Artículo de método

Fabricación y aplicación quirúrgica de hidrogeles enriquecidos foto-reticulados gelatina–riboflavina para la reparación de heridas corneales en conejos

DOI:

10.3791/70579

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24 de abril de 2026

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1Department of Cell Biology and Histology, School of Medicine and Nursing, University of the Basque Country UPV/EHU, 2BEGIKER Ophthalmology Research Group, IIS Biobizkaia, 3Department of Ophthalmology, University Hospital of Cruces

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se presenta un protocolo reproducible para la preparación, enriquecimiento y aplicación de un hidrogel in situ de luz azul cruzada–gelatina–riboflavina reticular para la reparación de heridas estromales corneales en conejos, incluyendo pasos procedimentales para el manejo quirúrgico, tarsorrafia parcial y cuidados postoperatorios.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo presenta un protocolo paso a paso para fabricar, suplementar y aplicar quirúrgicamente un hidrogel de gelatina entrecruzable con luz azul y reticulable in situ para la reparación de heridas estromales corneales en conejos. El precursor hidrogel comprende gelatina al 5% (p/v) y fosfato de riboflavina al 0,01% (p/v), preparado bajo condiciones estériles y protegidos de luz, filtrados estérils y calentados antes de su uso para lograr la viscosidad inyectable. Se detalla la incorporación opcional de extracto de membrana amniótica humana o suero autólogo de conejo. La gelificación bajo demanda se activa en la superficie ocular mediante luz azul a λ = 420–480 nm durante un total de 2 minutos. El método in vivo incluye una queratectomía estromal anterior reproducible (diámetro de trefina 6,5 mm; profundidad aproximadamente 187 μm), seguida de un empaste con hidrogel, activación ligera y una tarsorrafía lateral parcial para estabilizar el tratamiento, favorecer la cicatrización de la herida y estandarizar el cuidado postoperatorio. Los resultados representativos in vitro evidencian comportamiento viscoelástico similar al gel con adelgazamiento por cizallamiento y recuperación rápida, y alta transmitancia óptica (> 90%) por encima de 500 nm, indicando idoneidad para uso corneal. In vivo, los tratamientos basados en hidrogel apoyan el cierre progresivo del epitelio, buena tolerancia ocular (bajas puntuaciones de Draize a los 3 y 7 días) y la pérdida dependiente del tiempo del hidrogel visible compatible con biodegradación y reemplazo tisular. Se destacan pasos críticos y puntos de pausa para garantizar la reproducibilidad, incluyendo el control de temperatura durante la disolución y filtración, la protección contra la luz y la colocación de la lámpara durante la reticulación. El protocolo permite estabilización con hidrogel activada por luz y sin suturas, colocada con precisión, compatible con la adición de múltiples suplementos bioactivos. Proporciona una plataforma práctica para la evaluación preclínica de biomateriales oftálmicos de nueva generación y facilita la traducción de terapias con hidrogel fotocruzable para la reparación de heridas corneales.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La córnea es una estructura transparente y avascular que representa aproximadamente dos tercios del poder refractivo del ojo, lo que hace que su integridad estructural y funcional sea esencial para la visión1. Debido a su exposición directa al entorno externo, la córnea es altamente susceptible a traumatismos, infecciones, lesiones químicas y complicaciones postquirúrgicas 2,3. No restaurar rápida y eficazmente la integridad epitelial puede provocar defectos epiteliales persistentes (PEDs) y úlceras corneales crónicas, resultando finalmente en derretimiento estromal, perforación, cicatrices y pérdida visualirreversible 4,5. Las terapias convencionales —incluyendo lubricantes, profilaxis antibiótica y gotas oculares séricas autólogas— a menudo ofrecen solo un beneficio parcial y no promueven adecuadamente la reparación estromalística en defectos moderados agraves 6,7,8.

Para abordar estas limitaciones, las terapias basadas en biomateriales han surgido como alternativas prometedoras debido a su capacidad para proteger la herida, apoyar la reparación epitelial y restaurar tejido estromal 9,10,11,12,13,14. Los hidrogeles son especialmente atractivos por su biocompatibilidad, transparencia óptica, comportamiento mecánico ajustable y capacidad para incorporar agentes terapéuticos. Tanto hidrogeles naturales como sintéticos, incluyendogelatina 15,16,17, colágeno 18,19,quitosano 20,21, polietilenglicol (PEG)22,23 y ácido hialurónico18,24, han demostrado potencial para promover la cicatrización de heridas corneales. Entre estos, los hidrogeles a base de gelatina son especialmente valiosos debido a su composición derivada del colágeno y a los motivos intrínsecos de adhesión celular.

Los hidrogeles foto-entrecruzables ofrecen una ventaja adicional al permitir la solidificación a demanda directamente sobre la superficie ocular, facilitando una colocación precisa y una mayor estabilidad mecánica sin suturas. El reticulado mediado por riboflavina, desarrollado originalmente para el tratamiento con queratocono, ha sido adaptado recientemente para la fotopolimerización de hidrogel debido a su excelente biocompatibilidad, seguridad oftálmica y capacidad para generar especies reactivas de oxígeno que inducen reticulación bajo luz visible o UV25,26. La luz azul (≈445 nm) es especialmente ventajosa para aplicaciones corneales, permitiendo un entrecruzamiento eficiente mientras evita riesgos asociados a los UV 27,28,29.

Este artículo presenta la fabricación, enriquecimiento y aplicación quirúrgica de un hidrogel fotocruzable compuesto por 5% (p/v) de gelatina y 0,01% (p/v) fosfato de riboflavina (RFP). Se proporciona un protocolo detallado para la preparación in vitro de hidrogel, incluyendo la incorporación opcional de extracto de membrana amniótica humana (HAMe) o suero autólogo (AS), así como la aplicación in vivo en un modelo de queratectomía estromalical de conejo. Se sabe que el HAMe ejerce efectos antiinflamatorios, antifibróticos y pro-regenerativos sobre la superficie ocular 30,31,32,33,34,35, mientras que el suero autólogo proporciona concentraciones lagrimeles de vitamina A, EGF, fibronectina y otros factores de crecimiento esenciales para la regeneración epitelial 36,37,38. En conjunto, estos elementos favorecen la re-epitelialización, reducen la inflamación y potencialmente previenen la degradación estromal.

Aunque el enfoque descrito proporciona fotopolimerización controlada y bioactividad personalizable, su aplicabilidad actualmente se limita a defectos superficiales y de estromes medios y requiere exposición en línea de visión a luz azul, lo que puede restringir el uso en tejidos opacos o profundamente infiltrados. Al integrar la preparación y enriquecimiento de hidrogel, el manejo oftálmico y el cuidado postoperatorio, incluyendo tarsorrafía lateral parcial, este artículo ofrece un enfoque reproducible que apoya la reparación córnea, facilita la traducción de tecnologías de hidrogel activadas por luz a la práctica clínica y contribuye al desarrollo de plataformas estandarizadas para la investigación regenerativa corneal.

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Protocolo

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Las placentas humanas se obtuvieron de donantes con consentimiento informado, de acuerdo con la Declaración de Helsinki y con la aprobación del Comité de Ética del Hospital Universitario de Cruces (número de aprobación CEIC E15/03). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación Animal de la Universidad del País Vasco (UPV/EHU) (número de aprobación CEEA M20/2023/038) y cumplieron con la Declaración ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftalmológica y Visual. Todos los procedimientos se realizaron en la instalación de animales UPV/EHU (SGIker), manteniendo la técnica estéril durante todo el proceso (gabinete de bioseguridad Clase II al manipular biológicos).

1. Síntesis de hidrogel

  1. Soluciones precursoras de gelatina-riboflavina (5% y 10% p/v)
    NOTA: Trabajar bajo luz tenue o utilizar botellas ámbar o botellas envueltas en papel de aluminio para proteger la solución de la exposición a la luz. Realizar todos los pasos en condiciones estériles en una campana de flujo laminar cuando el hidrogel esté destinado a uso biológico.
    1. Pesa las cantidades requeridas de gelatina y fosfato de riboflavina (RFP): para 10 mL de precursor RFP al 5% (p/v) + 0,01% (p/v) de RFP, pesa 500 mg de gelatina y 1 mg de RFP. Para 30 mL de stock RFP al 10% (p/v) + 0,02% (p/v) de RFP, pesa 3 g de gelatina y 6 mg de RFP.
    2. Añade la gelatina y la RFP al volumen correspondiente de agua desionizada (≈90% del volumen final). Remueve suavemente hasta que el polvo esté completamente disperso.
    3. Ajusta el pH a 7,0 usando 1 M de NaOH, añadiendo la base gota a gota mientras monitorizas el pH. Registra el volumen de NaOH utilizado y el volumen final ajustado. Tras ajustar el pH, lleva las soluciones a su volumen final con agua desionizada.
    4. Disolver y homogeneizar la solución a 80 °C bajo agitación magnética a 200 rpm durante 30 minutos.
      NOTA: Manipular las soluciones calientes (>70–80 °C) usando guantes resistentes al calor.
    5. Deja que las soluciones se enfríen a 30–40 °C y filtras a través de filtros de membrana hidrofílica de poliétersulfona (PES) de 0,22 μm en botellas ámbar estériles.
      NOTA: Calientar suavemente las soluciones viscosas (≈ 40–50 °C) antes de la filtración si es necesario; evitar el sobrecalentamiento.
    6. Etiqueta las botellas con la composición, fecha e iniciales del operador. Almacena las soluciones de hidrogel filtradas a 4 °C hasta su uso, asegurando que el periodo de almacenamiento no supere las 2 semanas desde la preparación.
  2. Hidrogelatina suplementada (volumen final: 10 mL)
    1. Prepare suero autólogo (EA) o extracto de membrana amniótica humana (HAMe) siguiendo los procedimientos descritos en las secciones 4 y 5. Mantenga los extractos estériles y refrigerados hasta su uso.
    2. Por cada 10 mL de hidrogel enriquecido, mezcla 5 mL del stock RFP al 10% (p/v) + 0,02% (p/v) y 5 mL del extracto biológico correspondiente (AS o HAMe).
      NOTA: Calientar suavemente las soluciones viscosas (≈ 40–50 °C) antes de la filtración si es necesario; evitar el sobrecalentamiento.
    3. Filtra la solución tibia a través de un filtro de membrana hidrofílica PES de 0,22 μm en botellas ámbar estériles.
    4. Etiqueta y almacena los hidrogeles a 4 °C hasta su uso. Asegúrate de que el periodo de almacenamiento no supere las 2 semanas desde el momento de la preparación.
      NOTA: Eliminar todos los residuos conforme a las normativas institucionales de bioseguridad.

2. Aplicación in vitro de hidrogel

  1. Prepare las formulaciones de hidrogel según lo descrito en la Sección 1 y mantenlas a 32 °C antes de aplicarlas para mantener una viscosidad adecuada.
  2. Utilizando técnica estéril, se puede hacer una pipete el volumen requerido de hidrogel en el pozo objetivo, moho, plato o sustrato (Figura 1A).
  3. Colocar la lámpara de curado Led-C 2 cm sobre la superficie del hidrogel. Iniciar la reticulación in situ exponiendo el hidrogel a luz azul (λ = 420–480 nm) y una salida de luz de 850-1000 mW/cm2 durante una duración total de 2 minutos. Proporcionar la iluminación en seis pulsos de 20 s, insertando pausas de 5 a 10 s entre pulsos y evitar el calentamiento local (Figura 1B).
  4. Confirmar la gelificación completa visualmente y tocando suavemente la superficie con un instrumento estéril para asegurar la formación de un hidrogel sólido y manipulable (Figura 1C,D).
  5. Utilice el hidrogel reticulado inmediatamente o almacene a 4 °C en condiciones estériles adecuadas para la aplicación aguas abajo.
    NOTA: Mantenga la técnica aséptica durante todo el procedimiento. Evite la exposición directa de la piel o los ojos a la irradiación con luz azul.

3. Obtención de la membrana amniótica humana (HAM)

NOTA: Utilizar solo placentas de donantes seronegativos que hayan proporcionado su consentimiento informado y cumplan con los requisitos institucionales y éticos.

  1. Elegibilidad y consentimiento del donante
    1. Confirma que cada donante ha sido examinado y ha dado negativo en VIH tipos 1 y 2, hepatitis B y C, y sífilis.
    2. Obtén el consentimiento informado por escrito de cada donante antes de la cirugía.
    3. Obtener placentas humanas inmediatamente después de cesáreas electivas de donantes sanos.
  2. Recogida y procesamiento inicial
    1. Recoge cada placenta en un recipiente estéril de acero inoxidable inmediatamente después del parto.
    2. En el quirófano, enjuaga la placenta extensamente con solución salina estéril para eliminar coágulos sanguíneos. Identifica el amnión—la membrana transparente más interna que recubre la cavidad amniótica—y sepárala cuidadosamente del corión pelándola suavemente hacia el borde placentario usando pinzas estériles.
      NOTA: Manipula las membranas con cuidado para evitar que se desgarren.
    3. Tras la separación completa, fije piezas estériles del filtro de nitrocelulosa a la superficie estromalizada del HAM para facilitar la manipulación y estandarizar su división. Dividir el HAM en tres regiones definidas (Figuras 2A,B): amnión distal: sección de 10 cm de ancho, amnión medial: sección de 10 cm de ancho, amnión proximal: sección que se extiende hasta el borde placentario.
  3. Transporte
    1. Coloque cada fragmento de HAM en una botella estéril, sumergiéndolo en el Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con 1,25 μg/mL de anfotericina B, 50 μg/mL de penicilina-estreptomicina y 50 μg/mL de neomicina.
    2. Etiqueta claramente cada frasco con el código del donante, la fecha y la región de origen (distal, medial o proximal).
    3. Transportar las muestras inmediatamente al laboratorio en condiciones limpias y asépticas refrigeradas (4 °C).
      NOTA: Transportar las membranas en un embalaje triple sellado conforme a la ONU 3373 (Sustancia Biológica, Categoría B), conforme a las normativas institucionales de bioseguridad que rigen el tejido humano.
  4. Procesamiento en laboratorio
    NOTA: Realizar todos los pasos posteriores en un gabinete de seguridad biológica de Clase II en condiciones estériles.
    1. Corta cada fragmento distal, medial y proximal de HAM en cuadrados de 4,0–4,5 × 4,0–4,5 cm usando tijeras estériles.
    2. Sumerge los fragmentos en DMEM ya suplementado con antibióticos y cepillo suavemente con pinzas estériles para eliminar los residuos sanguíneos. Lava en DMEM que contenga 50 μg/mL penicilina-estreptomicina durante 2 x 5 minutos.
    3. Lava en DMEM sin antibióticos durante 2 x 5 minutos.
    4. Lava estos fragmentos seleccionados en solución fisiológica estéril tamponada con fosfato (PBS).
    5. Transfiere cada fragmento a un tubo estéril de 5 mL sin ningún medio de cultivo. Congela las muestras directamente a –80 °C hasta su uso adicional.

4. Preparación del extracto de membrana amniótica humana (HAMe)

NOTA: Realizar todos los pasos en condiciones asépticas y frías para minimizar la degradación y contaminación de proteínas.

  1. Recuperar los tubos que contienen fragmentos de membrana amniótica humana (HAM) almacenados a −80 °C. Sumergir los tubos en nitrógeno líquido durante 5 minutos para endurecer el tejido.
  2. Transfiere cada fragmento congelado a un mortero preenfriado (−80 °C) y triturarlo bien con un manodillo hasta obtener un polvo blando y homogéneo.
  3. Pesa la muestra en polvo inmediatamente sobre una balza para minimizar el descongelamiento. Transfiere el polvo pesado a un tubo de 5 mL y resuéltalo en 3 mL de PBS suplementado con cóctel inhibidor de proteasas de 5 μL/mg.
    NOTA: Mantenga todos los tubos sobre hielo durante el procesamiento para preservar la integridad de las proteínas.
  4. Sonica cada muestra durante 20 minutos a un 90% de amplitud usando el sonicador y la sonda de 1,5 mm de diámetro, aplicando ciclos de 15 s encendidos / 15 s apagados para evitar el sobrecalentamiento.
  5. Centrifugar los lisados a 3.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. Recoger cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet.
  6. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de membrana hidrofílica PES de 0,22 μm usando condiciones estériles. Alicuota el HAMe filtrado en microtubos de 0,2 mL. Almacenar las alicuotas a −80 °C hasta su uso adicional.
    NOTA: Asegúrese de que el periodo de almacenamiento no supere los 6 meses desde el momento de la preparación.

5. Extracción de suero autólogo de sangre de conejos

NOTA: Realizar todos los procedimientos para ensayos in vivo en conejos blancos de Nueva Zelanda (≈2 kg) bajo la aprobación del Comité de Ética en Investigación Animal de la institución correspondiente y en cumplimiento de las directrices institucionales.

  1. Anestesiar localmente al conejo con lidocaína (tópica o subcutánea) en el lugar de la venopunción.
  2. Recoger sangre de la arteria central del oído en tubos de extracción de sangre de 4,5 mL que contienen un separador de gel polimérico (Figuras 3A,B). Permitir que la sangre coagule durante 2 horas en la RT sin agitación (Figura 3C).
  3. Centrifugar las muestras a 1.000 × g durante 15 minutos en RT. Recoger el sobrenadante (suero), que constituye el suero autólogo (AS) del conejo (Figura 3D).
  4. Filtra el suero a través de un filtro de membrana hidrofílica PES de 0,22 μm. Alújalo en tubos estériles de 0,2 mL y guárdalo a −80 °C hasta su uso.
    NOTA: Asegúrese de que el periodo de almacenamiento no supere los 6 meses desde el momento de la preparación.

6. Procedimiento quirúrgico in vivo

NOTA: Realizar todos los procedimientos experimentales de acuerdo con el Comité de Ética en Investigación Animal de la institución correspondiente y cumplir con los Principios de la Declaración de Helsinki y la Declaración ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftalmológica y de la Visión.

  1. Preparación preoperatoria
    NOTA: Utiliza conejos blancos de Nueva Zelanda (≈2 kg) como modelo animal.
    1. Antes de la cirugía, administrar anestesia general mediante inyección intramuscular en el muslo de los animales utilizando: ketamina a 1 mL/kg (50 mg/mL) y xilazina a 0,3 mL/kg (20 mg/mL). Confirmar la ausencia del reflejo corneal y del pie antes de continuar.
    2. Colocar al animal en una posición de decúbito lateral sobre una plataforma quirúrgica estéril y desinfectar la región periocular con solución de povidona-yodo. Colocar un espéculo de párpado sobre el ojo operador para mantener una exposición continua de la superficie ocular durante el procedimiento.
  2. Queratectomía estromal anterior
    1. Centra una trefina de vacío de 6,5 mm de diámetro en la córnea del conejo (Figura 4A). Aplica succión para estabilizar el dispositivo y gira la trefina tres cuartos de vuelta, logrando una profundidad estromalada aproximada de 187 μm.
    2. Realizar una queratectomía estromal anterior en la zona trephina utilizando una hoja en forma de media luna, retirando las capas epitelial y estromala anterior hasta obtener un lecho liso de la herida (Figura 4B).
  3. Aplicación in vivo de hidrogel
    1. Rellenar el defecto corneal con 50 μL de la formulación correspondiente de hidrogel, precalentada a 32 °C para asegurar una viscosidad óptima (Figura 4C).
    2. Inicia el entrecruzamiento in situ iluminando la superficie corneal con luz azul (λ= 420–480 nm) durante 2 minutos. Administra seis pulsos de 20 s con pausas de 5–10 s entre pulsos y limitar el calentamiento local (Figura 4D).
  4. Tarsorrafía parcial lateral
    1. Identificar el tercio nasal de los márgenes superior e inferior del párpado para permitir la exposición medial para observación y tratamiento.
    2. Coloca la primera sutura (utiliza 1–2 suturas dependiendo de la longitud y estabilidad del párpado necesaria) (Figura 4E).
      1. Sujeta el borde lateral superior del párpado con la pinza. Pasa la aguja por la línea gris / margen del párpado desde el lado de la piel hasta el lado conjuntival, dando una mordida de grosor completo pero evitando una penetración profunda en la placa tarsal si es posible.
      2. Pasa la aguja por el punto correspondiente del margen inferior del párpado, desde el lado conjuntival hasta el lado de la piel, para crear la aposición de los márgenes del párpado.
      3. Ata la sutura con un nudo de cirujano seguro y dos nudos cuadrados, dejando el nudo en la superficie de la piel ligeramente posicionado hacia el lado exterior del borde del párpado en lugar de directamente sobre él.
      4. Coloque una segunda sutura aproximadamente 3–4 mm medial a la primera si se requiere estabilidad adicional, utilizando la misma sutura en forma de U de grosor completo o una simple puntada interrumpida.
      5. Recorta las colas de sutura a 3–4 mm para reducir la irritación, dejando suficiente longitud para su posterior retirada.
      6. Confirme que la aposición del párpado proteja la córnea tratada permitiendo el acceso a la conjuntiva/córnea medial y temporal para su inspección y tratamiento con colirio. Asegúrese de que la tarsorrafía no esté demasiado tensa y que los párpados del animal no sean isquémicos (Figura 4F).
  5. Seguimiento y atención postoperatoria
    1. Administrar buprenorfina a 0,05 mg/kg mediante inyección subcutánea antes de la queratectomía y cada 12 horas durante 72 horas para administrar analgesia.
    2. Inyecta gotas oculares de Tobramicina de 3 mg/mL dos veces al día hasta que la herida se cierre completamente para prevenir infecciones.
    3. Aplica una gota de lágrimas artificiales de ácido hialurónico (HA) al 0,2% en todos los ojos, incluidos los controles, cuatro veces al día para mantener la hidratación corneal.
    4. Inspecciona la tarsorrafia al menos dos veces al día para detectar signos de aflojamiento de suturas, infección, necrosis local de tejido o tensión excesiva. Mantén al animal bajo observación para detectar comportamiento normal, alimentación y signos de molestias oculares.
    5. A las 72 horas posteriores al procedimiento, corta el nudo de sutura y retira suavemente cada sutura con pinzas, cuidando de no arrastrar contaminantes por la superficie conjuntival.
    6. Inspeccionar los márgenes del párpado para una correcta cicatrización y la superficie corneal para comprobar la integridad epitelial. Continuar el tratamiento ocular según sea necesario hasta que se observe un cierre epitelial completo.
    7. Monitorizar y registrar la cicatrización ocular y los signos clínicos desde el día 3 hasta el día 7, evaluando el cierre epitelial, la opacidad y la neovascularización mediante microscopía con lámpara de rendija y tinción con fluoresceína.
      NOTA: Si aparece algún signo de isquemia, dehiscencia de la herida o irritación severa, retira la(s) sutura(s) inmediatamente y maneja en consecuencia.
  6. Evaluación de la irritación ocular aguda de draize
    1. Sujeta al conejo suavemente con una toalla o manta envolvida. Examina primero el iris y la conjuntiva bajo luz blanca.
    2. Puntuar enrojecimiento conjuntival, quimiosis (edema) y secreción según la escala de Draize (véase Tabla 1 y Tabla 2).
    3. Anota los seis parámetros de Draize en la hoja de datos. Calcula el índice de irritación ocular (OII) como la suma de las puntuaciones de los componentes; OII oscila entre 0 y 110, donde valores más altos indican una irritación más fuerte.
    4. Clasificar cada ojo según las categorías de Kay–Calandra basadas en la OII; registrar la categoría en el conjunto de datos.
  7. Documentación fotográfica de la cicatrización de heridas
    1. Inyectar solución de fluoresceína (5 μL) en el saco conjuntival inferior.
    2. Ilumina el ojo con luz azul y evalúa la opacidad corneal (densidad y área) y el grado de tinción con fluoresceína.
    3. Configurar la cámara con balance de blancos ajustado manualmente, desactivar el zoom óptico y colocar aproximadamente 3 cm del ojo para capturar todas las imágenes usando parámetros idénticos en todas las sesiones. Capturar imágenes tras la instalación de fluoresceína con y sin iluminación de luz azul para delimitar defectos epiteliales. Capturar imágenes en el día 0 (antes de la tarsorrafia) y diariamente desde el día 3 (tras la extracción de la tarsorrafia) hasta el cierre epitelial completo.
    4. Analiza las imágenes con el software ImageJ y cuantifica el área de las regiones teñidas con fluoresceína.
      NOTA: La documentación fotográfica de los días 1 y 2 normalmente no es factible debido a la tarsorrafia parcial. Indicar que las imágenes de los días 1 y 2 faltan en el conjunto de datos e informar de cualquier evento adverso (por ejemplo, abrasión corneal incidental).
  8. Eutanasia y recogida de tejidos
    1. Al día 21 (tras el periodo de evaluación de ambos ojos), se anestesian profundamente a los animales utilizando ketamina (2 mL/kg) y xilazina (0,6 mL/kg) administradas intramuscularmente.
    2. Eutanasiar mediante inyección intravenosa de 10 mL de cloruro de potasio saturado (KCl) en la vena marginal del oído.
    3. Confirmar la muerte por inicio de rigor mortis y ausencia de reflejos vitales antes de proceder a la extracción de tejido.

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Resultados

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Síntesis y caracterización de hidrogel
El hidrogel fue sintetizado y evaluado in vitro para determinar sus propiedades reológicas y ópticas antes y después del fotocruzamiento. Se utilizó la reología de corte para caracterizar la viscoelasticidad, el cesión y el comportamiento del flujo. Los barridos de frecuencia mostraron que G′ permanecía por encima de G" en todas las frecuencias probadas, indicando un comportamiento similar a sólidos (

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo actual proporciona un flujo de trabajo reproducible para la preparación, carga y aplicación de un hidrogel de gelatina-riboflavina fotocruzable para la cicatrización de heridas corneales. Varios pasos in vitro son críticos para lograr una calidad consistente del gel y merecen énfasis porque son las fuentes de variabilidad más frecuentes. En primer lugar, mantener la solución precursora a 80 °C durante la agitación garantiza la disolución completa de la gelatina y el...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio de investigación fue financiado por subvenciones del Departamento de Salud del Gobierno Vasco (2023111027 e IT524-22). C.R.-V. contó con el apoyo de una beca de la Universidad del País Vasco UPV/EHU. Se agradece el apoyo técnico en el cuidado animal y el Servicio de Microscopía Analítica y de Alta Resolución proporcionado por SGIker (UPV/EHU).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Amphotericin BGibco (Thermo Fisher Scientific)15290018Concentración final: 1.25 μg/mL
Suero autólogo, conejo (AS)Preparado en el laboratorio-Preparado a partir de sangre completa; filtrado a través de 0.22 μm PES
Lámpara de curado LED azulWoodpecker Medical Instrument CoModelo LED.CLongitud de onda: λ=420–480 nm; Distancia: 1–2 cm; Salida de luz: 850-1000 mW/cm2
Buprenorfina (Buprecare)Ecuphar578950Dosis: 0.05 mg/kg, inyección subcutánea cada 12 h durante 72 h
CámaraPanasonicLUMIX TZ35Cámara equipada con óptica Leica
Placa calefactora con agitación digital CimarecThermo Fisher ScientificSP131320-33220-240 V, Temperatura máxima: 540 °C
Hojas microquirúrgicas crescentBVI Medical373807-
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)Gibco (Thermo Fisher Scientific)11966025-
Tubos Eppendorf (0.2 mL)Merck KGaA30124707Se mantienen en frío para la preparación HAMe; alícuotas
Tubos Eppendorf (5 mL)Merck KGaA30119606Se mantienen en frío para la preparación HAMe; alícuotas
Solución de fluoresceína NovartisColorcusi FluotestSolución de Fluorescein al 2%, gotas para ojos de 5 µl
Gibco NeomicinaMerck KGaAN1142Concentración final: 50 μg/mL
Polvo de gelatinaSigma AldrichG1890Diluido a 80 °C; pH ajustado a 7.0
Lágrimas artificiales de ácido hialurónico (0.2%)Chem.-pharm. Fabrik GmbHHylo-Tear-
Software de procesamiento de imágenes ImageJNational Institute of Mental Health-Desarrollado por Wayne Rasband en la Branch de Servicios de Investigación
Ketamina (Ketolar)Pfizer631028.1
LidocaínaVet OneNDC 13985-222-04Inyección tópica o subcutánea
Penicilina-EstreptomicinaGibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Concentración final: 50 μg/mL
Filtros de jeringuilla PES, 0.22 μm0.22μm (Millex)Merck KGaASLGP033RS-
Solución tamponada con fosfato (PBS)Sigma AldrichP4417-100TAB-
Cóctel de inhibidores de proteasaSigma AldrichP8340Añadido a 5 μL por mg de tejido
Solución de povidona yodadaMeda pharma7167204Desinfección preoperatoria
Fosfato de riboflavina (RFP)Sigma AldrichR0630000Concentraciones: 0.01% p/v (final); 0.02% p/v (stock)
SonicadorBandelein electronicSonoplus GM mini20-
Sonda de sonicadorBandelein electronicMS 1.5Sonda de 1.5 mm de diámetro, 63 mm de longitud.
Suturas de tarsorrafia (no reabsorbibles)Alcon 80653080011–2 suturas según sea necesario
Solución oftálmica de tobramicina (3 mg/mL)NovartisTobrexDosificación: dos veces al día hasta el cierre
Trephina de Hessburg-Barron, diámetro de 6.5 mmJedmed21-8265-
Tubos de recolección de sangre Vacutainer con separador de gel poliméricoBD (Becton, Dickinson and Company)367704-
Solución de xilacinaLaboratorios Calier SAXylagesicDosis: 5 mg/kg inyección intramuscular

Referencias

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