Un protocolo estandarizado para inducir la senescencia prematura inducida por estrés en melanocitos humanos primarios utilizando hidroperóxido de tert-butil

Resumen

Un protocolo estandarizado para inducir la senescencia prematura en HNM utilizando tBHP, protocolos estandarizados para analizar marcadores clave de senescencia, incluyendo la detención del crecimiento, la actividad SA-β-galactosidasa y los factores SASP.

Resumen

Los factores de estrés ambiental, como la radiación UV, la contaminación del aire o el humo de cigarrillo, impulsan el envejecimiento extrínseco de la piel. La exposición a estos factores extrínsecos de envejecimiento favorece la acumulación de células senescentes, lo que contribuye a la formación de arrugas y trastornos de la pigmentación. Los melanocitos, que proporcionan protección UV primaria, muestran una actividad reducida con la edad. Los melanocitos senescentes se acumulan en la piel envejecida y contribuyen a su aspecto envejecido; Sin embargo, existen pocos modelos para estudiar la senescencia de melanocitos, y este trabajo tiene como objetivo desarrollar un modelo reproducible para futuras investigaciones. En este estudio, presentamos un modelo de senescencia de melanocitos neonatales humanos (HNM) utilizando tert-butil hidroperóxido (tBHP), un inductor de estrés oxidativo bien caracterizado. La tBHP altera la homeostasis redox al agotar las defensas antioxidantes celulares y promover la sobreproducción radical, lo que provoca daños en el ADN y las proteínas. Caracterizamos el fenotipo de senescencia de los melanocitos tratados con tBHP mediante el análisis de marcadores de senescencia establecidos, incluyendo potencial de crecimiento restringido, cambios morfológicos y actividad de SA-β-Galactosidasa. Este modelo proporciona una herramienta valiosa para investigar la senescencia prematura inducida por estrés en melanocitos, ofreciendo información sobre su papel en el envejecimiento extrínseco de la piel y los trastornos de pigmentación.

Introducción

El envejecimiento cutáneo se compone de dos factores distintos: envejecimiento intrínseco y^{extrínseco 1,2}. El envejecimiento intrínseco es causado por procesos cronológicos naturales y factores genéticos, mientras que el envejecimiento extrínseco resulta de la exposición acumulada a factores de estrés ambientales, principalmente radiación ultravioleta, pero también contaminación del aire, humo de cigarrillo y agentes químicos, que aceleran el proceso de envejecimiento más allá de las tasas cronológicas^{normales 3,4}. Las exposiciones ambientales generan estrés oxidativo que sobrepasa las defensas antioxidantes celulares, provocando daños en el ADN, oxidación de proteínas y peroxidación lipídica. Estas alteraciones moleculares desencadenan respuestas persistentes al daño al ADN y disfunción celular, promoviendo finalmente la senescencia^{prematura 5,6}. Esta senescencia inducida por el estrés contribuye a las características clínicas de la piel envejecida, incluyendo arrugas, pigmentación desigual, reducción de elasticidad y deterioro de la función de la^barrera.

Los melanocitos residen en la epidermis basal y actúan como la principal defensa de la piel contra el daño inducido por los rayos UV, sintetizando melanina y transfiriéndola a los queratinocitos circundantes. Paradójicamente, este papel protector los hace especialmente vulnerables al estrés oxidativo y a la senescencia prematura durante el envejecimiento^{extrínseco 8,9}. El propio proceso de melanogénesis genera especies reactivas sustanciales de oxígeno como subproductos de las reacciones tirosinasas catalizadas, creando una carga oxidativa inherente que se amplifica aún más por exposiciones ambientales como la radiación UV y^{la contaminación 10,11}. Como resultado, el estrés ambiental crónico puede inducir daño oxidativo, disfunción mitocondrial y, en última instancia, senescencia^{celular 12}. A pesar de su importancia, quedan preguntas clave sobre las vías moleculares que gobiernan la senescencia de los melanocitos y cómo el estrés oxidativo inicia este proceso. Además, la influencia de los melanocitos senescentes en el microambiente cutáneo circundante como factor de los cambios cutáneos relacionados con la edad, especialmente a través de la liberación de factores SASP, sigue siendo insuficientemente^{comprendida 13,14}.

Aunque los melanocitos son particularmente susceptibles a la senescencia inducida por estrés oxidativo, los modelos experimentales para estudiar este proceso siguen siendo^{limitados 15,16}. La mayoría de la investigación sobre senescencia sigue basándose en modelos replicativos o inducidos por estrés en fibroblastos, pero estos enfoques no capturan la biología distintiva de los melanocitos ni su potencial para influir en el envejecimiento cutáneo mediante la intercomunicación con células vecinas y su propio perfil SASP¹⁷. Esta carencia pone de manifiesto la necesidad de modelos de senescencia específicos para melanocitos que reflejen con mayor precisión sus respuestas fisiológicas a los factores de estrés^{ambientales 18,19} y su contribución al envejecimiento de la piel humana.

A pesar de la disponibilidad de enfoques de senescencia inducida por estrés, su implementación en melanocitos humanos primarios sigue siendo técnicamente desafiante y a menudo se asocia con una variabilidad sustancial. Los melanocitos son particularmente sensibles al estrés oxidativo, lo que resulta en una ventana experimental estrecha entre la inducción efectiva de la senescencia y la citotoxicidad excesiva. Además, las diferencias dependientes del donante en las preparaciones de células primarias contribuyen aún más a resultados inconsistentes entre estudios. Estos desafíos suelen estar infrainformados y los protocolos suelen estar insuficientemente estandarizados, limitando la reproducibilidad. El protocolo actual aborda esta carencia proporcionando un régimen de tratamiento optimizado y reproducible, un esquema de dosificación definido y lecturas estandarizadas para una inducción y evaluación fiable de la senescencia en melanocitos humanos primarios.

El tert-butilo hidroperóxido (tBHP) es un inductor bien caracterizado del estrés oxidativo que promueve la senescencia al generar especies reactivas de oxígeno y agotar las defensas antioxidantes celulares. Se ha utilizado ampliamente para inducir la senescencia en fibroblastos dérmicos, donde activa marcadores característicos de senescencia mientras mantiene la viabilidad celular^20,21. Dado que la tBHP produce un estrés oxidativo sostenido a través de vías bioquímicas definidas, ofrece un sistema reproducible y accesible para estudiar la senescencia inducida por estrés oxidativo e investigar los mecanismos moleculares que vinculan el daño oxidativo con procesos de envejecimiento^22,23. A diferencia de los modelos basados en UV, la tBHP es especialmente ventajosa cuando se requiere una inducción controlada y reproducible del estrés oxidativo, independiente de los parámetros de irradiación y sin necesidad de equipos especializados.

HNM proporciona un modelo relevante para estudiar los mecanismos extrínsecos de envejecimiento²⁴. Como células primarias derivadas del prepucio, conservan intactas vías de respuesta al estrés y evitan artefactos asociados a la modificación genética o^{inmortalización 25}. Los melanocitos neonatales proporcionan un modelo experimental óptimo ya que presentan un daño basal mínimo, lo que permite una evaluación clara de las vías de senescencia inducidas por factores de estrés^{ambientales 26,27}.

Este estudio emplea el estrés oxidativo inducido por tBHP en melanocitos neonatales humanos primarios, superando las limitaciones de modelos celulares no melanocíticos e inmortalizados comúnmente utilizados en la investigación sobre senescencia. Proporciona una plataforma estandarizada para examinar los mecanismos específicos de senescencia de melanocitos y caracterizar el fenotipo senescente con marcadores establecidos. En conjunto, este protocolo proporciona un modelo reproducible y fisiológicamente relevante para estudiar la senescencia inducida por estrés oxidativo en melanocitos.

Protocolo

Este protocolo fue optimizado para la investigación en melanocitos neonatales humanos primarios (HNM) para estudiar los mecanismos de la senescencia prematura inducida por estrés por la tBHP (Figura 1). Los melanocitos se derivaron del prepucio caucásico neonatal (fototipo de pigmentación ligera) y se obtuvieron de una fuente comercial. Según la documentación del proveedor, los tejidos humanos se recogen de donantes plenamente informados y han dado su consentimiento, en cumplimiento de los marcos éticos y legales establecidos, incluyendo la Declaración de Helsinki y las normativas aplicables de protección de datos. Las células se proporcionaron en una forma desidentificada. No se requirió ninguna aprobación ética adicional para su uso en este estudio. Todos los experimentos se realizaron utilizando la misma línea de melanocitos para asegurar la consistencia. Cabe señalar que, al utilizar diferentes líneas celulares primarias, las condiciones del cultivo, así como las concentraciones y los procedimientos de manipulación, pueden necesitar ajustes adicionales.

1. Preparativos

NOTA: Para iniciar el tratamiento con tBHP, los melanocitos deben descongelarse al menos tres días antes para permitir una recuperación y confluencia suficientes. La fase de tratamiento dura 4 días, designándose el día de siembra como Día 0. Los detalles de todos los materiales utilizados en este estudio se encuentran en la Tabla de Materiales.

1. Para preparar el medio de cultivo, combina el medio basal de melanocitos con los factores de crecimiento correspondientes. Llama la tapa de cada vial antes de añadir su contenido al medio para minimizar la contaminación. Añade 1% (v/v) de PenStrep al medio preparado y guárdalo a 4 °C hasta su uso.
2. Antes de la siembra, prepare la solución inhibidora de tripsina diluyendo el inhibidor de tripsina de soja en DPBS. Filtra la solución a través de una membrana de 0,22 μm, alicuota, y almacena a −20 °C. Una vez descongelado, puede usarse hasta 10 días.

2. Descongelación celular (Día -3)

PRECAUCIÓN: Todos los materiales en contacto con células humanas deben considerarse biológicamente contaminados y eliminarse conforme a las directrices institucionales de bioseguridad. Para evaluar la senescencia, utilizamos ensayos complementarios que evalúan la detención del crecimiento, la actividad de la SA-β-gal y marcadores moleculares adicionales. Aquí presentamos los protocolos para estos ensayos y los resultados esperados al trabajar con estos indicadores de senescencia.

1. Pipetear 20 mL de solución salina de fosfato tampón de Dulbecco (grado de cultivo celular) en un tubo cónico de 50 mL a temperatura ambiente. Mantén el vial que contiene las células sobre hielo hasta que se descongele.
2. Flamea la tapa antes de abrir el vial que contiene las celdas, desenrosca y vuelve a encender los laterales para evitar posibles contaminaciones.
3. Transfiere 500 μL de DPBS al vial que contiene las celdas. Descongela suavemente las células pipeteando arriba y abajo, y luego transfiere todo el contenido al tubo.
4. Centrifuga a 100 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El pellet resultante debe parecer beige a marrón (o más oscuro, dependiendo de la etnia del donante).
5. Prepara un matraz T75 con 14 mL de medio melanocito.
6. Llama una pipeta Pasteur de cristal (llama cada vez al manipular melanocitos), aspira cuidadosamente el DPBS y vuelve a suspender el pellet en 1 mL de medio.
7. Transfiere al frasco previamente preparado.
8. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂, y observar diariamente bajo el microscopio. Cambia de medio al menos cada 48 horas.
   NOTA: Cada vial criopreservado contiene aproximadamente 1 × 10⁶ melanocitos humanos primarios. Todos los experimentos se realizaron utilizando células en el pasaje 9.

3. Siembra de celdas (Día 0)

1. Asegúrate de la confluencia del 80–90% de las células en el día de la siembra.
2. Aspira el medio del matraz y lávate dos veces con DPBS.
3. Desprenden las células añadiendo 2 mL de solución de tripsina-EDTA e incuban durante 5 minutos a 37 °C, 5% de CO₂.
4. Golpea suavemente el matraz y obsérvala bajo el microscopio para confirmar el desprendimiento celular completo (incuba durante más tiempo si es necesario).
5. Detener la reacción añadiendo 1,5 veces el volumen de inhibidor de tripsina.
6. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 mL y diluye con DPBS hasta un volumen final de 10 mL.
7. Centrifuga la suspensión de celda a 100 × g durante 5 minutos.
8. Aspira el sobrenadante y vuelve a suspender hasta el volumen deseado en el medio.
9. Para placas tratadas con tBHP, sembra 6 ×^{10 5} células por plato de 10 cm. Para placas de control, semilla 4 × 10⁵ celdas por placa.
   NOTA: Para placas tratadas con tBHP, sembra una mayor densidad celular para asegurar que haya suficientes células disponibles para los experimentos, ya que su tasa de crecimiento disminuirá progresivamente durante el tratamiento. Si se siembran células en cobertores para experimentos de microscopía, los engobe deben recubrirse con 0,1 mg/mL de poli-D-lisina y secarse completamente antes de la siembra celular.
10. Incubar durante la noche a 37 °C con un 5% de CO₂. Cambia el medio cada 48 horas para las placas de control.

4. tratamiento con tBHP (Días 1–4)

1. Prepara una solución de trabajo de 10 mM a partir de material de tBHP (diluido en DPBS o medio).
   NOTA: el tBHP es fotosensible: cubre el recipiente al trabajar con él. La solución de trabajo puede usarse hasta una semana si se almacena correctamente a 4 °C. Calendario de tratamiento: El día 1 (el día después de la siembra) marca el inicio de la exposición a tBHP. Los melanocitos se tratan dos veces al día, con al menos un intervalo de 4 horas entre aplicaciones. Este régimen se repite desde el Día 1 hasta el Día 4, para un total de 4 días de tratamiento. La concentración seleccionada de tBHP y el esquema de tratamiento se adaptaron de trabajos previos en fibroblastos dérmicos, donde concentraciones más bajas fueron suficientes para inducir la senescencia. Sin embargo, en los melanocitos primarios se requerían concentraciones más altas para lograr una inducción robusta de senescencia, y se identificó como óptimo 100 μM tBHP basándose en experimentos de titulación que equilibraban la inducción por senescencia y la viabilidad celular
2. Añadir 100 μM tBHP a las células durante 1 h por tratamiento (Para iniciar, añadir el volumen adecuado de solución de trabajo, asegurando de pipetear en el medio líquido).
3. Mueve la placa de un lado a otro y de lado a lado para distribuir el tBHP de forma uniforme por todo el medio.
   NOTA: Evita los movimientos circulares, ya que esto puede causar una distribución desigual de la tBHP a través del medio.
4. Incuba exactamente durante 1 hora a 37 °C con un 5% de CO₂.
5. Para terminar el tratamiento con tBHP, aspira el medio.
6. Lava las placas dos veces con DPBS precalentado (37 °C).
7. Añade el volumen adecuado de medio fresco a los platos.
8. Permite que las células se recuperen en la incubadora durante al menos 4 horas antes de iniciar el tratamiento posterior.
9. Repite este procedimiento el mismo día para el segundo tratamiento y continúa los días restantes. Mantener las células en cultivo tras finalizar el tratamiento hasta el día 9 para evaluar los marcadores de senescencia.
10. Vigila las placas de control y el paso si es confluyente.

5. Análisis de la curva de crecimiento

1. Contar las células y controles tratados con tBHP siguiendo el protocolo de siembra.
2. Resembra la misma densidad inicial o todas las celdas en caso de que cuentes menos de las 6 × 10 de⁵ celdas para placas tBHP.
3. Realiza recuentos celulares en los días 4, 9 y 15 de cultivo.
4. Calcula la curva de crecimiento usando la siguiente fórmula:
   lg (conteo) - log (semilla) / 0,301 + cPDL
   Conteo: número de celdas obtenidas al final del pasaje.
   semilla: número de células inicialmente placadas al inicio del pasaje.
   cPDL: nivel acumulado de duplicación poblacional que se mantuvo de pasajes anteriores.

6. Actividad SA-β-galactosidasa

1. En el día 9, lava las células dos veces en PBS antes de fijar con 2% de formaldehído y 0,4% de glutaraldehído.
2. Lava las células dos veces con PBS.
3. Incubar células fijas con una solución de tinción con un pH de 6,0 (150 mM de NaCl, 2 mM de MgCl, 5 mM de ferricianuro de potasio, 5 mM de ferrocianuro de potasio, 40 mM de ácido cítrico, 12 mM de fosfato de sodio y 1 mg/mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-gal).
4. Tras 18 horas de incubación a 37 °C en ausencia de CO₂, lavar las células dos veces con PBS.
5. Imagen usando microscopía óptica.
6. Cuantifica el número de células teñidas de azul bajo el microscopio contando el número de células azules y dividiéndolas por el número total de células en un campo. Expresa los resultados como porcentaje de células positivas.

7. Tinción por inmunofluorescencia

PRECAUCIÓN: Los residuos que contienen formaldehído, glutaraldehído y paraformaldehído deben manipularse como residuos químicos peligrosos y eliminarse conforme a las normativas de seguridad institucionales.

1. Utiliza células cultivadas en fundas cubiertas previamente recubiertas con 0,1 mg/mL de poli-D-lisina.
2. En el día 9, lava las células dos veces y luego fija con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos.
3. Lava las células dos veces con PBS.
4. Permeabiliza usando 0,3% de Triton-X y 0,1% de citrato de sodio en PBS.
5. Bloquea con un 1% de BSA en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente.
6. Incubar células con anticuerpos primarios γH2AX para detectar la respuesta de daño permanente al ADN durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada.
7. Al día siguiente, lávate dos veces con PBS.
8. Aplica un anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente.
9. Tinte los núcleos con DAPI si lo deseas.
10. Lava dos veces con PBS-T, seguida de dos lavados con PBS y dos veces con ddH₂O.
11. Monta las cubiertas y déjalas secar completamente antes de hacer la imagen.
12. Analizar la intensidad media de fluorescencia y/o los focos γH2AX usando el software ImageJ.

8. Aislamiento de ARN y RT-qPCR

PRECAUCIÓN: El β-mercaptoetanol es altamente tóxico y debe manipularse en una campana extractora. Los residuos que contengan β-mercaptoetanol deben eliminarse como residuos químicos peligrosos.

1. En el día 9, tripsiniza células usando 2 mL de tripsina-EDTA.
2. Detén la reacción aplicando 1,5 veces la cantidad de inhibidor de tripsina.
3. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 mL y centrifuga a 100 x g durante 5 minutos.
4. Aspira cuidadosamente el sobrenadante.
5. Pellets de células de lisis resuspendiéndolas en un tampón RLT de 350 μL que contiene un 1% β-mercaptoetanol.
6. Aísla el ARN usando un kit de purificación de ARN en columna.
7. Determinar la concentración de ARN usando un espectrofotómetro (260 nm).
8. Para la síntesis de ADNc, se utiliza 1 μg de ARN para la transcripción inversa en un volumen total de reacción de 10 μL usando una mezcla estándar de transcripción inversa (incluyendo tampón RT, dNTPs, cebadores aleatorios, transcriptasa inversa e inhibidor de RNasa) seguida de condiciones de ciclo térmico según las instrucciones del fabricante.
9. Realizar RT-qPCR para factores SASP
   NOTA: Los factores SASP seleccionados (IL-8, IL-6 y MMP-1) representan componentes bien establecidos del fenotipo secretor asociado a la senescencia y fueron elegidos en función de su relevancia para la biología cutánea, incluyendo la señalización inflamatoria y la remodelación de la matriz extracelular
   IL-6 (Fwd: 5' AAGCCAGAGCTGTGTGCAGATGAGTA 3' Rev: 5' TGTCCTGCAGCCACTGGTTC 3')
   IL-8 (Fwd: 5' ACCGGAAGGAACCATCCAC 3' Rev: 5' AAACTGCACCTTCACAGAG 3')
   MMP-1 (Frente: 5' CATCGTGTTGCAGCTCATGA 3' Rev: 5' ATGGGCTGGACAGGATTTTG 3')
   GAPDH (Fwd: 5' GAGTCAACGGATTTGGTCGT 3' Rev: 5' GATCTCGCTCCTGGAAGATG 3')
10. Analizar la expresión relativa de ARNm utilizando el método ΔΔCt con normalización al gen de mantenimiento GAPDH.

9. Aislamiento de proteínas y Western blot

1. En el día 9, recoge lisados de proteínas.
2. Aspira el medio y lava las placas dos veces usando DPBS en frío.
3. Las células de lisis mecánicamente usando un raspador celular tras añadir 150 μL de tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1% NP-40, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% SDS y 2 mM EDTA) suplementadas con inhibidores de proteasa y transfiriéndolas a un tubo de 1,5 mL.
4. Realiza tres ciclos de congelación y descongelación seguidos de una incubación de 30 minutos sobre hielo.
5. Centrifugar a 9600 x g a 4 °C durante 10 minutos.
6. Determina la concentración de proteína del sobrenadante utilizando el ensayo BCA.
7. Separar cantidades iguales (20 μg) de proteína en geles de poliacrilamida y transfierirlas a membranas PVDF activadas.
8. Bloquear membranas en leche desnatada al 5% en TBS-T.
9. Incubar con anticuerpos primarios pRB y LaminB1 durante la noche a 4 °C.
10. Al día siguiente, lava las membranas 3 veces con TBS-T.
11. Incubar en anticuerpos secundarios apropiados conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente.
12. Detectar proteínas mediante quimioluminiscencia y realizar análisis densitométricos.

Resultados

El tratamiento con tBHP induce la detención del crecimiento en melanocitos neonatales humanos.
El tratamiento con tBHP inhibe la proliferación de melanocitos en comparación con los controles no tratados (n = 3) (Figura 2A). Al día 9, las células tratadas alcanzan solo 1,4 cPDL, mientras que los controles alcanzan 3,1 cPDL. Esta divergencia aumenta con el tiempo, con los melanocitos tratados acercándose a un estancamiento de 1,9 cPDL al dí...

Discusión

Este protocolo establece un enfoque estandarizado para inducir la senescencia prematura inducida por estrés (SIPS) en melanocitos neonatales humanos utilizando tBHP, ofreciendo un modelo robusto para estudiar la senescencia específicamente en este tipo celular. Cambios constantes en la proliferación, morfología, actividad SA-β-gal, marcadores de daño en el ADN y componentes SASP apoyan el fenotipo inducido. Al centrarse en los melanocitos, células que siguen siendo poco estudiadas en la ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.22 µm membrane filter	Merck	SLGVR33RS
1 M citric acid	Merck	K91567844	preparer en aq. dest.
1 M MgCl2	Merck	A649033	preparer en aq. dest.
1 M Na2HPO4	Merck	K56036736	preparer en aq. dest.
10 M NaOH	Lab Honeywell	30620	preparer en aq. dest.
37% formaldehyde	Sigma	252549
4% paraformaldehyde	CarlRoth	0335.3
5 M Sodium Chloride	Sigma	S3014	preparer en aq. dest.
50% glutaraldehyde	Sigma	G6403
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)	Sigma	B9146
Alexa Fluor-conjugated secondary antibody 2 mg/mL	Invitrogen	A11008
BSA (bovine serum albumin)	Sigma	A7030
Chemiluminescent substrate	Sigma	WBKLS0500
Costar CellLifter	Corning	3008
Coverslips for cell culture/microscopy	Epredia	CB00200RA120MNZ0
DermaLife Basal Medium	CellSystems	LM-0004
DermaLife M Melanocyte Kit	CellSystems	LS-1041
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Human neonatal melanocytes	CellSystems	FC-0023
LaminB1 antibody (rabbit)	Abcam	AB16048	Dilución 1:1000 en 5% BSA
Mounting medium containing DAPI	Abcam	AB104139
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P4333
Polyacrylamide gradient gels	Bio-Rad	456-8095
Poly-D-Lysine, 0.1 mg/mL	Gibco	A38904-01
Potassium ferricyanide	Sigma	P8131
Potassium ferrocyanide	Sigma	P-9387
pRB antibody (rabbit)	CellSignalling	93085	Dilución 1:1000 en 5% BSA
Protease inhibitor cocktail	self prepared	N/A	500 mM NaF; 2 µg/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM activated Na-Orthovanadate
RIPA buffer	self prepared	N/A	contiene: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholate; 0.1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA
RLT buffer	Qiagen	1015762	Incluido en RNeasy Mini Kit
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106
Skim milk powder (for 5% milk in TBS-T)	Sigma	70166
Sodium citrate (for 0.1% solution)	Sigma	S4641
Soybean trypsin inhibitor, 0.5 mg/mL	Thermofisher	17075-029
tert-Butyl hydroperoxide (tBHP)	Sigma	458139
Triton X-100 (for 0.3% solution)	Sigma	T9284
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-mercaptoethanol	CarlRoth	4227.3
γH2AX antibody (rabbit)	CellSignalling	2577S	Dilución 1:200