevo análisis.
  2. Selecciona el estudio y la cohorte de cáncer adecuados.
  3. En la barra de búsqueda "Seleccionar estudios para visualización y análisis", escribe "Carcinoma invasivo de mama" y selecciona "Carcinoma invasivo de mama (TCGA, Pan-Cancer Atlas)".
  4. Al final, selecciona "Consulta por gene".
    FUNDAMENTAL: Asegúrese de que la cohorte seleccionada (996 muestras) incluya tanto datos de mutación como de alteración del número de copia (CNA).
  5. Define la consulta genética. En la sección "Enter Genes", introduzca los símbolos del gen HUGO para la lista completa de reguladores m6A bajo investigación.
    NOTA: Los genes pueden introducirse como una lista separada por espacios. En "Seleccionar perfiles genómicos", asegúrese de que se marquen los siguientes dos tipos de datos: Mutaciones y Alteraciones del número de copia.
  6. En "Seleccionar Paciente/Conjunto de Casos", elige el conjunto de muestras por defecto que corresponda a la cohorte con todos los casos de perfil.
  7. Haz clic en el botón azul "Enviar consulta".
  8. Recupera e interpreta los datos de alteración genética. Al enviarlo, el resultado se cargará en la pestaña "resumen". La visualización central "OncoPrint" ofrece una visión inmediata de las alteraciones genéticas entre todos los genes consultados en la cohorte, que puede descargarse.
  9. Junto al OncoPrint, localiza el gráfico "Resumen de Tipo de Cáncer". Esto proporciona un desglose cuantitativo de las alteraciones entre subtipos de cáncer de mama.
  10. Realiza un análisis pan-canceroso. Vuelve a la página principal de cBioPortal y selecciona "TCGA PanCancer Atlas Studies" en la pestaña "Consulta".
  11. En la caja de entrada de genes, introduce la misma lista de genes reguladores m6A.
  12. Haz clic en "Enviar consulta" y en la página de resultados, accede a la pestaña "Resumen de tipos de cáncer". Esto ofrece una visión pan-cancerígena.

2. Análisis transcriptómico comparativo de reguladores m6A utilizando UCSC Xena.

  1. Accede a la plataforma Xena de UCSC. Accede a la página web de Xena de UCSC (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. Desde la página principal, haz clic en el botón "Lanzar Xena" para acceder al navegador principal de análisis.
  3. En el navegador Xena, haz clic en "DATA SETS".
  4. Entre los conjuntos de datos, selecciona "TCGA TARGET GTEx". Este contiene datos de ARN-Seq procesados uniformemente de los tejidos normales de los proyectos TCGA y GTEx.
  5. En la página siguiente, haz clic en "VISUALIZAR".
  6. Defina la variable fenotipo (grupo muestral). En la sección "Seleccionar tu primera variable", selecciona "Categoría principal" en el tipo de dato fenotípico.
  7. Haz clic en "TO SECOND VARIABLE". Luego, en el tipo de dato genómico, marca "Expresión génica" en el conjunto de datos. Añade la lista de genes en la casilla "Añadir gen o posición". Haz clic en "Hecho".
  8. Visualiza patrones de expresión con un mapa de calor.
  9. Para separar las muestras de pecho (TCGA+GTEx) del TCGA TARGET GTEx, escribe "Mama" y utiliza la opción de filtro para conservar las muestras.
  10. El mapa de calor ya es visible y se puede descargar en PDF.
  11. Genera diagramas de caja comparativas para genes individuales. Para cuantificar y visualizar las diferencias de expresión de un gen específico, utilice el "Ver como gráfico". Usando esta opción, los datos pueden verse como un diagrama de cajas, un diagrama de puntos y un gráfico de violín, comparando la distribución de expresiones entre los dos grupos muestrales.
  12. Utiliza la opción "Descargar en PDF" para descargar las listas.
  13. La significación estadística (p-valor) puede obtenerse haciendo clic en "ESTADÍSTICAS".

3. Evaluación de la importancia pronóstica de los reguladores m6A utilizando el plotter Kaplan-Meier.

  1. Accede a la herramienta Kaplan-Meier Plotter. Accede a la web de Kaplan-Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis)30.
  2. Desde la página principal, selecciona la pestaña "cáncer de mama" para iniciar un análisis específico de conjuntos de datos sobre el cáncer de mama.
  3. Configura la consulta de genes para un solo gen.
  4. En la sección de entrada principal, localiza la caja "Símbolo del Gene".
  5. Introduce el símbolo oficial del gen regulador m6A a analizar (por ejemplo, METTL3).
    CRÍTICO: Justo debajo de la casilla de entrada del gen, localice y active la casilla de verificación "Solo JetSet mejor conjunto de sondas". Esto garantiza que la sonda de microarray más fiable y específica se seleccione automáticamente para tu gen, optimizando la calidad y reproducibilidad de los datos.
  6. Define los parámetros del análisis de supervivencia. En la sección "Supervivencia", selecciona "Supervivencia global (SO)" como el punto final principal para este análisis. La herramienta utilizará automáticamente datos de 1880 pacientes con cáncer de mama cuando se seleccione esta configuración.
  7. Asegúrate de que la opción "Dividir pacientes por" esté configurada en "mediana". Esto estratificará a los pacientes en dos grupos iguales; alta y baja expresión, basados en el valor mediano de expresión del gen consultado en todas las muestras.
  8. El "umbral de seguimiento" puede usarse para seleccionar el periodo de seguimiento. Para este estudio, se seleccionaron 180 meses.
  9. Genera e interpreta la trama de Kaplan-Meier.
  10. Haz clic en el botón "Dibujar la trama de Kaplan-Meier".
  11. Se cargará una nueva ventana, mostrando la curva de supervivencia.
  12. Interpreta los elementos clave de la trama; El eje X indica el tiempo en meses, el eje Y muestra la probabilidad de supervivencia global, y las dos líneas de colores representan las curvas de supervivencia para los grupos de pacientes de alta expresión (rojo) y baja expresión (negro). Se muestra el valor P de rango logarítmico, que indica la significación estadística de la diferencia entre las dos curvas de supervivencia.

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Results

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Paisaje mutacional de los reguladores de metilación m6a en el cáncer de mama

En un estudio anterior sobre el análisis genómico de conjuntos de datos de TCGA, se reportaron mutaciones recurrentes en varios genes que codifican reguladores de la metilación delADN 31. En el presente estudio, cBioPortal se utilizó para analizar el conjunto de datos "Breast Invasive Carcinoma (TCGA, PanCancer Atlas)" con el fin de examinar los perfiles mutacionales de los gen...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El artículo de este Método ofrece un flujo de trabajo completo, accesible e integrado para el perfilado multiómico sistemático y la traducción clínica de cualquier firma génica en la investigación del cáncer, demostrado aquí mediante el análisis de reguladores de metilación del ARN m6A en el cáncer de mama. Al combinar estas principales plataformas públicas de bioinformática, este enfoque permite a los investigadores avanzar de manera eficiente desde el descubrimiento genómico hasta hipó...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Partes de este manuscrito fueron revisadas con la ayuda de herramientas de lenguaje basadas en IA para mejorar la claridad y la legibilidad. Todo el contenido sustantivo, interpretación, análisis y conclusiones son responsabilidad exclusiva de los autores. Declaramos que no existe conflicto de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Afortunadamente se reconoce una subvención de la Universidad Alfaisal (IRG 25450) a RM.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalMemorial Sloan-Kettering Cancer Centerhttps://www.cbioportal.org
Genotype-Tissue Expression (GTEx)Consorcio GTExhttps://gtexportal.org
Kaplan-Meier PlotterGyorffy lab/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
The Cancer Genome Atlas (TCGA)Instituto Nacional del Cáncer (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
Navegador Xena de UCSCUniversidad de California en Santa Cruzhttps://xenabrowser.net

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Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

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