Un sistema de contraselección basado en toxinas para la deleción génica sin marcador y la mutagénesis de transposones Tn5 de alta densidad en Pectobacterium brasiliense

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para generar deleciones génicas no marcadas y construir bibliotecas mutantes de inserción Tn5 a nivel genómico en Pectobacterium brasiliense, un fitópatógeno responsable de la patata negra y la podredumbre blanda. Este enfoque permite un análisis genético inverso eficiente y facilita la caracterización funcional de genes asociados a la virulencia en este organismo.

Resumen

Pectobacterium brasiliense es una bacteria altamente patógena responsable de la pudrición blanda del tubérculo de la patata, la pata negra y la podredumbre aérea del tallo. La elucidación de sus mecanismos patógenos es esencial para el control de enfermedades; sin embargo, las herramientas genéticas para este organismo siguen siendo limitadas. Se desarrolló un sistema de contraselección basado en toxinas para permitir la deleción génica sin marcadores y la mutagénesis de transposones Tn5 de alta densidad. La toxina vmi480 derivada del plásmido pLP12 se utilizó como marcador de contraselección para construir el vector suicida pKV2. Con este sistema, el gen recA de la cepa SM P. brasiliense fue eliminado con éxito. El mutante recA resultante sirvió como cepa parental para la construcción de una biblioteca de inserción Tn5 compuesta por más de 12.000 mutantes mediante conjugación con la cepa auxiliar RHO3 portadora de pKV2-LLtnp. En este plásmido derivado, la toxina vmi480 fue reemplazada por una transposasa Tn5 hiperactiva bajo el control de un promotor de laca orientado hacia fuera para reducir los efectos polares. Los ensayos de inoculación de tubérculos de alto rendimiento permitieron identificar mutantes deficientes en patogenicidad, incluyendo inserciones en el sistema de secreción tipo II, un determinante clave de virulencia que media la secreción de enzimas degradadoras de la pared celular vegetal. Esta plataforma apoya la genómica funcional y facilita la investigación de los mecanismos de virulencia en este patógeno de importancia económica.

Introducción

P. brasiliense es una de las especies más agresivas dentro del género Pectobacterium y es el agente causal de la podredumbre blanda de la patata, la pata negra y la podredumbre aérea^{del tallo.} Estas enfermedades provocan una pérdida estimada del 30% en el rendimiento de la patata, un cultivo que se sitúa como la tercera fuente de alimento más importante del mundo y un componente clave del sistema de producción agrícola^{de China 2}. A pesar de su impacto económico, los mecanismos moleculares que rigen la patogenicidad de P. brasiliense siguen siendo insuficientemente comprendidos, en gran parte debido a la falta de herramientas de manipulación genética eficientes y reproducibles para esta^{especie 3,4,5}.

Los estudios genómicos funcionales en muchas bacterias fitopatógenas se basan en sistemas robustos de intercambio alélico y mutagénesis de transposones; sin embargo, herramientas genéticas comparables para P. brasiliense siguen siendo limitadas o poco eficientes. En particular, los marcadores efectivos de contraselección compatibles con esta especie son escasos. Mientras que el gen sacB se utiliza ampliamente como marcador de contraselección para la deleción génica en diversas bacterias, P. brasiliense podría mostrar una alta tolerancia de hasta un 50% de sacarosa durante el proceso^{de selección 5}. Esta tolerancia probablemente refleja una falta de sensibilidad a las toxinas, posiblemente debido a la conversión enzimática de la sacarosa en polímeros de azúcar. Además, las altas concentraciones de sacarosa pueden inducir un shock osmótico perjudicial⁶. Además, métodos eficientes de mutagénesis a gran escala, como la construcción de bibliotecas de inserción de transposones Tn5, aún no han estado bien establecidos para este organismo.

Para abordar estas limitaciones técnicas, se desarrolló un sistema de contraselección basado en toxinas y se estableció un flujo de trabajo robusto de cribado de mutagénesis Tn5 para P. brasiliense. En comparación con los métodos tradicionales basados en sacarosa, este enfoque basado en toxinas ofrece ventajas claras, incluyendo una mayor rigurosidad de selección, mayor especificidad en la identificación de eventos de doble cruce y la eliminación del estrés osmótico confuso. Sistemas similares basados en toxina-antitoxina vmi480 se han implementado con éxito para superar barreras de selección en la especie 7 de Vibrio. La metodología establecida es muy aplicable a la caracterización funcional de alto rendimiento de genes desconocidos y proporciona una plataforma versátil que puede adaptarse a otras Pectobacteriaceae relacionadas de la podredumbre blanda.

Protocolo

1. Generación de un mutante de eliminación recA sin marcador en P. brasiliense

1. Extraer ADN genómico del plásmido SM y pKV2 de P. brasiliense (pLP12 derivado con modificación del marcador de selección antibiótica y del sitio de clonación múltiple) de la cepa donante de E. coli utilizando procedimientos estándar de preparación de ADN.
2. Verificar la calidad y concentración del ADN genómico extraído y del ADN plasmídico mediante electroforesis en gel de agarosa y espectrofotometría NanoDrop.
3. Linealizar el plásmido pKV2 mediante doble digestión con EcoRI y NheI a 37 °C durante 5 horas. Verificar la digestión completa mediante electroforesis en gel de agarosa y purificar el plásmido linealizado.
4. Identificar aproximadamente 800 pb regiones aguas arriba y aguas abajo del gen recA utilizando software de análisis genómico y diseñar los pares correspondientes de cebadores LBF/LBR y RBF/RBR (véase la tabla de materiales de todos los cebadores utilizados en este estudio).
5. Amplificar ambos brazos homólogos bajo condiciones estándar de ciclo de PCR y purificar los productos de PCR. Una PCR de 50 μL suele arrojar 2,5 μg de producto.
   NOTA: Los valores de Tm y el contenido de GC de los cebadores pueden ajustarse modificando los límites de las regiones homólogas.
6. Ensamblar el plásmido suicida recombinante pKV2-recA usando un kit de ensamblaje de ADN ligando los brazos homólogos purificados con la columna vertebral del plásmido linealizado.
7. Transformar la mezcla de ensamblaje en células λpir S17-1 químicamente competentes de E. coli mediante choque térmico, recuperar las células en el medio LB y placar sobre agar LB que contenga kanamicina (LB + kan).
   NOTA: Las concentraciones finales utilizadas son 50 mg/mL de kanamicina, 0,2% (p/v) de glucosa, 0,3% (p/v) de arabinosa y 0,3 mM de ácido 2,6-diaminopimélico (DAP).
8. Valida clones positivos mediante digestión por restricción o PCR en colonias. (Véase la Tabla de materiales para todas las recetas de medios utilizadas en este estudio).
9. Extrae el plásmido confirmado de pKV2-recA y transfórmalo en E. coli WM3064 usando una transformación por choque térmico (tasa de transformación esperada > 10⁶ cfu/μg).
10. Selecciona transformantes en agar LB que contiene kanamicina y ácido diaminopimélico (DAP).
11. Realizar la conjugación biparental mezclando cultivos nocturnos de la cepa donante (WM3064 pKV2-recA) y la receptora P. brasiliense SM en una proporción de 1:1 (v/v), lo que normalmente produce entre 10⁴ y^{10 6} transconjugantes por mililitro de células donantes y receptoras.
12. Lava el cultivo mezclado una vez con agua estéril, coloca la mezcla en agar LB suplementado con kanamicina y DAP, e incuba a 28 °C durante 48–72 horas.
    NOTA: Si no se observan transconjugantes, la proporción donante-receptor puede aumentarse a 2:1 (v/v) para mejorar la eficiencia de conjugación. Si se observa un alto crecimiento de fondo, el DAP residual puede eliminarse lavando el cultivo mezclado dos veces con agua estéril.
13. Recuperar la mezcla de conjugación y platicar sobre agar LB que contiene kanamicina y glucosa (sin DAP) para contraselección.
14. Elige 6–8 colonias y réplicalas en LB + kan y LB + kan + arabinosa.
15. Selecciona colonias que crecen en LB + kan pero no crecen en LB + kan + arabinosa; Estos son candidatos de primer cruce.
16. Inocular las primeras cepas cruzadas en el medio LB y incubar durante la noche. Placar los cultivos sobre agar LB que contiene L-arabinosa para inducir la segunda recombinación homóloga.
17. Elige varias colonias y réplicalas en LB + arabinosa y LB + kan. Selecciona colonias que crezcan en LB + arabinosa pero no en LB + kan; estos son mutantes de eliminación recA supuesta.
    NOTA: Si no se observan colonias tras el segundo evento de cruce, debe evaluarse la posible esencialidad del gen objetivo para el crecimiento bacteriano. Alternativamente, las regiones homólogas aguas arriba y aguas abajo pueden extenderse a 1.200 pb para mejorar la eficiencia de recombinación homóloga.
18. Confirmar los mutantes recA mediante PCR de colonias usando par cebador checkF/checkR diseñado para amplificar a través de las regiones promotor y terminator recA para verificar la deleción en cuadro del gen objetivo. Secuenciar el producto PCR para confirmar la eliminación precisa en cuadro de recA.
19. La deleción exitosa se indica mediante una reducción en el tamaño del producto de la PCR, que debería corresponder a la longitud del fragmento de tipo salvaje menos la longitud específica del segmento génico eliminado.

2. Construcción de pKV2-LLtnp para la mutagénesis de Tn5 en P. brasiliense

1. Amplifica el casete transposasa Tnp de pMCS2-LLtnp⁸ usando el par de cebadores Tnp-F/Tnp-R, y amplifica la columna vertebral oriγR6K del Tn5 de pKV2 usando el par de cebadores ori-F/ori-R. Purifica todos los productos de PCR usando un kit de purificación de ADN.
2. Monta el casete Tnp purificado y la columna vertebral oriγR6K Tn5 usando un kit de ensamblaje de ADN. Transformar la mezcla de ensamblaje en células λpir químicamente competentes de E. coli S17-1 mediante choque térmico, recuperar en un medio LB y placar sobre agar LB suplementado con kanamicina (LB + kan).
3. Valida los clones positivos mediante PCR de colonias usando pares de cebadores ori-F/ori-R y Tnp-F/Tnp-R.
4. Prepara células competentes de E. coli en RHO3 inoculando una sola colonia en medio LB e incubándolas durante la noche. Diluye el cultivo 1:100 en medio fresco de LB y crece hasta un OD₆₀₀ de 0,6.
5. Enfría el cultivo sobre hielo y lava las células tres veces con 0,1 M CaCl₂ preenfriado. Suspende el último pellet en 500 μL de glicerol preenfriado al 20% y guárdalo a −80 °C.
6. Transformar 10 μL del plásmido recombinante validado (pKV2-LLtnp) en 100 μL de células competentes en RHO3 mediante choque térmico (tasa de transformación esperada > 10⁶ cfu/μg). Incuba sobre hielo durante 30 minutos, haz choque térmico a 42 °C durante 45 segundos, y luego enfría sobre hielo durante 2 minutos.
7. Añade 500 μL de medio y incuba a 37 °C durante 1 hora con agitación. Placar sobre agar LB que contiene kanamicina y DAP (LB + kan + DAP) e incubar a 37 °C durante la noche.
8. Validar transformantes RHO3 positivos mediante PCR de colonias usando Tnp-F/Tnp-R.

3. Construcción de la biblioteca de mutantes transposones Tn5 en P. brasiliense

1. Cultivar P. brasiliense ΔrecA en medio LB a 28 °C y cultivar RHO3/pKV2-LLtnp en medio LB suplementado con kanamicina y DAP (LB + kan + DAP) a 37 °C. Permite que ambas cepas alcancen un OD₆₀₀ de 1.
2. Mezclar 100 μL de P. brasiliense ΔrecA con 100 μL de RHO3/pKV2-LLtnp, centrifugar la mezcla, descartar el sobrenadante y volver a suspender el pellet lavado en 10 μL de medio LB.
3. Coloca la mezcla resuspendida sobre una placa de agar LB suplementada con DAP e incuba a 28 °C durante 8 horas para permitir la conjugación.
4. Recuperar la mezcla de conjugación enjuagando la superficie de la placa con 1 mL de medio LB estéril. Centrifuga brevemente, descarta el sobrenadante y lava el pellet dos veces con LB medium para eliminar el DAP.
5. Resuspende el pellet lavado en medio de 300 μL LB y se hacen 10 diluciones en serie sobre agar LB suplementado con kanamicina y glucosa (LB + kan + glucosa; sin DAP) para seleccionar los transconjugantes.
6. Incuba las placas a 28 °C durante 48 horas. Elige cinco colonias y valida cada una mediante PCR de colonias usando pares de cebadores ori-F/ori-R y Tnp-F/Tnp-R para confirmar la introducción exitosa del transposón Tn5. Secuenciar las cinco colonias para verificar la inserción de Tn5 en el genoma.
   NOTA: Antes de la construcción formal de la biblioteca mutante, seis colonias individuales se seleccionaban aleatoriamente de la placa de conjugación. Se realizaron ensayos de rescate por plásmidos para determinar los sitios de inserción, utilizando dos enzimas de restricción diferentes por separado como dos grupos de control paralelos. Se obtuvieron un total de 36 lecturas de secuenciación. Un único evento de inserción de Tn5 solo se validaba cuando los seis sitios de inserción de cada colonia individual eran idénticos.
7. Estima la capacidad de la biblioteca mutante repitiendo el paso de conjugación y contando los números de colonias. Asegurarse de que el tamaño total de la biblioteca supere las 12.000 colonias para lograr una cobertura genómica suficiente para el cribado posterior.
   NOTA: Si se observa una baja frecuencia de mutagénesis, debe considerarse el uso de una variante hiperactiva de la transposasa Tn5, como el mutante E54K/M56A/L372P, para mejorar la eficiencia de la transposición.
8. Transfiere las colonias mutantes individuales obtenidas en el paso 6 a placas de 96 pozos que contienen 200 μL LB + kan por pozo. Incuba las placas durante la noche a 28 °C agitando a 200 rpm.
9. Añade 133 μL de glicerol estéril al 50% a cada pozo para lograr una concentración final de aproximadamente el 20%. Sellar y almacenar las placas de 96 pozos a −80 °C para su preservación a largo plazo.

4. Ensayos de patogenicidad de alto rendimiento mediante inoculación con tubérculos de patata y maceta

1. Prepara los tubérculos de patata (cv. Favorita) enjuagándolos con agua estéril, sumergiéndolos brevemente en etanol al 75% y secándolos al aire en un banco limpio. Corta los tubérculos en secciones de ~8 mm de grosor y coloca las rodajas en placas de Petri estériles de 90 mm. Prepara al menos tres cortes para réplicas biológicas.
2. Inocular 1 μL de cada cepa mutante sobre rodajas de patata usando una pipeta multicanal, siguiendo la disposición de placas de la biblioteca mutante de 96 pozos. Incluye P. brasiliense ΔrecA como control positivo y LB + kan como control negativo.
3. Incubar las rodajas de patata inoculadas a 28 °C durante 7–8 horas. Se registran mutantes que presentan una maceración visiblemente reducida o áreas de lesión más pequeñas en comparación con el control ΔrecA . Cuantifica el área de la lesión midiendo su longitud y ancho. Designa estos como candidatos principales de selección.
   NOTA: Asegúrese de que los valores de OD₆₀₀ de cultivos y controles mutantes estén normalizados a 0,8 antes de la inoculación.
4. Para el cribado secundario, inocular 5 μL de cada cepa candidata en rodajas de patata fresca (6 cepas por rodaja, espaciado igual). Prepara tres réplicas biológicas para cada cepa. Incubar a 28 °C durante 7–8 horas y registrar el tamaño de las lesiones para confirmar la atenuación.
5. Aislar cepas que muestren una reducción constante de virulencia al estirarlas sobre placas LB + kan. Incubar las placas a 28 °C durante la noche y almacenar mutantes validados de virulencia reducida a 4 °C para su análisis posterior.
6. Para la validación de plantas enteras, inocular los tallos de la patata con 150 μL de suspensiones bacterianas normalizadas a 1 x 10⁸ UFC/mL. Inyectar suspensiones en la región basal del tallo usando una jeringuilla estéril. Observa el desarrollo de la enfermedad después de 48 horas. Realiza réplicas biológicas en tres plantas individuales.
7. Puntua la gravedad de la enfermedad usando la escala de clasificación de la enfermedad de la pata negra ("una escala ordinal de 6 puntos: 0, 1, 3, 5, 7, 9") y calcula el Índice de Enfermedad como:
   1. Grado 0: No hay síntomas de enfermedad en toda la planta.
   2. Grado 1: Las lesiones del tallo cubren no más de un tercio de la circunferencia del tallo y/o las hojas individuales están marchitas.
   3. Grado 3: Las lesiones del tallo cubren no más de la mitad de la circunferencia del tallo, y/o menos de la mitad de las hojas presentan un leve marchitamiento y/o algunas hojas inferiores presentan lesiones.
   4. Grado 5: Las lesiones en el tallo cubren más de la mitad de la circunferencia y/o más de la mitad de las hojas muestran un leve marchitamiento.
   5. Grado 7: Las lesiones del tallo rodean toda la circunferencia y/o más de dos tercios de las hojas están marchitas.
   6. Grado 9: Todas las hojas de la planta están marchitas o muertas.
      
8. Preparar reservas de almacenamiento a largo plazo de mutantes atenuados confirmados mezclando cultivos con un volumen igual de glicerol estéril al 50% hasta una concentración final del 25%, y almacenarlo a -80 °C.

5. Identificación de sitios de inserción de Tn5 mediante rescate de plásmidos

1. Cultiva el mutante Tn5 de interés y extrae ADN genómico usando un kit de extracción de ADN genómico bacteriano. Cuantifique la concentración de ADN para asegurar suficiente entrada para la digestión aguas abajo.
2. Digiera entre 1 y 2 μg de ADN genómico con EcoRI en una reacción de 100 μL que contenga 10× tampón de reacción y 5 μL de enzima, e incubar la mezcla a 37 °C durante un mínimo de 3 horas. Verifica la finalización de la digestión usando un gel de agarosa.
3. Precipitar el ADN digerido añadiendo 1/10 de volumen de 3 M acetato de sodio y 3 volúmenes de etanol absoluto. Mezcla bien y incuba a -20 °C durante 1 hora.
4. Centrifuga a 13.500 x g durante 5 minutos y lava el pellet secuencialmente con etanol al 75% y etanol absoluto. Seque el pellet al aire y resuspende en 17 μL de agua estéril.
5. Autoliga los fragmentos de ADN digeridos añadiendo 2 μL de 10× tampón de ligasa de ADN T4 y 1 μL de ligasa de ADN T4. Incluye un control negativo (sin ligasa) para comprobar la transformación de fondo. Incubar la reacción de ligadura a 4 °C durante la noche para promover la circularización de los fragmentos de restricción.
6. Transformar 10 μL de la mezcla de ligadura en E. coli S17-1 λpir químicamente competente mediante transformación por choque térmico como se describió anteriormente. Recuperar células en LB durante 1 hora y placar sobre agar LB que contenga kanamicina (LB + kan) para seleccionar plásmidos que lleven el casete Tn5.
7. Elige cinco colonias resistentes a la kanamicina al azar y extrae ADN plasmídico usando un kit estándar de minipreparación para plásmidos. Validar la estructura del plásmido digiriendo 500 ng de cada plásmido con HindIII e incubando a 37 °C durante 5 horas. Analizar patrones digestivos mediante electroforesis en gel de agarosa.
8. Si los tamaños de las bandas de plásmidos coinciden con los patrones de fragmentos esperados, realiza la secuenciación Sanger usando el cebador ME de 5' situado en los extremos de Tn5.
9. Identificar el sitio de inserción preciso de Tn5 alineando la secuencia de flanqueo de 50-100 pb aguas abajo de la región 5'-ME de Tn5 contra el genoma SM de P. brasiliense utilizando software BLAST o de análisis genómico.
10. Confirmar que las cinco reacciones de secuenciación independientes de cada mutante corresponden a la misma coordenada genómica (> 98% de identidad de secuencia).
11. Si alguna de las cinco reacciones de secuenciación corresponde a una coordenada genómica diferente, esto indica la presencia de múltiples sitios de inserción de Tn5 en ese mutante. En tales casos, se analizan colonias adicionales para determinar todas las posiciones de inserción. Alternativamente, realiza la secenciación de Southern blot o el genoma completo para obtener un mapeo más definitivo del sitio de inserción.
12. Designa mutantes con un único sitio de inserción consistente en todas las reacciones de secuenciación como mutantes auténticos de inserción sencilla Tn5 adecuados para análisis fenotípicos o genéticos posteriores.

Resultados

Para superar la inestabilidad causada por la mutación sucB en P. brasiliense, se empleó la toxina vmi480 del plásmido pLP12 como marcador de contraselección, y el vector suicida modificado pKV2 (Figura 1A) se construyó reemplazando el casete de resistencia a antibióticos y ajustando la configuración del sitio de clonación. Para generar un mutante de deleción recA sin marcadores, se clonaron brazos homólogos izquierdo y derecho del gen recA con ~800 pb en p...

Discusión

La estrategia de manipulación genética desarrollada en este estudio ofrece una opción para la genómica funcional en P. brasiliense, un patógeno principal de la podredumbre blanda de la patata ^9,10. Al integrar un sistema de contraselección basado en toxinas en una columna vertebral de plásmidos suicidas, se generó un mutante ΔrecA sin marcadores. Este enfoque ofrece ventajas significativas respecto a los sistema...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de extracción de ADN genómico bacteriano	Extraiga el ADN genómico bacteriano	Tiangen	DP302-02
Ácido diaminopimelico	0.3 mM en 1 L medio	Macklin	D836611-5g
Kit de ensamblaje de ADN	Ensamblaje de ADN	Vazyme	C116-02
Kit de purificación de ADN	Purificación de ADN	Tiangen	DP214-02
Kanamicina	50 mg/mL	Aladdin	K103025-25g
Glucosa	0.2% (p/v)	Aladdin	G116305-250mg
Triptona	10% en 1 L medio	OXOID	LP0042B
Extracto de levadura	5% en 1 L medio	OXOID	LP0021B
NaCl	10% en 1 L medio	Biofroxx	1249KG001
Ágar	15% en 1 L medio	Biofroxx	8211GR500
L-arabinosa	0.3% (p/v)	Aladdin	A106196-25g
Kit Miniprep de plásmido	Extraiga el plásmido	Tiangen	DP103-02
EcoRI	Endonucleasa de restricción	Yugong Biotech	EG15536
NheI	Endonucleasa de restricción	Yugong Biotech	EG15552
HindIII	Endonucleasa de restricción	Yugong Biotech	EG15539
Ligasa de ADN T4	Autocircularización de ADN lineal	Yugong Biotech	EG15205
Centrífuga	RWD	M1324R
Ciclotermico de PCR	BIO-GENER	GET3XG
Cámara digital	SONY	ILCE-7M4
Sistema de electroforesis	LY	DYY-6C
Baño de agua	JOANLAB	WB100-1F
Sistema de documentación de gel	Thermo Fisher Scientific	iBright CL750
Autoclave	Yamato	SQ510C
Incubadora de agitación	ZHICHU	ZQZY-AR8
Incubadora de temperatura constante	ZQ	DHP-9272
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	Lite Plus
Espectrofotómetro UV-Vis	HITACHI	U-3900
Electroporador	BIO-RAD	MicroPulser
Cepas y plásmidos
P. brasiliense SM	Bacteria patógena de la patata	Colección de cepas de laboratorio
E. coli S17-1 λpir	Células competentes de E. coli	WEIDI	DL2010S
E. coli WM3064	Células competentes de E. coli	BIO SCI BIO	C1039
E. coli RHO3	Células competentes de E. coli	Colección de cepas de laboratorio
pKV2	El plásmido suicida modificado	Construido en este estudio
pLP12	plásmido suicida	Colección de cepas de laboratorio
pMCS2-LLtnp	Proporcione el fragmento que lleva Tn5	Colección de cepas de laboratorio
pKV2-LLtnp	El plásmido modificado que lleva el fragmento Tn5.	Construido en este estudio
Pimers
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)		Personalizado
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)		Personalizado
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)		Personalizado
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)		Personalizado
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)		Personalizado
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)		Personalizado
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)		Personalizado
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)		Personalizado
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)		Personalizado
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)		Personalizado
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)		Personalizado