Un sistema in vitro para aplicar fuerza de tracción a células madre esqueléticas utilizando un sistema de tensión y tensión celular cíclica

Resumen

Las células madre periostales esqueléticas (SSC) del ratón fueron aisladas por FACS y cultivadas in vitro. Se estableció un sistema experimental controlable para aplicar estimulación mecánica tensil cíclica a los SSC, lo que resultaba en una disminución de la expresión de los genes asociados a la senescencia celular, específicamente p16 y p21.

Resumen

El hueso es un órgano mecanosensible importante que responde continuamente a señales físicas en el cuerpo. Aunque la estimulación mecánica desempeña un papel importante en el desarrollo esquelético, la homeostasis y la reparación de lesiones, las respuestas específicas de las células madre esqueléticas (SSC) al estrés mecánico siguen siendo incompletamente comprendidas. Para abordar esta cuestión, establecimos un modelo in vitro para aislar los SSCs periostales del ratón y aplicar estimulación mecánica. Las células periostales del ratón se obtuvieron primero mediante digestión enzimática, y posteriormente los SSC se aislaron mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) basada en marcadores superficiales establecidos. Tras la unión al cultivo, los SSC fueron sometidos a estimulación mecánica a tracción mediante un sistema cíclico de tensión-tensión de células. Este sistema permite la aplicación reproducible de la fuerza de tracción a células cultivadas y proporciona una plataforma para analizar las respuestas de los SSC a la entrada mecánica. Con este enfoque, descubrimos que la expresión de los genes asociados a la senescencia celular p16 y p21 se redujo notablemente en los SSCs tras la estimulación mecánica. Estos hallazgos sugieren que la estimulación por tracción puede influir en los cambios relacionados con la senescencia en los SSCs bajo condiciones in vitro . En conjunto, este protocolo proporciona una plataforma útil y adecuada para estudiar el comportamiento de los SSC bajo estimulación mecánica y para investigar cómo las señales mecánicas afectan a la función de los SSC.

Introducción

Como el órgano de soporte más grande e importante del cuerpo humano, el sistema esquelético no solo proporciona sitios de unión y protección para otros órganos, sino que también sirve como base para la función motora. Por lo tanto, el sistema esquelético está constantemente expuesto a diversos estímulos mecánicos tanto de entornos internos como externos. Las señales de estimulación mecánica son igualmente cruciales para el desarrollo óseo y el mantenimiento funcional. Ya en 1893, se propuso que existe cierta correlación positiva entre la densidad ósea y la fuerza mecánica que soportan los huesos, que es la ley¹ de Wolff. En los últimos años, algunos estudios han demostrado la importancia de que el sistema esquelético soporte fuerzas mecánicas para el desarrollo normal de los huesos 2,3,4,5. La respuesta del sistema esquelético a la fuerza mecánica depende en parte de los componentes celulares del^{hueso 6}. Los osteocitos representan entre el 85% y el 90% de los componentes celulares del sistema esquelético. Debido a su amplia distribución y morfología celular dendrítica única, los osteocitos son actualmente el tipo de célula esquelética más estudiado en términos de respuesta mecánica ^7,8. Además de la capacidad ampliamente reconocida de los osteocitos para responder a la fuerza mecánica, las células precursoras esqueléticas también desempeñan un papel indispensable en ella. Se descubrió que la respuesta de las células precursoras periósteas a señales mecánicas regulaba su transformación del destino, influyendo así en la reparación de daños^tisulares.

Las células madre esqueléticas (SSC) son un tipo de células madre específicas de tejido con capacidad de autorrenovación, que pueden diferenciarse en tipos de células óseas maduras necesarias para el crecimiento, mantenimiento y reparación ósea. En 2015, se identificaron¹⁰ genes marcadores superficiales para SSCs de ratón. Posteriormente, múltiples estudios también han demostrado que los SSC desempeñan un papel muy importante en diversos aspectos como el desarrollo óseo, el mantenimiento de la homeostasis y la reparación de lesiones^{óseas 11,12}. Debido a la característica del sistema esquelético que responde a fuerzas mecánicas, podemos considerar las señales de fuerza mecánica como un factor indispensable para regular la función de las células madre esqueléticas. Para estudiar los cambios conductuales de los SSC bajo estimulación mecánica, necesitamos establecer un sistema experimental adecuado para aplicar la fuerza mecánica in vitro.

Los principales métodos de estimulación mecánica in vitro para células incluyen la tensión cortante de fluidos, la tensión de compresión, la fuerza de tracción, la presión hidrostática, la rigidez de la matriz y la topología de la matriz ^6,13. Basándonos en los genes marcadores superficiales de los SSC de ratón, obtuvimos los SSC periostales del ratón mediante clasificación por citometría de flujo, ya que los SSC implicados en la reparación de fracturas se originan principalmente en el^{periosteo 14}. Posteriormente, se aplicó una fuerza de tracción adecuada a los SSC periostales mediante un sistema de tensión de tensión de célula cíclica. Tras la estimulación por fuerza de tracción, se pueden obtener muestras celulares y realizar análisis multiómicos, incluyendo secuenciación de transcriptomas, secuenciación de proteomas y ATAC-seq. Por tanto, establecer este protocolo proporciona una base sólida para estudiar las respuestas de los SSC a la estimulación mecánica.

Protocolo

Todos los experimentos con ratones de este protocolo han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal del Instituto de Bioquímica y Biología Celular de Shanghái, Academia China de Ciencias (SIBCB-S350-2312-41).

1. Aislamiento de células periostales en ratones

1. Coloca ratones de 4 a 6 semanas en una caja de eutanasia con CO₂ y expónlos continuamente a CO₂ durante 3 minutos hasta que se detenga la respiración.
2. Desinfecta la superficie del cuerpo de los ratones con alcohol al 75%. Utiliza tijeras oftálmicas para separar las extremidades traseras. Luego se utilizan pinzas puntiagudas y tijeras oftálmicas para extraer los músculos esqueléticos de las extremidades posteriores, asegurando que las regiones articulares del fémur y la tibia permanezcan intactas.
3. Conserva los huesos aislados en PBS refrigerado y luego recubre ambos extremos con agarosa de baja fusión (5-10% en tampón TAE).
4. Digiera fémures y tibias en medio esencial mínimo alfa (α-MEM) que contenga 1 mg/mL de colagnasa, 2 mg/mL dispase II y 0,1 mg/mL de DNasa I a 37°C y 0,3 × g durante 30 minutos dos veces. Recoger las células digeridas en el medio de cultivo (α-MEM + 10% suero fetal bovino (FBS)).
5. Filtra la suspensión de la celda a través de un colador de celda de 40 μm y luego centrifuga a 500 × g durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante.
6. Resuspende el precipitado celular con buffer de lisis de glóbulos rojos durante 2 minutos y termina la reacción con buffer de citometría de flujo (PBS + FBS al 2%).
7. Centrifuga las pilas a 500 × g durante 5 minutos y descarta el sobrenadante. Resuspende las células con un buffer de citometría de flujo a 1 × 10⁷ células/mL para la clasificación celular.

2. Clasificación celular activada por fluorescencia

1. Teñir la suspensión celular con los siguientes anticuerpos de la siguiente manera: Anti-ratón conjugado con PerCP/Cy5.5 CD45, Anti-ratón conjugado con PerCP/Cy5.5 CD31, Anti-ratón conjugado con PerCP/Cy5.5 Ter119, Anti-ratón conjugado con FITC 6C3/Ly-51, Anti-ratón conjugado con Violeta Brillante CD90.2, Anti-ratón conjugado con PE/Cy7 CD105, Anti-ratón conjugado con APC CD200.
2. Diluye los anticuerpos anteriores en una proporción de 1:500 e incubalos sobre hielo durante 30 minutos, protegidos de la luz.
3. Lava las células con un tampón de citometría de flujo y realiza la clasificación celular con un clasificador activado por fluorescencia para obtener los SSCs CD45^- CD31^- Ter119^- CD90.2^- 6C3^- CD105^- CD200⁺ . Recoge los SSCs clasificados con el medio de cultivo. Analiza los datos adquiridos con el software FlowJo v10.8.1.
4. Amplía los SSC clasificados en platos de cultivo con medio de expansión en una incubadora de células₂ de CO al 5%. Se podía realizar un pasaje antes de la estimulación mecánica.
   NOTA: Se pueden obtener aproximadamente 1 ×^{10 5} SSCs periostales de cada par de ratones de 6 semanas.

3. Estimulación mecánica de los SSC

1. Diluye el colágeno tipo I de la cola de rata en ácido acético esterilizado 0,02 M hasta una concentración final de 0,15 mg/mL. Esta solución puede reutilizarse 3 veces y debe mantenerse a 4 °C.
2. Añade 1,5 mL de colágeno diluido tipo I de cola de rata a cada pozo de la placa de cultivo de 6 pocillos con fondo flexible. Después de recubrir las placas durante 1 hora a temperatura ambiente, aspira el exceso de colágeno y lava las placas una vez con PBS para usarlas después.
3. NOTA: Para un uso inmediato, la placa debe enjuagarse con PBS para eliminar cualquier ácido residual. Antes de almacenarlo a 4 °C, la placa debe secarse completamente sin tapa.
4. Digiera los SSCs periostales de ratón cultivados, centrifuga a 500 × g durante 5 minutos, resuspende el precipitado celular en el medio de cultivo para lograr una densidad celular de 1 × 10⁵ células/mL, añade 2 mL de suspensión celular a cada pozo de la placa de cultivo de fondo flexible de 6 pozos y colócala en la incubadora celular.
5. 24 horas después de sembrar las células, colocar la placa de cultivo con fondo flexible en la placa base estirada y conservar otra placa de cultivo con fondo flexible como grupo control sin estimulación por fuerza mecánica.
6. Establece los parámetros en el software FX-6000 Versión 1.0 de la siguiente manera: resistencia de estiramiento 8%, frecuencia 0,1 Hz, forma de onda como onda cuadrada, ciclo de trabajo de la forma de onda 80% y duración de estiramiento durante 12 horas.
   NOTA: Hay cuatro posiciones en la placa base estirada para colocar una placa de cultivo con fondo flexible de 6 pozos. Si las células necesarias para el experimento son menos de 4, las posiciones vacías deben llenarse con nuevas placas de cultivo de 6 pozos con fondo flexible. Tras aplicar la estimulación mecánica adecuada, los SSC pueden someterse a pruebas funcionales, como diferenciación o proliferación celular, o extraer muestras para secuenciación multi-ómica.

4. PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)

1. Una vez completada la estimulación mecánica de las células, se descarta el medio de cultivo, se lavan las células una vez con PBS, se extrae ARN total con el reactivo TRIzol y se realiza la transcripción inversa del ARN.
   NOTA: Tras completar la extracción de ARN, puede almacenarse a -80 °C. El ADNc obtenido por transcripción inversa también puede almacenarse a -20 °C para pruebas posteriores.
2. Realiza la RT-qPCR con un sistema de PCR en tiempo real. Los conjuntos de cebadores utilizados fueron los siguientes:
   Hprt: delantero 5'-GTTAAGCAGTACAGCCCCAAA-3',
   Hprt: reverso 5'-AGGGCATATCCAACAAACTT-3',
   p16: delantera 5'-GGTCACACGACTGGGCGATT-3',
   p16: reverso 5'-GCACCGTTAGTAGTAGGAGAAGAG-3',
   p21: adelante 5'-GCCTGGTTCCTTCCCCACTTCTT-3',
   p21: reverso 5'-ATTACGGTTGAGTCCTAACTGCCATC-3'.

5. Efectos del tratamiento a corto plazo del esfuerzo mecánico

1. Establece los parámetros en el software FX-6000 Versión 1.0 de la siguiente manera: resistencia de estiramiento 8%, frecuencia 0,1 Hz, forma de onda como onda cuadrada, ciclo de trabajo de la forma de onda 80%. Las células se lisan con el buffer de lisis RIPA I (con cóctel inhibidor de fosfatasas y cóctel inhibidor de proteasas) a los 10 minutos y 60 minutos después de la estimulación mecánica por tensión.
2. Realiza el Western blot con Erk y anticuerpos p-Erk.

Resultados

Tras la implementación de este protocolo, se aplicó con éxito la fuerza de tracción a las SSC periostales de ratones. En primer lugar, las SSC se obtuvieron del periosteo de ratones mediante citometría de flujo. Los resultados de la citometría de flujo mostraron que la proporción de CSE en el periosteo representaba casi el 30% de Lin^- (CD45^-, CD31^-, Ter119^-) CD90,2-6C3^- (Figura 1), que era mucho mayor que la de la médula ósea....

Discusión

En los últimos años, se han descubierto continuamente genes marcadores de células madre esqueléticas de diferentes partes de los^huesos 11,12,17. Sin embargo, aún se necesita profundizar la investigación sobre la regulación directa de la función de los SSC, especialmente en el aspecto de la regulación de la estimulación de la fuerza mecánica. Hasta ahora, la investigación sobre los efectos regula...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
α-MEM	Corning	10-022-CV	Aislamiento de células periosteales
APC anti-mouse CD200	BioLegend	123809	Ordenación SSCs
BioFlex 6-Well Culture Plate	Flexcell	BF-3001A	Cultivo celular
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD90.2	BioLegend	140317	Ordenación SSCs
Collagenase	Sigma	C0130	Aislamiento de células periosteales
Dispase II	Sigma	D4693	Aislamiento de células periosteales
DNase I	Sigma	DN25	Aislamiento de células periosteales
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5356701	Ordenación SSCs
FITC anti-mouse 6C3/Ly-51	BioLegend	108305	Ordenación SSCs
Flexcell Tension System	Flexcell	Flexercell FX-6000	Tensión celular
Flow Cytometry Sorter	BD	BD FACSAria Fusion	Ordenación SSCs
MesenCult Expansion Kit (Mouse)	Stem cell	05513	Cultivo celular
PE/Cy7 anti-mouse CD105	BioLegend	120409	Ordenación SSCs
PerCP/Cy5.5 anti-CD31	BioLegend	102522	Ordenación SSCs
PerCP/Cy5.5 anti-CD45	BioLegend	103132	Ordenación SSCs
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TER-119	BioLegend	116228	Ordenación SSCs
PrimeScript RT Reagent Kit	TaKaRa	RR037A	RT-qPCR
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Cultivo celular
real-time PCR system	Thermo Fisher Scientific	QuantStudio 1 Plus	RT-qPCR
red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702	Aislamiento de células periosteales
TRIzol	Sigma	T9424	RT-qPCR
Phosphatase Inhibitor Cocktail II	MCE	HY-K0022	WesternBlot
RIPA Lysis Buffer I	Sangon Biotech	NO. C500005	WesternBlot
Protease Inhibitor Cocktail	MCE	HY-K0010	WesternBlot
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody	Cell Signaling Technology	9102	WesternBlot
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Rabbit Monoclonal Antibody	Cell Signaling Technology	4370	WesternBlot