Marcado metabólico del transcriptoma naciente en Xenopus embriogénesis temprana

Resumen

Proporcionamos métodos detallados para marcar y purificar metabólicamente los transcritos nacientes para el análisis transcriptomático en embriones tempranos de Xenopus utilizando 5-etinil-uridina (5-EU).

Resumen

La embriogénesis temprana requiere la nueva transcripción de genes cigóticos a partir del genoma cigótico inicialmente latente tras la fertilización. Un gran desafío ha sido detectar con precisión los nuevos transcritos y determinar su momento de expresión durante la activación del genoma cigótico (ZGA). Aquí ofrecemos procedimientos detallados para el marcaje metabólico de los transcritos incipientes mediante 5-etinil-uridina (5-EU) en embriones tempranos de Xenopus laevis . Tras la fertilización, el 5-EU se microinyecta en los embriones de la etapa 1-celular para marcar metabólicamente los ARN recién transcritos durante la ZGA. Los ARN-UE incipientes se purifican posteriormente tras la biotinilación mediante reacciones mediadas por química de clics, y el transcriptoma incipiente se determina mediante secuenciación de nueva generación. Es importante destacar que este método tiene una alta sensibilidad y especificidad que permiten la caracterización de genes poco activados. Así, este enfoque proporciona una herramienta poderosa para estudiar la dinámica de la transcripción génica durante el desarrollo temprano, y puede generalizarse a otros sistemas o tejidos embrionarios.

Introducción

Tras la fecundación, el embrión está bajo el control de factores maternos depositados en el óvulo, mientras que el genoma cigótico permanece transcripcionalmente silencioso durante un tiempo; Se activa para transcribir cientos o miles de genes esenciales para su desarrollo posterior, incluyendo la especificación del destino celular y la formación de la capa^germinal 1,2,3,4,5,6. Este fenómeno de activación del genoma cigótico (ZGA) durante la transición materno-cigótica (MZT) está altamente conservado en todas las especies de metazoos, aunque el momento de la ZGA varía entre las especies 1,2,3,4,5,6. Comprender cómo se regula el ZGA no solo es importante para comprender los principios fundamentales del desarrollo temprano, sino que también ofrece potencial para desarrollar estrategias novedosas para diagnosticar y tratar trastornos del desarrollo y mejorar la salud reproductiva.

Uno de los principales retos en el estudio del ZGA ha sido detectar con precisión nuevos transcritos y determinar su momento de inicio durante la activación del genoma cigótico (ZGA). Debido a la predominancia de transcritos maternos en embriones^{tempranos 7}, los altos niveles de estos transcritos pueden enmascarar la detección de nuevos transcritos durante ZGA, especialmente para aquellos genes poco activados, utilizando ARN-seq convencional a granel. Para superar este desafío, desarrollamos un método para medir el transcriptoma incipiente utilizando marcaje metabólico de los transcritos incipientes con 5-etinil-uridina (5-EU), seguido de la biotinilación de los ARN-UE incipientes mediante química de clics y su purificación para secuenciación (EU-ARN-seq^)8,9,10. En comparación con otros métodos incipientes de perfilado de transcritos, como los que utilizan 4-tiouridina (4sU)^11,12, el marcaje 5-EU es altamente específico mediante química por clic, puede usarse tanto para imágenes como para secuenciación, y no requiere conversión química. Además, el incipiente ARN-EU-seq es altamente sensible y detecta cientos de genes, cuya activación no puede ser detectada por el ARN-seq⁸ convencional en volumen. Este enfoque también nos permitió determinar con precisión el inicio de la activación genética cigótica individual y perfilar los patrones espaciotemporales distintivos de ZGA durante la embriogénesis^{temprana 8}.

Aquí describimos los procedimientos detallados para preparar muestras para el EU-ARN-seq para perfilar el transcriptoma incipiente utilizando embriones tempranos de Xenopus laevis como modelo. Este protocolo está adaptado de un método^{anterior 10,13} con optimizaciones menores en los procedimientos, incluyendo la microinyección de 5-EU en embriones en la etapa de célula 1, la biotinilación de ARNe-EU incipientes mediante reacción de clic y su purificación para secuenciación (Figura 1). Para asegurar la reproducibilidad, dependiendo de las etapas de embriones tempranos con abundancia variable de transcritos nacientes, se deben usar entre 1 y 10 μg de ARN total como entrada, aunque aún se puede emplear una cantidad menor. Este protocolo puede aplicarse en otros sistemas embrionarios, como Drosophila¹⁴ y pez^{cebra 15}, y otros tejidos¹³. Este método es una herramienta poderosa para nuestra comprensión de la transcripción génica y los mecanismos regulatorios en diversos procesos biológicos, incluyendo la revelación de principios novedosos de la embriogénesis temprana.

Protocolo

El trabajo con animales descrito en este estudio ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Carolina del Sur. La seguridad en el laboratorio y la eliminación de residuos deben cumplir con la normativa institucional.

1. Preparación de reactivos y tampones

1. Solución 20x MMR (Marc's Modified Ringer): mezcla 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM_{MgCl 2} y 40 mM_{CaCl 2}. Ajusta el pH a 7,8 con NaOH. Autoclave y guarda a temperatura ambiente.
2. 3% de Ficoll (p/v)/0,5x MMR: Añadir lentamente 1,5 g de Ficoll 400 a 50 mL de 0,5x MMR mientras se remueve suavemente con una barra magnética hasta que el Ficoll esté completamente disuelto. Autoclave y mantenlo a 4 °C hasta que se use.
3. Solución de stock de 5-etinil uridina (5-EU): Para obtener la solución de 50 mM, añade 372,8 μL de tampón (hay que tener en cuenta que cualquier tampón compatible con microinyección puede usarse, por ejemplo, 1x cucharada de pH, pH 7,6) en el vial de 5 mg. Mezcla bien y haz alicuotas de 2 μL. Guarda a -80 °C.

2. Microinyección de 5-EU en embriones unicelulares

1. Para obtener embriones de Xenopus , se siguen los protocolos estándar para realizar la fertilización in vitro (FIV) (por ejemplo, véase Sive et al., 2007)¹⁶. El embrión debería estar en 0,1x de MMR, listo para su uso.
2. Añade 1 mL de Ficoll al 3%/MMR 0,5x en una cámara de microinyección hecha de un portaobjetos estándar de vidrio (25 mm x 75 mm). Utiliza una pipeta de transferencia de plástico para transferir 20 embriones (o más si es necesario) al centro de la cámara de microinyección.
3. Usa una pinza fina para cortar cuidadosamente la punta muy fina de la aguja de cristal y clava la aguja verticalmente (con la punta hacia abajo) contra la arcilla de modelar en la pared del banco. Utiliza la pipeta P2 con la punta del microcargador para añadir 0,5 μL de 50 mM 5-EU desde la parte superior de la aguja de vidrio.
4. Monta la aguja sobre un micromanipulador. Usa la pipeta P10 para añadir 10 μL de aceite de halocarbono en un micrómetro de escenario y ponlo bajo un estereomicroscopio.
5. Para calibrar el volumen de inyección, primero utiliza el pie para presionar la almohadilla en el suelo conectado al microinyector e inyecta una gota en el aceite de halocarbono del micrómetro. Dependiendo del tamaño de la gota, se ajusta la presión y el tiempo de inyección en el microinyector para determinar que el volumen de inyección es de 10 nL, es decir, 0,27 mm de diámetro en el micrómetro.
6. Usa una pinza en una mano para ayudar a sujetar el embrión, con la otra mano el micromanipulador e inyecta 10 nL de 50 mM EU en embriones en la etapa de 1 célula. La concentración final de 5-EU en el embrión es de ~0,5 mM.
7. Después de la microinyección, utiliza una pipeta de transferencia de plástico para transferir los embriones desde la cámara de inyección a una nueva placa de cristal que contenga 3% de Ficoll/0,5x MMR. Mantén los embriones inyectados en Ficoll durante ~1 hora.
8. Retira cuidadosamente la solución de Ficoll y sustituye el medio por MMR 0,1x. Mantén los embriones en 0,1x MMR hasta que se use más. Supervisa constantemente el desarrollo de los embriones y elimina cualquier embrión anormal si es necesario.
9. Cuando los embriones alcanzan las etapas deseadas de desarrollo, se utiliza una pipeta de transferencia plástica para transferir 10 embriones a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Utiliza una pipeta P200 para eliminar cuidadosamente cualquier medio residual del tubo y congela rápidamente los embriones en nitrógeno líquido.
   Nota: Para garantizar la rigidez y la reproducibilidad, solo recoge los embriones que sean normales en función de su apariencia en comparación con el control. Retirar y excluir cualquier embrión anormal de análisis posterior. Si es necesario, también recoge el mismo número de embriones sin microinyección que los controles negativos.
10. Guarda los embriones en un congelador a -80 °C hasta que se use más.

3. Extracción total de ARN y medición de concentraciones

NOTA: Utilice un kit de extracción de ARN total basado en membrana sílice para aislar ARN total de embriones tempranos y un kit de cuantificación de ARN de alta sensibilidad basado en fluorescencia para determinar las concentraciones de ARN. Sigue las instrucciones proporcionadas por el kit y los siguientes pasos están ligeramente modificados respecto al manual. Todas las soluciones y reactivos utilizados en los siguientes pasos deben estar libres de RNasa.

1. Pon las muestras del congelador a -80 °C sobre hielo.
2. Añade 700 μL del Buffer RLT del kit de extracción de ARN en cada tubo. Usa una pipeta P1000 para subir y bajar al menos 15 veces o hasta que todos los embriones estén disueltos.
3. Deja las muestras en hielo durante 20 minutos. Mezcla suavemente de nuevo pipeteando arriba y abajo al menos 10 veces para homogeneizar completamente los embriones.
4. Añade 700 μL de etanol al 70% a los embriones homogeneizados. Pipetear arriba y abajo para mezclar bien y transferir los 700 μL de la mezcla a una columna de spin.
5. Centrifuga la columna a 10.000 x g durante 1 minuto. Descarta el flujo directo. Repite la centrifugadora hasta que el resto de la mezcla esté completa.
6. Añade 350 μL del buffer RW1 y centrifuga la columna a 10.000 x g durante 1 minuto. Descarta el flowthrough.
7. Añade cuidadosamente 80 μL de DNasa I al centro de la membrana de la columna. Incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente.
8. Añade 350 μL de buffer RW1 y centrifuga la columna a 10.000 x g durante 1 minuto. Descarta el flowthrough.
9. Añade 500 μL de RPE de tampón y centrifuga la columna a 10.000 x g durante 1 minuto. Descarta el flowthrough. Repite la lavadora una vez más.
10. Seca la columna centrifugándola de nuevo a 10.000 x g durante 2 minutos.
11. Transfiere la columna a un nuevo tubo libre de RNasa. Añade cuidadosamente 35 μL de H₂O libre de RNasa al centro de la membrana de la columna.
12. Centrifuga la columna a 10.000 x g durante 1 minuto. Recoge el ARN eluído y mantenlo en hielo.
13. Para medir la concentración de ARN, primero se prepara la solución de trabajo utilizando el kit de cuantificación de ARN diluyendo el reactivo de ARN (el colorante) a 1:200 en el tampón de ARN. Calcular el volumen total de la solución de trabajo en función del número total de estándares y preparar 200 μL para cada estándar o muestra.
14. Monta una tira de 8 tubos de 0,2 mL. Para diluir cada estándar, añade 10 μL a 190 μL de la solución de trabajo. Para diluir cada muestra, añade 1 μL a 199 μL de la solución de trabajo. Mezcla bien.
15. Pon la tira de 8 tubos en un fluorómetro. Selecciona el ensayo de ARN, calibra con los estándares y lee las concentraciones de las muestras.

4. Biotinilación y purificación de ARN de la UE incipiente

NOTA: Se utiliza un kit de captura de ARN naciente basado en química de clic para biotinilar y extraer los ARN-UE incipientes. Sigue las instrucciones proporcionadas por el kit y los siguientes pasos se modifican ligeramente. Los ARN de embriones no inyectados, así como los ARN-UE sin biotinilación, pueden servirse como controles de fondo para la especificidad del pulldown.

1. Biotinilación y limpieza de ARN
   1. Para cada muestra, mezclar los siguientes componentes en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL para realizar una reacción de clic de 50 μL: ARN total (1–10 μg), 1x tampón EU, 2 mM CuSO₄, 0,25 mM biotida azida, 10 mM aditivo 1 y 12 mM aditivo 2.
   2. Incuba la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos en un nutator.
   3. En cada reacción anterior, añade 1 μL de glucógeno, 50 μL de acetato de amonio 7,5 M y 700 μL de etanol 100% refrigerado. Pipetea arriba y abajo 5 veces para mezclarlos bien.
   4. Mete el tubo en un congelador a -80 °C y guárdalo toda la noche.
   5. Centrifuga el tubo a 13.000 x g durante 20 minutos a 4 °C. Retira cuidadosamente el sobrenadante sin mover el pellet.
   6. Añade 700 μL de etanol al 75% y mezcla suavemente para volver a suspender el pellet. Centrifuga el tubo a 13.000 x g durante 5 minutos a 4 °C. Retira cuidadosamente el sobrenadante sin mover el pellet. Repite la lavadora una vez más.
   7. Seca el pellet al aire durante 5–10 minutos a temperatura ambiente. Resuspende el pellet en 10 μL de H₂O libre de RNasa.
2. Purificación de ARN en EU
   1. Para extraer los ARNu-UE incipientes, para cada muestra, se dispensan 5 μL de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina en un nuevo tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
   2. Añade 9 μL de Wash Buffer 2. Mezcla bien y coloca el tubo sobre un soporte magnético. Déjalo reposar 2 minutos. Quita el sobrenadante. Repite la lavadora dos veces más. Vuelve a suspender las esferas en 5 μL de Wash Buffer 2.
   3. Preparar la siguiente mezcla maestra en un nuevo tubo microcentrífuga de 1,5 mL (15 μL por muestra): 12,5 μL de tampón de unión al ARN (Componente G), 0,2 μL de RNasa OUT diluida 1:10 y 2,3 μL de H_2Olibre de RNasa. Añadir 15 μL de la mezcla a cada tubo que contenga la muestra de ARN.
   4. Incuba durante 5 minutos en un bloque térmico a 69 °C. Pon el tubo en hielo.
   5. Añadir 5 μL de las perlas prelavadas anteriores a cada tubo que contenga la muestra de ARN. Incuba durante 30 minutos en un nutator a temperatura ambiente.
   6. Añade 50 μL de Wash Buffer 1. Mezcla bien y coloca el tubo sobre un soporte magnético. Déjalo reposar 2 minutos. Quita el sobrenadante. Repite la lavado otras 4 veces.
      Nota: El sobrenadante tras el primer lavado, que presumiblemente contiene solo los transcripciones maternas, puede recogerse para medir el transcriptoma materno.
   7. Añade 50 μL de Wash Buffer 2. Mezcla bien y coloca el tubo sobre un soporte magnético. Déjalo reposar 2 minutos. Quita el sobrenadante. Repite la lavado otras 4 veces.
   8. Vuelve a suspender las esferas en 5 μL de Wash Buffer 2. Las perlas, que contienen los ARN-UE nacientes, están listas para la síntesis directa de ADNc y la preparación de la biblioteca.
      Nota: Antes de proceder con la preparación de la biblioteca, el enriquecimiento de transcritos incipientes puede evaluarse midiendo la expresión de genes individuales conocidos mediante la reacción en cadena de transcripción inversa de la polimerasa (RT-PCR).

5. Preparación y secuenciación de bibliotecas de ARN

1. Utiliza kits disponibles comercialmente para preparar las bibliotecas de ADNc y sigue las instrucciones proporcionadas por el kit. Utiliza el NEBNext Library Quant Kit para Illumina para cuantificar las bibliotecas y agruparlas.
2. Agrupa las bibliotecas siguiendo las instrucciones de los kits de secuenciación de nueva generación más usados. Diluir las bibliotecas a ~1,8 pM antes de cargarlas en el secuenciador de sobremesa para lograr una densidad óptima de clúster de ~200k/^mm2 durante la secuenciación. Secuencia las bibliotecas usando la secuenciación de nueva generación comúnmente utilizada. Usé secuenciación de extremos emparejados de 75 pb para ~20 millones de lecturas por muestra.
3. Cuantifique las lecturas transcriptómicas alineando las secuencias con la construcción genómica 9.2 de Xenopus laevis usando salmon¹⁷ y realice un análisis diferencial de expresión génica usando DESeq2¹⁸. Para visualizar los picos en el explorador genómico, mapea las secuencias al genoma usando STAR¹⁹ y muestra en el Visor Genómico Integrativo (IGV⁾¹⁹.

Resultados

Los embriones de Xenopus laevis (cuatro réplicas biológicas) en las etapas de 5 a 9 horas después de la fertilización (hpf) a 22 °C, que cubren las etapas desde la etapa 5 (con poca ZGA a gran escala) hasta la etapa 9 (con ZGA alto), fueron procesados siguiendo el protocolo superior^{a 8}. Se utilizaron los ARN totales, los ARN de la UE naciente purificados y los ARN de flujo para la preparación de las bibliotecas y se secuenciaron. Como se muestra en la

Discusión

Aquí hemos proporcionado un protocolo detallado para el marcaje metabólico del transcriptoma naciente en embriogénesis temprana, incluyendo la microinyección del 5-EU en embriones unicelulares, la extracción de ARN totales y la medición de sus concentraciones, así como la biotinilación y purificación de los ARN-UE incipientes para la preparación y secuenciación de bibliotecas (EU-ARN-Seq) (Figura 1). Debido a la alta sensibilidad y especificidad del enfoque ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
& micro; Microinyector PUPM	Instrumentos de Precisión Mundial	UPUMP	Para microinyección (microinyección con presión)
5-etinila uridina	Thermo Fisher Scientific	E10345	Para microinyección (marcado de traqnscripts incipientes)
Estereoscópicos Zoom ACCU-SCOPE 3075	VWR	470351-130	Para microinyección (visualización de embriones)
Acetato de amonio	Sigma-Aldrich	A2706	Para la precipitación de ARN
Ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A7506	Para la reacción de clic
Capilares de vidrio borosilicato	Instrumentos de Precisión Mundial	TW100-4	Para microinyección (fabricación de agujas de vidrio)
Centrifugadora	Eppendorf	5425R	Para centrifugadora
Kit de captura de ARN Nacente Click-iT	Thermo Fisher Scientific	C10365	Para biotinilar y purificar ARN naciente
CuSO4	Sigma-Aldrich	61230	Para la reacción de clic
DNasa I	Roche Diagnostics	4716728001	Para la extracción de ARN
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	GE17-0300-10	Para microinyección (incubación de embriones)
Placa de Petri de vidrio (60 mm)	VWR	75845-542	Para fertilización
Glucógeno	Thermo Fisher Scientific	AM9510	Para la precipitación de ARN
Aceite de Halocarbono 27	Sigma-Aldrich	H8773	Para microinyección (calibración del volumen de inyección)
L-cisteína	Sigma-Aldrich	168149	Para embriones que dejan en peligro
Puntas de microcargador	calibre scientific	EPE-5242956003	Para microinyección (cargando 5-EU en la aguja de vidrio)
NEBNext Library Quant Kit para Illumina	NEB	E7630	Para la cuantificación de bibliotecas
NSQ 500/550 Alta Salida KT v2.5 (75 CYS)	Illumina	20024906	Para secuenciación
Fluorómetro Qubi Flex	Thermo Fisher Scientific	P33327	Para medir la concentración de ARN
Kit de unión de ARN HS con qubits	Thermo Fisher Scientific	P32852	Para medir la concentración de ARN
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Para la extracción de ARN
Micrometro de etapa	La ciencia de Ward	470175-914	Para microinyección (calibración del volumen de inyección)
Universal RNA-seq con NuQuant	NuGEN	0364	Para la preparación de la biblioteca