Cáncer de mama intracraneal Modelo de metástasis cerebrales en ratones para la caracterización de células inmunitarias y estromales en meninges y bulbo olfatorio

Resumen

El protocolo establece las metástasis cerebrales del cáncer de mama mediante inoculación intracraneal y caracteriza por citometría de flujo subconjuntos linfáticos e inmunitarios clave que regulan la inmunidad cerebral. Estos análisis proporcionan información sobre la dinámica inmunitaria y de las células estromales que moldean el microambiente cerebral, informando el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Resumen

El sistema nervioso central (SNC) está rodeado de interfaces inmunitarias especializadas, incluyendo las meninges y el bulbo olfativo, que pueden servir tanto como vías permisivas para la colonización metastásica como como puntos de entrada para respuestas inmunitarias antitumorales. Comprender cómo evolucionan las dinámicas celulares inmunitarias dentro de estas estructuras durante la progresión metastásica es esencial para identificar mecanismos que apoyan o restringen el crecimiento tumoral en el cerebro. Este protocolo detalla el establecimiento de un modelo murino de metástasis cerebrales con cáncer de mama (BCBM) mediante la inyección intracraneal de células de cáncer de mama E0771 en ratones C57BL/6. Tras el desarrollo tumoral, las meninges y el bulbo olfativo se disecan cuidadosamente, se digieren enzimáticamente y se procesan en suspensiones unicelulares. Estas poblaciones se analizan luego mediante citometría de flujo espectral multiparamétrico para caracterizar de forma exhaustiva subconjuntos de células linfoides, mieloides y estromales dentro de nichos inmunitarios asociados al SNC. Este flujo de trabajo permite análisis comparativos entre controles con y no tumores, identificando alteraciones en las interfaces inmunitarias del SNC que pueden estar detrás de la evasión inmune tumoral y representar posibles objetivos terapéuticos. En general, el protocolo proporciona un enfoque reproducible para estudiar BCBM e interrogar la regulación inmunitaria en las interfaces entre el sistema inmunitario del SNC y el periférico. Puede adaptarse para líneas celulares cancerígenas adicionales, inmunoterapias o modelos genéticos de ratón para investigar los mecanismos de resistencia inmunitaria y la respuesta terapéutica dentro del microambiente cerebral.

Introducción

Las metástasis cerebrales son los tumores malignos más comunes que afectan al sistema nervioso central (SNC), y ocurren con más frecuencia que los tumores cerebrales primarios. El cáncer de pulmón, el cáncer de mama y el melanoma son los cánceres principales que más a menudo metastatizan al cerebro¹. Entre ellas, las metástasis cerebrales con cáncer de mama (BCBM) representan un desafío clínico importante, afectando entre el 10% y el 30% de las pacientes con enfermedad metastásica y mostrando una incidencia creciente debido a terapias sistémicas mejoradas y avances en^{neuroimagen 2}. El pronóstico para los pacientes con BCBM sigue siendo deficiente, ya que los tratamientos disponibles —incluyendo cirugía, radioterapia y quimioterapia— son en gran parte paliativos, y los síntomas neurológicos afectan gravemente a la calidad^{de vida 3}. Aunque se están explorando terapias dirigidas e inmunoterapias como estrategias complementarias, el beneficio clínico de la inmunoterapia en las metástasis cerebrales sigue siendo limitado ^4,5,6.

Trabajos recientes han refinado nuestra comprensión de la inmunidad cerebral y han renovado el interés en las vías linfáticas funcionales asociadas al SNC, incluyendo los vasos linfáticos en las^{meninges 7} y la mucosa^{nasal 8}. Estas estructuras forman una red linfática continua que rodea el cerebro y se extiende junto al bulbo olfativo y la placa cribiforme, conectándose finalmente con los ganglios linfáticos cervicales. Este sistema desempeña un papel clave en la homeostasis de fluidos, la vigilancia inmunitaria y el tráfico celular inmunitario entre el SNC y los órganos linfoides^{periféricos.} A medida que crece el interés en los enfoques inmunoterapéuticos para tumores cerebrales y metástasis, estas interfaces linfático-inmunes están emergiendo como vías prometedoras, aunque aún poco estudiadas, a través de las cuales la inmunidad sistémica puede comunicarse con lesiones intracraneales. Además, los mecanismos que regulan el reclutamiento de células inmunitarias en el microambiente tumoral cerebral y cómo estas células interactúan en este entorno único siguen siendo poco comprendidos. En conjunto, estas carencias subrayan la necesidad de modelos y procedimientos preclínicos que permitan un análisis exhaustivo de las interacciones tumor-inmune y apoyen el desarrollo de estrategias para mejorar la inmunidad antitumoral frente a las metástasis cerebrales.

Aquí describimos un protocolo que combina la generación de un modelo ratón BCBM reproducible e inmunocompetente mediante inoculación intracraneal estereotáxica de células E0771 con el aislamiento y disociación de las meninges y el bulbo olfativo para la inmunofenotipación mediante citometría de flujo espectral. Este enfoque permite la modelización controlada de BCBM para evaluar la seguridad y eficacia de las intervenciones terapéuticas y permite una caracterización profunda de poblaciones inmunes y estromales en la interfaz cerebro-linfático-inmune inmune, proporcionando información sobre los actores celulares que moldean el microambiente tumoral cerebral e influyen en las respuestas terapéuticas.

Los modelos animales siguen siendo indispensables para estudiar las metástasis cerebrales, ya que muchos aspectos críticos de la progresión metastásica no pueden replicarse in vitro. Se han desarrollado varios modelos ratones in vivo para generar metástasis cerebrales, cada uno con ventajas y limitaciones específicas¹⁰. Los modelos de metástasis espontástica, incluyendo implantación ortotópica o modelos murinos genéticamente modificados, imitan más de cerca la progresión clínica de la enfermedad pero rara vez generan lesiones intracraneales, requieren largos plazos experimentales y a menudo generan una alta variabilidad debido a la enfermedad extracraneal extendida. Los enfoques sistémicos, incluyendo inyecciones intracardíacas, intracarótidas o en las venas colares, introducen células tumorales en la circulación y imitan mejor la diseminación hematógena, la extravasación de barreras hematoencefálica y la colonización. Sin embargo, estos modelos no capturan los primeros pasos de la invasión tumoral primaria y producen frecuentemente metástasis extracraneales extensas y variables, especialmente en los pulmones. Entre los modelos sistémicos, la inyección intracarótida tiene la menor variabilidad, pero requiere conocimientos quirúrgicos avanzados. Alternativamente, la inyección intracraneal ofrece varias ventajas, incluyendo un control preciso de la localización tumoral, desarrollo tumoral rápido y reproducible, y una menor variabilidad entre experimentos. Este enfoque también puede complementarse con implantación tumoral primaria ortotópica seguida de una resección quirúrgica para imitar con mayor precisión el curso metastásico. Aunque la inyección intracraneal no recapitula toda la cascada metastásica y no es adecuada para estudiar la invasión y diseminación temprana, proporciona un modelo sólido para evaluar la eficacia terapéutica frente a lesiones establecidas e investigar las interacciones dentro del microambiente cerebral. Una limitación conocida es que la propia inyección puede inducir neuroinflamación local, lo que puede influir en las lecturas inmunes, que pueden evaluarse comparando perfiles inmunes en ratones inyectados y no inyectados.

La caracterización inmunitaria de las meninges y el bulbo olfativo sigue siendo un área de investigación relativamente nueva y poco explorada. La mayoría de los estudios se basan en muestras de ganglios linfáticos de todo el cerebro o^{cervical 11}, que no logran captar la composición celular distintiva ni las funciones inmunitarias especializadas de estos tejidos asociados a la linfática. Recuperar ambas estructuras ofrece una visión más amplia e informativa de la inmunidad cerebral. Cuando se combina con citometría de flujo espectral multiparamétrico, este flujo de trabajo apoya el perfilado de alto rendimiento de poblaciones inmunitarias abundantes y raras implicadas en la comunicación inmune periférica-SNC. Esto incluye la cuantificación de marcadores superficiales e intracelulares para identificar subconjuntos celulares, evaluar estados de activación y evaluar los cambios inducidos por el tratamiento. Otras metodologías para el análisis inmunitario del SNC no cubiertas por este protocolo incluyen inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF), que preservan la distribución espacial de las células inmunitarias pero están limitadas por la multiplexación de bajos marcadores, la cuantificación subjetiva y la subrepresentación de los raros tipos^{celulares 12}. Más recientemente, la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) ha ampliado la capacidad de perfilar poblaciones inmunitarias del SNC al permitir el descubrimiento de estados celulares y programas transcripcionales a alta resolución. A pesar de ofrecer una potente visión transcriptómica, el scRNA-seq está limitado por costes, artefactos de disociación, pérdida de transcritos y pérdida de resolución a nivel^{de proteína 13,14}. La citometría de flujo, aunque carece de análisis espacial y es sensible a los efectos relacionados con la disociación, ofrece una resolución fenotípica superior mediante un panel multiparamétrico avanzado y proporciona un robusto perfil inmunitario cuantitativo.

En conjunto, las metodologías descritas aquí proporcionan una plataforma flexible y potente para modelar la BCBM e analizar la dinámica inmunitaria en las interfaces linfáticas del SNC, apoyando el desarrollo preclínico de terapias dirigidas tanto al microambiente tumoral cerebral como a sus vías reguladoras inmunitarias asociadas.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron conforme a las directrices de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Lisboa. Los protocolos fueron revisados y aprobados por la autoridad competente portuguesa para la protección animal, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (Referencia 0421/000/000/2021).

1. Preparación de células E0771 para implantación in vivo

1. En un capuchón estéril, cultivar células E0771 en un matraz T75 utilizando el Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (v/v) y 1% (v/v) de penicilina y estreptomicina (PEST).
   1. Asegúrese de que las células estén autenticadas mediante perfilado STR al recibirlas por parte del proveedor y confirmadas como libres de micoplasma mediante pruebas rutinarias. Cultivar células tumorales para al menos 2–8 conductos tras la descongelación antes de la implantación cerebral.
2. El día de la implantación, asegúrate de que las células estén sanas y con un 80-90% de confluencia. Retirar el medio y lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Añade tripsina al matraz e incuba durante 5 minutos a 37 °C. Luego, añade tres veces el volumen del medio suplementado (DMEM con 10% v/v FBS y 1% v/v PEST) para neutralizar la tripsina y disociar las células.
4. Transfiere las células a un tubo y centrifuga a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Retira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en PBS para contar células.
5. Centrifugar de nuevo (300 x g durante 5 minutos), descartar el sobrenadante y volver a suspender las células en PBS a una concentración de 1 x 10 5 células de E0771 en 2 μL por animal. Mantén la suspensión celular en hielo hasta la inoculación tumoral. Prepara la suspensión celular inmediatamente antes de la inyección.

2. Inoculación intracraneal de tumores mediante un aparato estereotáxico

1. Obtén hembras de ratón C57BL/6 (de 6 a 8 semanas) y acostúmalas a la instalación animal durante al menos 7 días antes de la cirugía. Mantén los ratones domésticos bajo condiciones controladas con un ciclo de 12 horas luz/oscuridad y proporciona comida y agua ad libitum.
   NOTA: Se recomienda un mínimo de cinco animales por grupo experimental para garantizar suficiente potencia estadística para un perfil inmunitario comparativo significativo entre condiciones portadoras de tumores y de control.
2. Prepara el campo quirúrgico y todos los materiales necesarios antes de comenzar el procedimiento:
   1. Instrumentos quirúrgicos: bisturí, tijeras, pinzas, portaagujas, alambre de sutura.
   2. Equipos y otros: instrumento estereotáxico, jeringuilla de cristal, taladro, afeitadora, hisopos de algodón, almohadilla térmica.
   3. Anestesia: Prepara ketamina-xilazina (K-X) (25 mg/mL y 2 mg/mL, respectivamente) en PBS en un tubo de 15 mL.
   4. Analgesia: Preparar buprenorfina a 15 μg/mL en PBS en un tubo de 15 mL.
   5. Otras soluciones: povidona-yodo, peróxido de hidrógeno al 3% v/v (H_{2O 2}), pomada oftálmica.
      PRECAUCIÓN:_H2O2 es perjudicial si se ingiere y puede causar irritación en la piel.
3. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de K-X (100 μL por 10 g de peso corporal). Confirma la anestesia adecuada sin respuesta al pinchazo en el dedo del pie.
4. Aplica pomada oftálmica en ambos ojos para evitar la deshidratación y coloca al ratón sobre una almohadilla térmica durante todo el procedimiento.
5. Afeita el cuero cabelludo y desinfecta la zona quirúrgica con povidona-yodo. Haz una incisión longitudinal de 1 cm a lo largo de la línea media para exponer el cráneo.
6. Limpia el cráneo expuesto con_H2O2 usando un hisopo de algodón en un movimiento circular para visualizar el bregma. Si hay exceso de espuma, elimínalo con un hisopo seco.
7. Coloca el ratón en el marco estereotáxico. Establece el bregma como punto de referencia (0,0) y mide 2,5 mm lateral y 0,5 mm anterior al bregma. Marca el lugar de la inyección.
8. Retira el ratón y haz un pequeño agujero en las coordenadas marcadas. Evita taladrar demasiado profundo para evitar daños cerebrales.
9. Monta la jeringuilla en el inyector. Resuspende las células y carga la jeringuilla de vidrio con el volumen suficiente para dos inyecciones (4–5 μL). No prepare más de dos inyecciones a la vez para evitar que se asienten las células.
10. Recoloca el ratón en la estereotaxia, alinea la aguja con el agujero y bájala lentamente hasta una profundidad de 3,0 mm dentro del parénquima cerebral. Inyecta células (o PBS estéril para control simulado) a 1 μL/min.
11. Después de la inyección, mantén la aguja en su sitio al menos 1 minuto, retrae 1,5 mm, mantén la aguja un minuto más y luego retira completamente. Esto minimiza el reflujo y asegura una correcta deposición celular.
12. Cierra la incisión con suturas y aplica povidona-yodo. Administrar buprenorfina (100 μL) por vía subcutánea.
13. Mantén el ratón en una almohadilla térmica hasta que te recuperes completamente de la anestesia. Vuelve a colocar al ratón en una jaula limpia y controla diariamente si hay malestar, signos neurológicos o infecciones.

3. Perfusión intracardíaca de ratón

1. Anestesiar ratones mediante inyección de K-X (100 μL por 10 g de peso corporal). Confirma la anestesia adecuada sin respuesta al pinchazo en el dedo del pie.
2. Con tijeras, realiza una incisión de 5–6 cm a través de la pared abdominal y dos incisiones a través de la caja torácica hasta la clavícula. Ten cuidado de no cortar ningún vaso sanguíneo importante.
3. Con el corazón expuesto, corta la aurícula derecha para permitir la circulación sanguínea. Inyecta PBS helado en el ventrículo izquierdo con una jeringuilla de 20 mL equipada con una aguja de 25G × 1 pulgada.
4. Detener la perfusión cuando el líquido que sale esté libre de sangre. En ratones adultos, se necesita alrededor de 20 mL de PBS.

4. Aislamiento de las meninges del ratón y del bulbo olfativo

1. Tras la perfusión intracardíaca, decapita al ratón con tijeras quirúrgicas. Elimina completamente el cuero cabelludo para exponer el cráneo.
2. Con tijeras, corta el cráneo en el plano transversal desde la región posterior hacia los ojos, teniendo cuidado de no dañar el tejido cerebral subyacente. Extrae suavemente el cerebro con pinzas finas, evitando el contacto o raspado de la superficie interna del cráneo.
3. Tras la extirpación cerebral, las meninges durales permanecen adheridas a la superficie interna del cráneo. Sumerge el cráneo en PBS helado durante al menos 5 minutos para facilitar la separación intacta de las meninges.
4. Disecciona el bulbo olfativo de la región anterior del cerebro y transfiere a PBS helado para su almacenamiento temporal hasta el procesamiento.
5. Con pinzas de punta fina, desprende suavemente las meninges de la superficie interna del cráneo levantando y pelando con cuidado la fina capa de tejido. Transfiere las meninges a PBS helado hasta un procesamiento adicional. Evita desgarrar el tejido para asegurar una recuperación óptima de las células aguas abajo.

5. Disociación de tejidos en células individuales

1. Meninges
   1. Transfiere las meninges a 3 mL de RPMI 1640 que contengan 0,05% de colagénasa II y DNasa I. Incubar durante 20 minutos a 37 °C, agitando suavemente cada 10 minutos. La digestión excesiva reduce la viabilidad celular y debe evitarse.
   2. Pasa tejido digerido a través de un colador de células de 40 μm a un tubo de 50 mL. Disocia mecánicamente el tejido restante presionando suavemente un émbolo de jeringuilla contra el colador y lava con 5 mL de PBS.
   3. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C. Descarta el sobrenadante y resuspende el pellet en PBS de 3 mL.
   4. Repite la centrifugación. Descartar el sobrenadante, volver a suspender el pellet final en el volumen restante y transfiérrelo a una placa de fondo en U de 96 pozos.
2. Bulbo olfativo
   1. Retira el PBS y disocia mecánicamente el tejido usando un émbolo de jeringuilla. Añade 3 mL de solución digestiva que contiene 0,02% de colagenosa II en la solución salina balanceada (HBSS) de Hanks. Incuba durante 20 minutos a 37 °C, agitando suavemente cada 10 minutos.
   2. Pasa la suspensión de la celda a través de un colador de 70 μm a un tubo de 50 mL y lava con PBS de 10 mL.
   3. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet final en el volumen restante. Transfiere a una placa de 96 pozos en U-bottom.
3. Guarda las placas a 4 °C hasta que se teñan.
   NOTA: Realizar tinciones el mismo día para asegurar la viabilidad óptima de las células.

6. Tinción celular y adquisición por citometría de flujo

1. Diseño de paneles
   1. Por favor, consulte la Tabla 1.
      NOTA: El panel de este protocolo fue diseñado para un citómetro de flujo espectral equipado con 4 láseres (violeta, azul, amarillo-verde y rojo) y un total de 51 detectores (48 de fluorescencia + 3 canales de dispersión). El panel debe diseñarse en función de la configuración del citómetro de flujo y de las proteínas/marcadores de interés.
2. Tinción celular
   1. Centrifuga las placas de 96 pozos en U a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C. Descarta cuidadosamente el sobrenadante. A partir de este paso, protege las placas de la luz.
   2. Añadir un tinte de viabilidad de 50 μL (FVD, dilución 1:5000 en PBS) a los pozos apropiados e incubar durante 20 minutos en RT. Lavar con PBS de 150 μL, centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C y descartar el sobrenadante. Añade tinte de viabilidad solo a los controles de viabilidad y a las muestras.
   3. Bloquear los receptores Fc incubando células con 30 μL de anticuerpo anti-CD16/CD32 (0,01 μg/mL en el tampón FACS: PBS con 2 mM de EDTA y 0,5% de BSA) durante 10 minutos sobre hielo. Lavar con un tampón FACS de 170 μL, centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C y descartar el sobrenadante.
   4. Añadir mezcla de anticuerpos de 30 μL o controles de color único (preparados según las diluciones de anticuerpos listadas en la Tabla de Materiales, en el tampón FACS) e incubar durante 20 minutos sobre hielo. Lavar con un tampón FACS de 170 μL, centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C y descartar el sobrenadante.
   5. Fije las células con 100 μL de paraformaldehído al 2% (PFA) en PBS durante 20 minutos en RT. Lave con 100 μL de PBS, centrifuge a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C y descarte el sobrenadante.
      NOTA: Para marcadores intracelulares, sustituye este paso por fijación y permeabilización usando un conjunto de tampones comercial, y luego realiza tinción intracelular antes de la resuspensión final.
   6. Resuspender los pellets de celda final en 200 μL de tampón FACS. Guarda los platos a 4 °C hasta su adquisición en el citómetro de flujo.
3. Controles de tinción de color único y Fluorescencia Menos Uno (FMO)
   1. Se requieren muestras teñidas de un solo color para optimizar la desmezcla. Las células se utilizan para muestras teñidas de un solo color para los marcadores que muestran picos positivos y negativos. Por lo demás, se prefiere y recomienda el uso de cuentas de compensación para lograr una desmezcla óptima. Prepara las perlas de compensación para anticuerpos conjugados con fluorescencia según el protocolo del fabricante.
      NOTA: Preparar controles FMO es un paso importante para lograr un gating adecuado, especialmente para los marcadores que no muestran picos positivos y negativos claros. Prepara varias muestras de FMO para diferentes fluorocromos según sea necesario.
   2. Prepara muestras de FMO para antígenos de superficie celular siguiendo los pasos de la Parte 6.2, pero excluye el anticuerpo de interés de la mezcla de anticuerpos en el paso 6.2.4.
4. Adquisición y análisis de citometría de flujo
   1. Enciende el citómetro, inicia el software de adquisición del citómetro de flujo y prepara las perlas de control de calidad (QC) (1 gota en PBS de 300 μL) en un tubo de muestra de 12 x 75 mm mientras la máquina se calienta (al menos 30 minutos).
   2. Limpia el instrumento ejecutando: 3 min 10 % de lejía v/v, 30 min_{H 2}O a caudal alto. Vuelve a poner el caudal a bajo para los siguientes pasos.
   3. Selecciona la pestaña de control de calidad, carga el tubo y pasa las cuentas pulsando start. Una vez terminado el control de calidad, aparece un mensaje que dice "Aprobado".
   4. Ve a la pestaña de adquisiciones, selecciona o crea el experimento y comienza la adquisición mediante gratificación de celdas por FSC y SSC. Adquiere controles sin tinte y de un solo color, ejecuta el asistente de desmezclar y guarda la configuración. Procede a obtener muestras teñidas.

Resultados

Tras la inoculación intracraneal de células E0771, los ratones desarrollaron una lesión localizada de cáncer de mama en las coordenadas estereotáxicas objetivo. Se seleccionaron las coordenadas estereotaxicas dirigidas al parénquima estriatal (2,5 mm lateral, 0,5 mm anterior al bregma y 3,0 mm ventral desde el bregma) basándose en atlas cerebrales estándar de ratón y enfoques de implantación intracraneal previamente^{descritos 15,16}. Esta región se utiliza ampliame...

Discusión

Al combinar la implantación intracraneal del tumor con el aislamiento, disociación y caracterización inmune de las meninges y el bulbo olfativo, este protocolo permite una investigación detallada de la interacción dinámica entre el microambiente tumoral cerebral y las interfaces inmunitarias asociadas al SNC. El método proporciona formación reproducible de tumores intracraneales, suspensiones celulares de alta calidad y una resolución robusta de subconjuntos inmunitarios. Sin embargo, la...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD45R/B220 antibody (clone RA3-6B2)	BioLegend	103254	used at 1:300 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD8 antibody (clone 53-6.7)	BioLegend	100730	used at 1:50 dilution
APC anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848006	used at 1:80 dilution
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	Povidone-iodine
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich	A2153	To prepare FACS Buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse Podoplanin antibody (clone 8.1.1)	BioLegend	127423	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD11b antibody (clone M1/70)	BioLegend	101263	used at 1:30 dilution
Brilliant Violet 570 anti-mouse NK1.1 antibody (clone PK136)	BioLegend	108733	used at 1:40 dilution
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5)	BioLegend	115541	used at 1:50 dilution
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD44 antibody (clone IM7)	BioLegend	103057	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 785 anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8)	BioLegend	123141	used at 1:40 dilution
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	Buprenorphine
Cell strainer 40-μm	Avantor	732-2757
Cell strainer 70-μm	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
Collagenase type II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix	Corning	356231
Cytek Aurora Spectral Flow Cytometer	Cytek Biosciences
Dnase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
Drill	Stoelting Europe	51630
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high-glucose, pyruvate	Gibco	41966029
E0771 cell line	ATCC	CRL-3436
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Merck	E4884	To prepare FACS Buffer
FCS Express Flow Cytometry Software	De Novo Software
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A5256801
FITC anti-mouse CD3 (clone 17A2)	BioLegend	100204	used at 1:50 dilution
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	Viability dye (used at 1:5000 dilution)
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Heating Pad	MOBICLINIC
Hydrogen Peroxide 34.5 to 37% (H2O2)	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	Ketamine
Lubrithal Eye Gel	Bio4	1731329
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 1M	Gibco	15630080
Paraformaldehyde (PFA) 16 %	Avantor	43368	To prepare Fixation Buffer
Pacific Blue anti-mouse Ly-6G antibody (clone 1A8)	BioLegend	127612	used at 1:50 dilution
PE anti-mouse Ly-6C antibody (clone HK1.4)	BioLegend	128008	used at 1:300 dilution
PE anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848004	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine5 anti-mouse CD11c antibody (clone N418)	BioLegend	117316	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine7 anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1)	BioLegend	104734	used at 1:100 dilution
PE-eFluor 610 anti-mouse CD31 antibody (clone 390)	eBioscience	61-0311-82	used at 1:160 dilution
PE/Fire 810 anti-mouse I-A/I-E (clone M5/114.15.2)	BioLegend	107667	used at 1:300 dilution
Penicillin-Streptomycin (PEST), 10 000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 antibody (clone 30-F11)	BioLegend	103132	used at 1:80 dilution
Phosphate-buffered saline (PBS) 10X, pH 7.4	Gibco	70011044
Prism (version 10)	GraphPad
RN Needle (27/51/3)S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870044
Scalpel Blades, carbon steel	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/mL	Bio2	1112384	Xylazine
Spark Blue 574 anti-mouse CD4 antibody (clone GK1.5)	BioLegend	100490	used at 1:50 dilution
Stereotaxic Instrument	Stoelting Europe	51730D
Suture wire Silkam black 5/0 10x45 cm	B Braun	C0266639	non-absorbable
Surgi