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Artículo de método

Visualización de la activación del genoma cigótico en células individuales de embriones tempranos

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DOI:

10.3791/70592

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3 de abril de 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

En este artículo

Resumen

Describimos métodos para visualizar la transcripción naciente durante la activación del genoma cigótico en células individuales durante la embriogénesis temprana.

Resumen

La embriogénesis temprana requiere la transición materna a cigótica (MZT) que hace necesaria la activación del genoma cigótico (ZGA). Durante la ZGA, se transcriben cientos o miles de genes, lo cual es esencial para diversos procesos en el desarrollo embrionario temprano, incluyendo el mantenimiento de la supervivencia embrionaria, la especificación del destino celular y la formación de la capa germinal. Uno de los principales retos en el estudio de la ZGA ha sido visualizar directamente la ZGA en células individuales de embriones tempranos. Aquí describimos un método para visualizar directamente la ZGA en células individuales de embriones tempranos mediante marcaje metabólico de transcritos nacientes usando 5-etinil uridina (5-EU), seguido de conjugar los ARN-EU nacientes con fluoróforos mediante química de clic y visualizarlos en embriones de montaje completo mediante microscopía confocal, usando Xenopus laevis como modelo. Este método nos permitió rastrear la ZGA unicelular en embriones de montaje completo y revelar el inicio heterogéneo de la ZGA en el espacio y el tiempo durante la embriogénesis temprana. Puede utilizarse en otros sistemas o tejidos embrionarios para estudiar la transcripción génica y la regulación genómica a nivel unicelular.

Introducción

Durante el desarrollo temprano, el embrión pasa por la transición materna a cigótica (MZT) que gradualmente cambia el control del desarrollo de los factores maternos al de los genes cigóticos. La MZT requiere la activación del genoma cigótico inicialmente latente, un proceso denominado activación del genoma cigótico (ZGA); los genes expresados durante ZGA son necesarios para la especificación temprana del destino celular, la gastrulación y la formaciónde ejes 1,2. Es importante destacar que el ZGA se conserva en todos los metazoos, y el momento del ZGA está estrictamente controlado, aunque varía entre las especies3 y 4. La desregulación de la ZGA puede tener consecuencias graves, que van desde defectos del desarrollo hasta muerte embrionaria, como el aborto espontáneo. Por lo tanto, estudiar los mecanismos de la ZGA no solo es importante para comprender los fundamentos de la regulación génica, sino que también tiene importantes implicaciones clínicas.

Un gran desafío en el estudio de la ZGA ha sido visualizar directamente la ZGA a gran escala en embriones tempranos e investigar sus mecanismos a nivel de célula única. Superamos este desafío desarrollando un método que utiliza marcaje metabólico de transcritos nacientes durante ZGA con 5-etinil uridina (5-EU), seguido de la conjugación de los ARN-UE incipientes con fluoróforos mediante química de clics y visualización en embriones de montaje completo mediante microscopía confocal, usando Xenopus laevis como modelo. El gran embrión de Xenopus (~1,2 mm de diámetro) contiene un gradiente de tamaño celular, y el ZGA a gran escala se produce alrededor de las etapas medias de la blástula (con inicio alrededor de la etapa 7 y pico alrededor de la 9), lo que lo convierte en un modelo ideal para estudiar patrones de ZGA5. Al utilizar el marcaje 5-EU en embriones tempranos de Xenopus, pudimos visualizar y cuantificar directamente el ZGA a gran escala en células individuales de embriones tempranos de montaje completo, lo que nos llevó a descubrir un nuevo patrón espaciotemporal de ZGA regulado principalmente por el tamaño celular 5,6.

Aquí describimos los detalles de este enfoque, adaptado de trabajos previos con optimizaciones 5,7, incluyendo la fijación de embriones tras el marcaje metabólico de transcritos nacientes con 5-EU, la conjugación de ARN-EU nacientes con un fluoróforo mediante una reacciónde clic 8, y la inmunotinción para marcadores subcelulares, seguida de la autorización de los embriones para la imagen confocal. Este método puede aplicarse a otros sistemas embrionarios, incluyendo el pezcebra 9,10, o emplearse en secuenciación para perfilar el transcriptomaincipiente 11, apoyando su aplicación general y amplia en diversos tipos de muestras y análisis. En conjunto, este método proporciona un nuevo y importante medio para estudiar los mecanismos reguladores genómicos en células individuales.

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Protocolo

El trabajo con animales aquí descrito ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Carolina del Sur.

1. Preparación antes de iniciar el protocolo

NOTA: Antes de iniciar el protocolo, prepare las siguientes soluciones utilizando agua libre de RNasa.

  1. Preparar 1× solución fisiológica con tampón tris (TBS), pH 7,6: 50 mM Tris-HCl y 150 mM NaCl. Ajusta el pH a 7,6. Guárdalo a temperatura ambiente. Usa el buffer en un plazo de dos meses.
  2. Preparar 1× solución salina con Tris-Buffer con Tween 20 (TBST), pH 7,6: añadir Triton X-100 a una concentración final del 0,1% (vol/vol) a 1× cucharadas (pH 7,6) preparado con agua libre de RNasa. Guárdalo a temperatura ambiente. Usa el buffer en un mes.
  3. Preparar 4% de paraformaldehído (PFA)/1× MEM: mezclar 1 vial (10 mL) de stock de PFA al 16% y 4 mL de 10× MEM (1000 mM 3- (N-morfolino)ácido propanosulfónico [MOPS] pH 7,4, 20 mM de EGTA y 10 mM deMgSO 4). Añade agua sin RNasa a 40 mL. Alicota y guarda a -20 °C. Usa la solución en un plazo de 6 meses.
  4. Preparar metanol al 70%, 50% y 25% en 0,5× SSC: mezcla metanol y 0,5× SSC en 3:1, 1:1 y 1:3, respectivamente. Utiliza la solución en un plazo de seis meses.
  5. Prepara solución blanqueadora: Mezcla hasta alcanzar una concentración final de 2% (vol/vol)H2O2, 5% (vol/vol) formamida y 0,5× SSC en agua libre de RNasa. Prepara esta solución de forma fresca justo antes de usarla.
  6. Prepara la solución bloqueadora: Añadir una concentración final de suero de cabra al 10% (vol/vol) y 0,2% (peso/vol) de BSA en 1× TBST. Guarda a -20 °C. Usa la solución en un plazo de 6 meses.
  7. Prepara el reactivo de eliminación BABB: Mezcla 1 parte de alcohol benzílico (BA) y 2 partes de benzoato benzílico (BB). Guárdalo a temperatura ambiente. Usa la solución en un plazo de 6 meses.

2. Fijar los embriones microinyectados con 5-EU

  1. Para microinyectar 5-etiniluridina (5-EU) en embriones de 1 célula, sigue los procedimientos descritosanteriormente 11. Deja que los embriones se desarrollen hasta las etapas deseadas de ZGA, por ejemplo, la etapa 9 cuando la ZGA está activamente presente en la mayoría de las células del embrión.
  2. Para fijar los embriones microinyectados con 5-EU, primero añade aproximadamente 1,8 mL de PFA/1× MEM al 4% en un frasco de vidrio centelleado de 2 mL. Luego usa una pipeta de transferencia de plástico para transferir ~20 embriones al vial de cristal. Minimiza la cantidad de medio de cultivo añadido al vial de vidrio.
  3. Llena el frasco de cristal hasta arriba con un 4% adicional de PFA/1× MEM. Cierra el vial con la tapa; No se deben dejar burbujas de aire.
  4. Coloca el vial de cristal sobre un rotador y gira el embrión a baja velocidad (por ejemplo, 10 rpm) durante al menos 2 horas a temperatura ambiente.
  5. Usa una pipeta para retirar cuidadosamente el fijador. Llena el frasco de cristal con metanol al 100%. Coloca el frasco de cristal sobre un rotador y haz girar los embriones a baja velocidad durante 5 minutos.
  6. Retira cuidadosamente el metanol y añade metanol nuevo. Repite la rotación y deshidratación al menos dos veces para que los embriones queden completamente deshidratados.
  7. Almacena los embriones en metanol a -20 °C.
    NOTA: El protocolo puede pausarse aquí. Deja que los embriones permanezcan en metanol al menos 2 días antes de proceder con los siguientes pasos. Los embriones pueden usarse en un plazo de 2 meses.

3. Conjugación de ARN incipientes con un fluoróforo mediante reacción de clic

  1. Para rehidratar los embriones, primero se retira el metanol del vial de vidrio, luego se añaden 2 mL de metanol al 75% en un SSC 0,5× y se cierra el frasco con la tapa. Coloca el frasco de cristal sobre un rotador y haz girar los embriones a baja velocidad durante 5 minutos.
  2. Retira el líquido del frasco de cristal después de la rotación. Repite el paso anterior de forma secuencial usando un 50% de metanol en 0,5× SSC, 25% de metanol en 0,5× SSC y 0,5× SSC. Para rehidratar completamente los embriones, repite el lavado final con 0,5× de SSC al menos dos veces.
  3. Añade 2 mL de solución blanqueadora recién preparada (2%H2O2 y 5% formamida en 0,5× SSC) al vial de vidrio. Pon el vial de cristal sobre un trozo de papel de aluminio y luego colócalo bajo una luz LED a una distancia que no sobrecaliente las muestras.
  4. Blanquea los embriones bajo la luz hasta que todos los pigmentos se queden blancos, lo que normalmente tarda entre 5 y 6 horas. Ten en cuenta que, debido a la descomposición deH2O2 en O2, se generan pequeñas burbujas de aire que pueden hacer que los embriones floten. Revisa los embriones periódicamente (por ejemplo, cada 30 minutos) y gira suavemente el frasco de cristal para que se asienten en la solución blanqueadora.
  5. Retira cuidadosamente el amortiguador blanqueador. Añade 2 mL de 0,5× SSC para enjuagar rápidamente los embriones. Repite el enjuague rápido una vez más si es necesario.
  6. Añade 2 mL de 1× TBST en el frasco de cristal. Coloca el vial de cristal sobre un rotador y gira los embriones a baja velocidad durante 1 hora. Retira el líquido del frasco de cristal después de la rotación.
  7. Repite el paso anterior al menos 5 veces. Ten en cuenta que el lavado exhaustivo de los embriones es fundamental para los siguientes pasos.
  8. Añade 2 mL de 1× cucharadas en el vial de cristal. Coloca el frasco de cristal sobre un rotador y haz girar los embriones a baja velocidad durante 5 minutos. Retira el líquido del frasco de cristal después de la rotación.
  9. Repite el paso anterior una vez más.
  10. Prepara la mezcla para la reacción por clic en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL añadiendo los siguientes reactivos para alcanzar concentraciones finales de 100 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 1 mM de CuSO4, 25 μM de tetrametilrodamina (TAMRA)-azida y 100 mM de ácido ascórbico. Añade ácido ascórbico al final de la reacción. Pipetea arriba y abajo para mezclar bien.
  11. Añade una mezcla de reacción de 200 μL a los embriones del frasco de vidrio. Asegúrate de que el volumen de la mezcla de reacción sea suficiente para sumergir todos los embriones en el vial. Incuba durante 12 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.
  12. Retira cuidadosamente la mezcla de reacción de clic. Ten en cuenta que se puede observar fluorescencia inespecífica en los embriones. Enjuaga rápidamente los embriones dos veces con 1× TBST, luego lávalos con 1× TBST al menos 5 veces, cambiando la solución cada 1 hora como se ha descrito antes.
  13. Continúa lavando los embriones cambiando 1× TBST cada 2 horas y déjalos toda la noche a 4 °C en un rotador. Deja de lavar cuando apenas se detecta fluorescencia inespecífica. Ten en cuenta que, dado que los residuos de la reacción de clic pueden ser perjudiciales para la inmunotinción posterior, asegúrate de que los embriones estén bien lavados durante 1–2 días antes de pasar a los siguientes pasos.

4. Inmunotinción de embriones con marcadores subcelulares (opcional)

  1. Para bloquear los embriones, retira el 1× TBST del vial de vidrio en el último paso de lavado anterior y añade 200 μL de la solución bloqueante (10% suero de cabra/0,2% BSA/1× TBST). Envuelva el frasco de cristal con un trozo de papel de aluminio para proteger a los embriones de la luz. Coloca el frasco de cristal sobre un nutator y agita suavemente los embriones durante al menos 1 hora a temperatura ambiente (o durante la noche a 4 °C).
  2. Diluir el anticuerpo primario (por ejemplo, anticuerpo anti-H3) a 1:1.000 en 200 μL de suero de cabra al 10%/1× TBST. Añade el anticuerpo diluido al frasco de cristal y envuelve el frasco de cristal con un trozo de papel de aluminio. Incuba los embriones durante la noche a 4 °C en un nutator a baja velocidad.
  3. Retira cuidadosamente el anticuerpo del frasco de cristal. Enjuaga rápidamente los embriones dos veces añadiendo 2 mL de 1× TBST al frasco de cristal y retirándolo.
  4. Añade 2 mL de 1× TBST al frasco de cristal y luego envuélvelo con un trozo de papel de aluminio. Coloca el vial de cristal sobre un rotador y gira los embriones a baja velocidad durante 1 hora. Retira el líquido del frasco de cristal después de la rotación.
  5. Repite el paso anterior al menos 5 veces.
  6. Diluye el anticuerpo secundario (por ejemplo, anticuerpo Alex Fluor 488 de conejo) a 1:1.000 en 200 μL de suero de cabra al 10%/1× TBST. Si es necesario tintorcer con ADN, diluir el tinte de ADN (por ejemplo, TO-PRO-3) junto con el anticuerpo secundario.
  7. Añade el anticuerpo diluido al vial de cristal y envuélvelo con papel de aluminio. Incuba los embriones durante la noche a 4 °C en un nutator a baja velocidad.
  8. Retira cuidadosamente el anticuerpo del frasco de cristal. Enjuaga rápidamente los embriones dos veces añadiendo 2 mL de 1× TBST al frasco de cristal y retirándolo.
  9. Añade 2 mL de 1× TBST al frasco de cristal y luego envuélvelo con un trozo de papel de aluminio. Coloca el vial de cristal sobre un rotador y gira los embriones a baja velocidad durante 1 hora.
  10. Repite el paso anterior al menos 5 veces.

5. Limpieza de embriones antes de la imagen confocal

  1. Para deshidratar los embriones, retira cuidadosamente el tampón del frasco de cristal tras el lavado final y añade 2 mL de metanol al 100%. Envuelve el frasco de cristal en papel de aluminio, colócalo sobre un rotador y deja que los embriones giren a baja velocidad durante 5 minutos. Retira el líquido del frasco de cristal después de la rotación.
  2. Repite el paso anterior al menos 5 veces.
  3. Para deshidratar completamente los embriones, repite el paso anterior al menos 5 veces usando 2 mL de metanol anhidro al 100%.
  4. Retira cuidadosamente la mayor cantidad posible de metanol del frasco de cristal.
  5. Utiliza una pipeta de cristal para añadir lentamente 500 μL del reactivo de limpieza BABB en el frasco de vidrio. Los embriones flotarán en el BABB y esperarán 10 minutos hasta que todos se asienten en el fondo del frasco de cristal. Ten en cuenta que los embriones se volverán casi invisibles y retira cuidadosamente el BABB sin dañarlos.
  6. Repite el paso anterior al menos 2 veces más, o hasta que no se vean líneas de schlieren. Para eliminar completamente los embriones, mantenlos en BABB durante 1–2 días antes de la imagen.
  7. Crear cámaras de imagen cortando un pequeño cuadrado (por ejemplo, ~5 mm × 5 mm) de la cinta VHB con un grosor de ~ 1,1-1,2 mm (similar al tamaño del embrión) y un tamaño de ~10 mm × 10 mm, seguido de adherirlo a un vidrio de cubierta de 24 mm × 40 mm.
  8. Transfiere cuidadosamente los embriones despejados a la cámara y cúbrelos con otro vaso de cobertura. Los embriones estarán dentro del sándwich de coverglasses para que ambos lados puedan ser fotografiados.
  9. Realiza imágenes bajo un microscopio confocal.

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Resultados

Los embriones de Xenopus laevis en la etapa 1-celular fueron microinyectados con 5-EU, y los embriones en estadio 9 se fijaron cuando la ZGA a gran escala se produjo en todo el embrión. Los embriones se procesaron siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Los ARN nacientes en embriones fueron marcados con TAMRA-azida mediante reacción de clic, la histona H3 se marcó usando anticuerpos antihistonas H3 y el ADN con TO-PRO-3. Los embriones se fotografiaron bajo microscopio con...

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Discusión

ZGA representa una de las transiciones más críticas durante las primeras etapas del desarrolloembrionario 2,3. Aquí hemos descrito procedimientos detallados para preparar muestras que visualizen directamente ZGA en embriones de Xenopus tempranos de montaje completo, incluyendo la fijación de embriones microinyectados con 5-EU, la conjugación de ARN incipientes con un fluoróforo mediante reacción click, la inmunotinción d...

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Divulgaciones

El autor declara no tener intereses en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos al laboratorio Matthew Good de la Universidad de Pensilvania por su formación. Este trabajo contó con el apoyo parcial del Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano (R03HD105802).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
16% Paraformaldehído (PFA)EMS15710-SPara crear la solución fijadora
20 y más veces; SSCMediatechMT46-020-CMPara fabricar la solución blanqueadora
Mezclador nutador 3DVWR76595-802Para embriones nutadores
Frascos roscados de 9 mm (2 mL)VWR46610-722Para procesar embriones
Anticuerpo H3 antihistonaAbcama.1791Para la inmunotinción
Ácido ascórbicoSigma-AldrichA7506Para hacer la reacción de clic
Alcohol benzílicoSigma-Aldrich305197Para eliminar embriones
Benzoato de benzilACROS Organics105860010Para eliminar embriones
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA3059Para crear la solución de bloqueo
Tapones para viales roscados de 9 mm (2 mL)VWR46610-712Para procesar embriones
Tapadera (24 mm y multiplicada por 40 mm)VWR48393-060Para fabricar una cámara de imagen
CuSO4Sigma-Aldrich61230Para hacer la reacción de clic
Ácido tetraacético (oxietilenenitrilo) etilenenitrilo (EGTA)Thermo Fisher ScientificAC409915000Para crear la solución fijadora
Fiji ImageJNIHPara el procesamiento de imágenes
FormamidaThermo Fisher ScientificAC181090010Para fabricar la solución blanqueadora
Pipetas Pasteur de vidrioVWR14673-010Para transferir el BABB
Anticuerpo secundario anticonejo Alex Fluor 488Thermo Fisher ScientificA27034Para la inmunotinción
Suero de cabraAbcamab7481Para crear la solución de bloqueo
Peróxido de hidrógenoSigma-AldrichH1009Para fabricar la solución blanqueadora
Sulfato de magnesio (MgSO4)Thermo Fisher ScientificM65-500Para crear la solución fijadora
MetanolThermo Fisher ScientificA4524Para deshidratar embriones
Metanol, anhidroSigma-Aldrich322415Para deshidratar embriones
MOPSThermo Fisher ScientificAC172631000Para crear la solución fijadora
Mezclador nutador multimodoVWR76595-812Para embriones nutadores
Pipeta de transferencia de plásticoThermo Fisher Scientific13-711-9AMPara transferir embriones
Cuchilla de afeitarThermo Fisher Scientific18-100-970Para cortar cintas
Agua libre de RNasaThermo Fisher ScientificBP561-1Para crear soluciones libres de Rnase
Roto-Mini PLUS (rotador)VWR470313-912Para la rotura de embriones
Tetrametilrodamina (TAMRA)-azidaAbcamab146486Para hacer la reacción de clic
TO-PRO-3Thermo Fisher ScientificT3605Para teñir ADN
Triton X-100Sigma-Aldrich10789704001Para fabricar el tampón de lavado
Base Trizma (Base Tris)Sigma-AldrichT1503Para crear el tampón Tris
Cintas VHB 3M GPH-110GF (45 mil.)VWR76524-608Para fabricar una cámara de imagen
Microscopio confocal Zeiss LSM 700ZeissPara imagen confocal

Referencias

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  2. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), dev161471(2019).
  3. Jukam, D., Shariati, S. A. M., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
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