Artículo de método

Manipulación física para generar embriones de Xenopus Mini

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DOI:

10.3791/70602

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10 de abril de 2026

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1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

En este artículo

Resumen

Describimos un método de constricción física para producir mini embriones a partir de embriones de Xenopus laevis de 1 célula.

Resumen

Una característica definitoria de la embriogénesis temprana es la rápida y exponencial disminución del tamaño celular individual mientras el volumen total del embrión permanece constante. La proporción nucleocitoplasmática (N:C) desempeña un papel fundamental en la regulación de las actividades celulares y moleculares esenciales para la embriogénesis temprana. Por tanto, la manipulación física del tamaño del embrión representa una forma importante de investigar estos mecanismos de desarrollo. El gran tamaño (~ 1,2 mm de diámetro) y la alta plasticidad del desarrollo de los embriones tempranos de Xenopus laevis los convierten en un modelo ideal para la disección física y la manipulación con el fin de examinar los mecanismos reguladores del desarrollo. Aquí describimos un enfoque para generar mini embriones con volumen citoplasmático alterado y relación N:C mediante la constrición de embriones de 1-célula de Xenopus laevis con nudos de pelo. Se ha demostrado que los mini embriones resultantes inician una activación temprana del genoma cigótico (ZGA) inducida directamente por la reducción del tamaño celular y el crecimiento de la proporción N:C. Estos mini embriones, que pueden generalizarse a otros sistemas embrionarios, proporcionan por tanto una herramienta única y poderosa para diseccionar los mecanismos mediados por el tamaño del desarrollo embrionario temprano.

Introducción

Una de las características más llamativas de la embriogénesis temprana es la reducción exponencial del tamaño celular individual dentro de un embrión que mantiene un volumen constante. La síntesis rápida de ADN y la reducción del tamaño celular conducen a un aumento en la proporción nucleocitoplasmática (relación N:C), que desempeña un papel importante en la regulación de varias actividades distintivas de la transición de la blástula media (MBT) en sistemas embrionarios modelo, incluyendo la transcripción génica cigótica, la elongación del ciclo celular y la motilidadcelular 1,2,3,4 . Las manipulaciones de la relación N:C mediante la modificación de la ploidía del ADN respaldan su importancia funcional en la embriogénesis temprana en varios sistemasmodelo 3,4,5,6.

La manipulación física del tamaño del embrión representa una técnica importante para estudiar los mecanismos reguladores en el desarrollo embrionario temprano7. La extracción citoplasmática por aspiración, que altera la proporción N:C en embriones de ratón temprano, induce compactaciónprematura 8. Además, reducir el tamaño del embrión de pez cebra mediante el corte reveló un nuevo mecanismo basado en gradientes de escaladode somita 9. Además, la reducción del volumen citoplasmático en embriones de Xenopus reveló dinámica del ciclo celular dependiente de la relación N:C 10. Es importante destacar que, al generar mini embriones de Xenopus mediante la reducción del tamaño celular y el marcado de transcritos nacientes con 5-etinil-uridina (5-EU) en células individuales, demostramos que reducir el tamaño celular induce la activación del genoma cigótico (ZGA) de manera dependientede la dosis 11. Estos resultados respaldan el papel crucial del tamaño celular en la embriogénesis temprana.

Aquí describimos un procedimiento detallado para generar mini embriones de Xenopus laevis mediante manipulación física utilizando nudos de pelo (Figura 1)10,11. Este enfoque se basa en el uso fundamental de Newport y Kirschner (1982) de la constricción de bucles capilares en embrionestempranos de Xenopus 1, proporcionando un protocolo claro y fiable para generar mini embriones como herramientas experimentales. Además, este método es aplicable a otros sistemasembrionarios 7, lo que facilitaría el descubrimiento de nuevos mecanismos de embriogénesis temprana.

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Protocolo

El trabajo con animales aquí descrito ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Carolina del Sur.

1. Preparación de materiales

  1. Preparación de soluciones
    1. Prepara 20× MMR mezclando 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mMMgCl 2 y 40 mMCaCl 2. Ajusta el pH a 7,8 con NaOH. Autoclave y guarda a temperatura ambiente.
    2. Prepara una solución de medio de gradiente de densidad (wt/vol) al 3% mezclando 1,5 g de medio de gradiente de densidad en 50 mL de MMR de 0,5×. Remueve suavemente con una barra magnética de agitación hasta que el polímero se disuelva. Mantenlo a 4 °C hasta el uso.
    3. Preparar gel de agarosa al 1% en una placa de Petri de 60 mm mezclando 0,5 g de agarosa en 50 mL de 0,1× MMR. Calienta con un microondas para disolver la agarosa, luego añade 5 mL de agarosa para cubrir la base de una placa de Petri de 60 mm en una capa fina.
  2. Preparación de nudos capilares para embriones que constriñen
    1. Coge unos cabellos finos y córtalos en trozos de ~5 cm.
    2. Usa una pinza para insertar un extremo del pelo en una punta P10 de unos ~1 cm de profundidad.
    3. Pon cera en una cuchara y caliéntala para derretir la cera. Mete rápidamente la punta P10 unida al pelo en la cera y déjala secar durante 1 minuto. Asegúrate de que el pelo esté fijado al final de la punta P10.
    4. Usa una pinza para hacer cuidadosamente un nudo superior del pelo. Ajusta el tamaño del lazo a ~1,5 mm. Recorta el voladizo si es necesario. Deja el nudo a un lado para usarlo en el futuro.
    5. Repite los pasos anteriores para hacer más nudos de pelo según sea necesario.

2. Creación de mini embriones de Xenopus

  1. Para obtener embriones de Xenopus , se sigue un protocolo estándar para realizar la fertilización in vitro (FIV) (por ejemplo, véase Sive et al., 2007)12. El embrión debería estar en 0,1× MMR, listo para su uso.
  2. Para visualizar la ZGA en células individuales de embriones tempranos y estudiar sus mecanismos reguladores, microinyecta los embriones en estadio 1 con 5-etinil-uridina (5-EU) para marcar metabólicamente los transcritosincipientes 11,13 antes de proceder con los siguientes procedimientos.
  3. Cuando los embriones estén a ~1 hora después de la fertilización (hpf), se utiliza una pipeta de transferencia plástica para transferir ~20 embriones en una placa de Petri de 60 mm (cubierta con gel de agarosa al 1%) que contenga ~15 mL de medio gradiente de densidad al 3%/0,5× MMR.
  4. Usa una pinza en una mano para girar un embrión unos ~45–60 grados bajo un estereomicroscopio para acceder al polo vegetal (el hemisferio pálido). Sujeta el embrión inclinado con las pinzas y usa una aguja de 30 g con la otra mano para pinchar cuidadosamente el palo vegetal. Libera algo de citoplasma presionando suavemente el embrión.
  5. Cubre cuidadosamente un nudo de pelo montado en una punta P10 sobre un embrión para que el polo animal (el hemisferio oscuro) quede dentro del nudo de pelo. Ajusta la posición del nudo según el tamaño deseado del mini embrión.
  6. Sujeta la pipeta P10 con una mano y usa una pinza con la otra mano para tirar de los dos extremos superiores del nudo en direcciones opuestas. El nudo de pelo se apreta alrededor del embrión, entre el polo animal (intacto) y el polo vegetal (con el citoplasma liberado). Corta el nudo en el lugar donde se une a la punta P10.
  7. Repite los pasos 2.4–2.6 anteriores para obtener la cantidad deseada de mini embriones.
  8. Dejemos que los embriones permanezcan en un medio con gradiente de densidad del 3%/MMR de 0,5× durante ~1–2 horas. Después, retira el medio con una pipeta P1000 sin alterar los embriones y repone con 15 mL de 0,1× MMR.
  9. Deja que los embriones se desarrollen en las etapas deseadas y luego usa pinzas para deshacer cuidadosamente los nudos de los mini embriones.
  10. Recoge los embriones para el análisis deseado, como visualizar el ZGA en célulasindividuales 11,13.

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Resultados

Los embriones de Xenopus laevis en la etapa 1-celular estaban constrictos con los nudos de cabello como se ha descrito anteriormente. Los embriones control y mini en ~Estadio 9 (8,5 hpf a 23 °C) fueron fotografiados bajo un estereomicroscopio. Como se muestra en la Figura 2, el volumen de algunos mini embriones es ~1/3 del de los embriones de control. Este resultado sugiere que los primeros embriones de Xenopus pueden manipularse para gener...

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Discusión

Aquí describimos un método para generar mini-embriones en Xenopus mediante la constreción física de embriones en estadio 1 con nudos capilares. Este enfoque proporciona evidencia directa de que reducir el tamaño celular induce ZGA en un embriónmodelo 11.

Varios aspectos de este protocolo son fundamentales para generar con éxito mini-embriones. Para hacer nudos en el cabello, es importante usar cabello fino y duradero, preferibl...

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Divulgaciones

El autor declara no tener intereses en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos al laboratorio Matthew Good de la Universidad de Pensilvania por proporcionar su formación. Este trabajo contó con el apoyo parcial del Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano (R03HD105802).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguja de 30 GBD Medicina305128Para perforar embriones
Placas de Petri desechables de 60 mmVWR25384-092Para incubar embriones
Estereoscópicos Zoom ACCU-SCOPE 3075VWR470351-130Para visualizar embriones
AgaroseSigma-AldrichA-9414Para recubrir placas de Petri
Pinza Dumont, Estilo 5Ciencias de la Microscopía Electrónica72701-DPara ajustar y mantener embriones
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Para incubar embriones
Punta de pipeta TipOne, 10 y micro; LUSA Scientific1111-3700Para montar los nudos para el pelo
Bloque de cera, negroCarolina Biological Supply Co.974228Para montar los nudos para el pelo

Referencias

  1. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  2. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  3. Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
  4. Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
  5. Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
  6. Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
  9. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
  10. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  11. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
  13. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  14. Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).

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