Generación de sustratos de matriz extracelular de poliacrilamida y silicona con rigidez definida para aplicaciones en biología celular

Resumen

Aunque la rigidez de la matriz extracelular (MEC) es un regulador clave del comportamiento celular, los mecanismos subyacentes de detección y transducción siguen siendo poco claros. Para abordar esto, proporcionamos protocolos para crear sustratos a base de poliacrilamida y silicona con rigidez ajustable para avanzar en nuestra comprensión de la diafonía célula-ECM.

Resumen

La matriz extracelular (ECM) es un regulador crítico del comportamiento celular, siendo la rigidez de la ECM una señal mecánica clave que gobierna la señalización celular, la morfología y el destino. Sin embargo, la investigación experimental de las respuestas celulares dependientes de la rigidez suele estar limitada por la disponibilidad de plataformas de cultivo reproducibles, rentables y accesibles con propiedades mecánicas precisamente ajustables. Este protocolo describe métodos basados en poliacrilamida (PA) y silicona para fabricar sustratos ECM con rigidez ajustable. Los procedimientos describen la preparación del sustrato, la funcionalización superficial y la conjugación de proteínas ECM para asegurar una adherencia celular consistente a lo largo de un rango de rigidez fisiológicamente relevante. Los sustratos basados en PA son compatibles con ensayos bioquímicos posteriores, incluyendo la extracción de proteínas y ARN, así como la imagen de fluorescencia de alta resolución. Los sustratos basados en silicona están optimizados para la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), lo que permite la visualización de las interacciones célula-ECM en la membrana basal. Además, los sustratos blandos pueden adaptarse para soportar cultivos esferoides posicionados dentro de un plano de imagen consistente, facilitando la adquisición de imagen consistente. Estos métodos proporcionan plataformas robustas, rentables y reproducibles para sondear sistemáticamente cómo la rigidez de la ECM regula los procesos celulares, avanzando así en la comprensión mecanicista de la diafonía entre células y ECM tanto en contextos fisiológicos como de enfermedades.

Introducción

La matriz extracelular (MEC) es un andamiaje estructural y bioquímico fundamental que define las propiedades mecánicas de los tejidos y apoya sus funciones biológicas. Por ejemplo, los tejidos elásticos como los pulmones y las arterias están enriquecidos con ECM a base de colágeno y elastina, que proporcionan la resistencia mecánica necesaria para ciclos repetidos de estiramiento-retroceso durante la respiración. En cambio, el sistema nervioso central contiene ECM rica en glicosaminoglicanos que crea un entorno altamente complaciente optimizado para la diferenciación neuronal y la^{señalización 1}. En diversos tejidos del cuerpo, la rigidez tisular abarca varios órdenes de magnitud, que van desde cientos de pascales en tejidos blandos como el cerebro y los pulmones hasta niveles de rigidez en megapascal y gigapascal en tendones y huesos,^{respectivamente 2,3}. Estas diferencias mecánicas no son solo estructurales, sino que también desempeñan un papel fundamental en la regulación del comportamiento celular ^4,5. Por ejemplo, las células madre mesenquimales sufren una especificación de linaje dependiente de la rigidez, adoptando destinos neuronales en sustratos blandos, destinos miogénicos en sustratos intermedios y destinos osteogénicos en sustratos^{rígidos 6}. Las alteraciones patológicas en la rigidez de la MCE también pueden impulsar respuestas celulares aberrantes y contribuir al inicio y progresión de la enfermedad ^7,8,9. De manera similar, los cambios en las propiedades de la ECM alrededor de las células también alteran la función de los orgánulos y varios comportamientos^{celulares 10,11}. A pesar de la reconocida importancia de la ECM para guiar la señalización, la función de los orgánulos y la patogénesis de la enfermedad, los mecanismos por los que las células detectan y transducen las señales de ECM en señales bioquímicas siguen siendo incompletamente comprendidos.

El progreso en la comprensión de la diafonía célula-ECM se ha visto obstaculizado en parte por la limitada disponibilidad de plataformas experimentales que ofrecen un control preciso sobre las propiedades de la ECM y que permanecen totalmente compatibles con los ensayos bioquímicos estándar y los flujos de trabajo de imagen. Además, estudiar las interacciones célula-ECM suele percibirse como técnicamente complicado, ya que requiere experiencia interdisciplinar que abarca ciencia de materiales, biología celular y bioingeniería. Este método pretende abordar estos desafíos proporcionando protocolos paso a paso para generar sustratos ECM basados en PA y silicona con propiedades mecánicas definidas, que pueden prepararse fácilmente en la mayoría de entornos de laboratorio húmedo.

Los hidrogeles PA con rigidez ajustable son elementos básicos de la mecanobiología; sin embargo, su utilidad suele verse obstaculizada por el alto coste de los reactivos para la conjugación de ECM, la funcionalización superficial inconsistente y la escasa compatibilidad con flujos de trabajo bioquímicos a gran escala. Además, no están bien establecidos enfoques prácticos y estandarizados para la obtención de muestras e imágenes en sustratos de rigidez variable. Estos cuellos de botella pueden abordarse utilizando nuestra plataforma de gel PA descrita, caracterizada por cuatro innovaciones clave: (i) reducción sustancial de costes, (ii) química de funcionalización reproducible, (iii) producción escalable mediante hardware reutilizable y (iv) integración perfecta con muchos ensayos convencionales de biología celular y bioquímica. Este enfoque utiliza diferentes proporciones de acrilamida y bisacrilamida para generar hidrogeles con propiedades mecánicas distintas (Tabla 1). Los geles de PA son inertes y no se conjugan directamente con las proteínas ECM. Por ello, se utiliza una reacción de polimerización de radicales libres iniciada por los rayos UV para conjugar una fina red entrecruzada de tetraacrilato de di(trimetilopropano), éster de ácido acrílico N-hidroxisuccinimida (NHS-acrilato) y bisacrilamida sobre la superficie de los geles de PA (Figura 1). Esta red crea una superficie adhesiva de doble acción para las proteínas ECM: el NHS-acrilato proporciona un anclaje covalente estable para las proteínas ECM, mientras que el tetraacrilato facilita la adsorción uniforme de proteínas^{ECM 12}. Además, proporcionamos métodos que demuestran cómo extraer proteínas y ácidos nucleicos como el ARN de estos sustratos de manera compatible con análisis de biología celular posteriores como western blotting y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa por transcripción inversa (RT-qPCR). Además, los sustratos PA cumplidores resultantes también apoyan la formación y posición de esferoides dentro de un plano focal consistente, lo que permite un análisis sistemático de comportamientos celulares 3D¹³.

En contraste, las limitaciones ópticas de los hidrogeles PA limitan su uso en modalidades avanzadas de imagen, especialmente en la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (^{TIRF) 14}. Para abordar esta limitación, desarrollamos sustratos ECM a base de silicona mecánicamente sintonizables optimizados para la imagen TIRF. Estos materiales presentan un índice de refracción estrechamente similar al del vidrio, manteniendo la rigidez sintonizable en un amplio rango (Figura 2A). Una capa fina de gel de silicona, con diferentes proporciones de piezas, se aplica por centrifugación sobre un vaso de cubierta antes de la conjugación de ECM (Figura 2B y Tabla 2). Sin embargo, la hidrofobia intrínseca y la inercia química de la silicona impiden la conjugación directa de la ECM. Por ello, implementamos una estrategia de modificación superficial para permitir la unión covalente de ligandos ECM. El tratamiento con plasma de oxígeno introduce grupos hidroxilo en la superficie de la silicona (Figura 2C). Posteriormente, el (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) convierte estos grupos hidroxilo en amina reactiva. El 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo) carbodiimido cloruro (EDC), un entrecruzador de carbodiimida de longitud cero, facilita la formación de enlaces amida covalentes entre los grupos aminas en la superficie del gel y los grupos carboxilo en las proteínas ECM.

En conjunto, estas plataformas ECM proporcionan sistemas rentables, reproducibles y escalables para sondear mecanismos de señalización dependientes de la rigidez del ECM. Su flexibilidad permite una integración fluida con ensayos bioquímicos, imágenes de alta resolución y flujos de trabajo de alto rendimiento, lo que permite investigar cómo la rigidez de la ECM influye en el comportamiento celular y favorece la progresión de la enfermedad.

Protocolo

1. Generación de hidrogeles ECM basados en PA

1. Funcionalización de superficies de vidrio para la fijación de gel de PA
   NOTA: Realizar todos los pasos a temperatura ambiente en un agitador orbital. Enjuaga bien con agua de alta calidad entre pasos.
   1. Limpia las superficies del vidrio con lejía al 10% durante 3 horas en un recipiente resistente a productos químicos (por ejemplo, poliestireno). Utiliza suficiente volumen para cubrir completamente el cristal y asegúrate de que no queden burbujas atrapadas ni zonas secas.
      PRECAUCIÓN: La lejía es un químico altamente corrosivo y reactivo. Sigue las instrucciones de seguridad del fabricante.
   2. Incuba las cubiertas en ácido clorhídrico (HCl) 0,2 M durante 16 horas con una agitación suave sobre un shaker.
      PRECAUCIÓN: El HCl es altamente corrosivo y puede causar quemaduras en la piel. Lleva el EPI adecuado.
   3. Añade 0,1 M de NaOH e incuba durante 1 hora.
      PRECAUCIÓN: Las soluciones de NaOH son corrosivas y pueden causar quemaduras en la piel. Lleva el EPI adecuado.
   4. Incuba los abrigos en APTES al 0,5% en agua de alta calidad durante 30 minutos.
      PRECAUCIÓN: APTES es tóxico. Trabaja con APTES en una campana extractora y el equipo de protección adecuado.
   5. Enjuaga las fundas con un gran volumen de agua para eliminar cualquier APTES residual.
      NOTA: Un lavado incompleto provocará una reacción entre APTES y glutaraldehído en el siguiente paso y provocará precipitados blancos que comprometerán la activación de la superficie del vidrio.
   6. Incubar los coverslips en glutaraldehído al 0,5% en PBS durante 1 hora.
      PRECAUCIÓN: El glutaraldehído es tóxico. Trabaja con glutaraldehído en una campana extractora con el equipo de protección adecuado.
   7. Seca las fundas sobre materiales absorbentes (por ejemplo, papel de cocina) durante toda la noche. Guarda las cubiertas en un recipiente limpio y sellado hasta que se usen.
2. Preparación de solución de hidrogel de PA y colado en gel
   NOTA: Las formulaciones necesarias para obtener hidrogeles con el módulo elástico especificado se proporcionan en la Tabla 1. Los volúmenes recomendados de gel y las dimensiones del vidrio para diferentes aplicaciones experimentales se presentan en la Tabla 3.
   1. Mezclar componentes de hidrogel de PA en un tubo microcentrífuga de 1,7 mL, excluyendo el persulfato de amonio (APS) y la tetrametiletilendiamina (TEMED).
      NOTA: No prepare grandes volúmenes porque los geles de mayor rigidez polimerizan rápidamente y pueden endurecerse antes de completar la fundición.
   2. Desgasifica la mezcla de gel PA, los tubos APS y TEMED en una cámara de vacío a 25 mmHg durante 30 minutos.
   3. Prepara las fundas superiores hidrofóbicas aplicando un recubrimiento repelente al agua sobre las fundas limpias usando un hisopo de algodón. Asegúrate de que las fundas estén libres de manchas para mantener una polimerización constante en gel.
   4. Añade APS y TEMED a la solución desgasificada, luego pipotea suavemente la mezcla sobre las cubiertas activadas.
   5. Coloca las cubiertas hidrofóbicas sobre la solución para crear una capa fina de hidrogel uniforme. Deja que los geles polimerizen durante 35 minutos a temperatura ambiente. Asegúrate de que no queden burbujas atrapadas entre las cubiertas y que la solución no se derrame por los bordes.
      NOTA: Sigue los volúmenes recomendados para el gel para asegurar el grosor adecuado; los geles excesivamente finos permiten a las células detectar el vidrio^{subyacente 15}. Antes de desmontar el sándwich de gel, comprueba la mezcla residual en el tubo de la microcentrífuga para confirmar la polimerización.
   6. Sumerge el sándwich de hidrogel en PBS para separar las capas. Asegúrate de que el hidrogel permanezca unido al abrigo inferior activado, y el cubriente superior hidrofóbico se desprenda fácilmente.
3. Funcionalización de hidrogeles con ligandos ECM
   NOTA: Todos los pasos de esta sección deben realizarse en condiciones estériles dentro de un armario de bioseguridad.
   1. Esteriliza los hidrogeles sumergiéndolos en etanol al 70% y luego transfiere a plásticos de cultivo de tejidos con PBS estéril.
      NOTA: No dejes los hidrogeles en etanol durante un periodo prolongado, ya que esto deshidratará los geles y comprometerá la conjugación de la ECM.
   2. Prepara una solución maestra de funcionalización de mezcla compuesta por agua, etanol, HEPES y bisacrilamida (Tabla 4).
      PRECAUCIÓN: La bisacrilamida es tóxica al inhalarla o ingerirla.
   3. Preparar soluciones diluidas de fotoiniciador UV y tetraacrilato. Ambos reactivos se disuelven en etanol (Tabla 4).
      NOTA: Realizar diluciones en serie de tetraacrilato cada vez, ya que cantidades excesivas pueden provocar sobrepolimerización y depósitos negros visibles en la superficie (véase la Figura 3A).
   4. Pesa la cantidad requerida de acrilato NHS usando una balanza analítica. Resuspende el acrilato del NHS en 50% etanol/50% agua justo antes de su uso.
      NOTA: Una cantidad excesiva de acrilato NHS provocará la formación de depósitos superficiales negros visibles y puede provocar un recubrimiento ECM desigual (Figura 3B).
   5. Añadir el fotoiniciador UV, tetraacrilato y soluciones de NHS-acrilato a la mezcla maestra preparada en el Paso 1.3.2. Aspira el PBS y añade la mezcla maestra a los geles, asegurándote de que estén completamente cubiertos.
   6. Expone los hidrogeles (sin tapas de cubertas de cultivo tisular) a luz UV durante 400 s (fuente de luz UV con longitud de onda inferior a 365 nm).
      PRECAUCIÓN: Usa protección ocular adecuada al trabajar con luz ultravioleta.
   7. Quita los geles y colócalos sobre hielo. Aspirar la solución de funcionalización, luego lavar los geles tres veces con HEPES estéril preenfriado de 25 mM (pH 6,0), seguido de tres lavados con NaCl estéril preenfriado al 0,9%.
   8. Incubar los hidrogeles con el ligando ECM preferido en un HEPES estéril preenfriado de 100 mM (pH 8,0) con 100 mM de NaCl durante la noche a 4 °C sobre un agitador orbital.
      NOTA: La concentración de ligandos ECM puede seleccionarse a discreción del usuario; sin embargo, es fundamental mantener concentraciones idénticas de ligandos en todos los sustratos de rigidez variable dentro del mismo lote.
   9. Aspira cuidadosamente la solución de ligando ECM 16 horas después. Lava los hidrogeles tres veces con PBS y añade medios base sin sérum (o PBS) para mantenerlos hidratados. Incuba los geles durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos para verificar la esterilidad antes de la siembra celular.
      NOTA: El medio aparecerá turbio tras una incubación nocturna a 37 °C en medios de cultivo base si hay contaminación.
   10. Usa los geles inmediatamente para la siembra celular o guárdalos a 4 °C en medio base durante no más de 3 semanas.

2. Generación de sustratos ECM a base de silicona mecánicamente sintonizables

1. Preparación de cubiertas de vidrio para recubrimiento de gel de silicona
   1. Limpia las cubiertas de cristal con 3 M NaOH durante 20 minutos.
   2. Lávate bien con agua de alta calidad cinco veces y aspira el agua al final. Déjalos secar al aire y utiliza un chorro de aire de nitrógeno para eliminar cualquier gota o residuo restante.
2. Preparación de gel de silicona
   1. Pesa los componentes A y B del elastómero de silicona de dos componentes según la relación de peso especificada en la Tabla 2, utilizando una balanza analítica. Utiliza una punta de pipeta cortada para aspirar las soluciones viscosas.
   2. Mezcla bien el Componente A y el Componente B usando una punta de pipeta para asegurar la incorporación completa.
   3. Desgasifica la mezcla en una cámara de vacío a 25 mmHg durante 10 minutos.
3. Fundición de gel sobre fundas de cristal
   1. Coloca un engobe de cubierta sobre una alfombrilla de goma situada en el recubridor, asegurándote de que esté bien centrada.
      NOTA: La alfombra de goma asegura un sellado al vacío adecuado. Sin un sellado adecuado, la capa de cubierta puede desplazarse y romperse. Un centrado incorrecto puede resultar en un recubrimiento no uniforme.
   2. Activa la aspiradora para asegurar la cubierta.
   3. Añade 100 μL de la mezcla en gel al centro del engobe de cobertura. Aplica la capa de centrifugado a 500 rpm durante 10 s, seguida de 8.000 rpm durante 60 s.
   4. Hornea el abrigo recubierto a 80 °C durante 2 horas. Déjalo enfriar a temperatura ambiente.
      NOTA: Guarda a temperatura ambiente hasta un mes antes de usar.
4. Funcionalización del gel de silicona con ligandos ECM
   1. Expone las cubiertas recubiertas con gel de silicona al plasma de oxígeno durante 5 minutos a 11 W de potencia.
      NOTA: La exposición al plasma de oxígeno durante un tiempo más prolongado o a una potencia superior puede provocar el agrietamiento de los geles. Puede que sea necesario probar la combinación óptima de potencia y tiempo dependiendo del equipo utilizado.
   2. Prepara una solución de silanización que contenga 95% de etanol, 0,5% de APTES y 4,5% de_{dH 2O}.
      NOTA: Realice todos los pasos posteriores en condiciones estériles dentro de un armario de bioseguridad.
      PRECAUCIÓN: APTES es tóxico. Trabaja con APTES en una campana extractora y el equipo de protección adecuado.
   3. Incuba el cobertor recubierto con gel con la solución de silanización durante 10 minutos.
   4. Lava bien con PBS cinco veces.
   5. Preparar la solución de ECM que contiene 100 μg/mL de EDC y la ECM de elección a la concentración deseada en PBS.
      NOTA: El EDC es inestable en solución y sensible a la humedad. Prepárala fresca antes de usarla y guárdala bien cerrada en un lugar fresco y seco, protegida de la humedad y del sol directo.
      PRECAUCIÓN: El EDC es perjudicial si se ingiere y tóxico si se inhala. Lleva el EPI adecuado y trabaja en una campana extractora.
   6. Incubar el cobertor con la solución ECM durante 1 hora a 37 °C o durante toda la noche a 4 °C.
   7. Lava el papel de cobertura con PBS cinco veces. Enjuaga con medio base y añade células.
      NOTA: La densidad celular óptima depende de la línea celular específica y de los objetivos experimentales (por ejemplo, subconfluente para morfología o monocapa para adhesión célula-célula). Por ejemplo, una densidad de 0,1 x 10⁶ células/cm² se usa comúnmente para fibroblastos que logran una confluencia del 50% en 48 horas.

3. Preparación del sustrato de ECM para inmunotinción e imagen

1. Inmunotinción e imagen en sustratos basados en PA
   NOTA: Los hidrogeles de PA de dieciocho milímetros generalmente proporcionan suficiente área imaginable para el análisis cuantitativo. Para aplicaciones de imagen, fundir los hidrogeles y realizar inmunotinción en "cámaras naranjas" preparadas a partir de tubos de 15 mL. Reutiliza las cámaras naranjas para varias rondas de fundición y tinción en gel, siempre que mantenga la integridad estructural.
   1. Anillos de perforación de película de policarbonato y película de caucho de silicona utilizando perforadores de 18 mm de diámetro exterior y 14 mm de orificio interior para preparar separadores y juntas.
   2. Corta una abertura en el centro de la tapa de un tubo de centrífuga de 15 mL usando tijeras para crear una cámara para el colado y teñido en gel.
   3. Vi el tubo de la centrífuga en la marca de 14 mL. Recorta los bordes irregulares con un bisturí y lima el borde de la tapa para asegurarte de que encaje en una placa estándar de 12 pozos.
   4. Montar el sándwich de cubierta de hidrogel (como se describe en la Sección 1), colocando el anillo separador sobre el abrigo activado.
   5. Desmonta el sándwich una vez que los geles estén completamente polimerizados.
   6. Esteriliza los hidrogeles de 18 mm y transfiere a una placa de cultivo de tejido de 12 pozos con PBS estéril.
   7. Realizar la funcionalización de ligandos ECM según lo descrito en la sección 1.
   8. Haz células de semilla y fijalas con un 4% de formaldehído.
      NOTA: Evita los fijadores a base de alcohol, ya que deshidratan los geles y comprometen la integridad estructural.
      PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y siempre debe usarse dentro de una campana extractora.
   9. (Opcional) Vuelve a montar las muestras en la cámara de tapa del tubo de la centrífuga. Usa una junta de silicona para sellar la recámara.
      NOTA: Realiza una prueba de fugas con PBS durante varias horas antes de teñir. Aunque este método puede parecer más laborioso, favorece una tinción uniforme y reduce el consumo de anticuerpos.
   10. Proceder con la tinción por inmunofluorescencia según los protocolos preferidos por el usuario.
   11. Después de la tinción, almacenar muestras en PBS suplementadas con 50% de glicerol. Haz imágenes de las muestras lo antes posible.
       NOTA: Evita los medios de montaje estándar que se endurecen, ya que pueden agrietar hidrogeles con el tiempo y dañar muestras. La intensidad de la fluorescencia disminuye con el tiempo; Imagen en un plazo de 1 semana para una calidad óptima de señal.
   12. Coloca una pequeña gota de PBS (o medio de montaje) sobre la superficie del fondo de vidrio de un plato de cultivo de tejidos. Inverte cuidadosamente los hidrogeles teñidos sobre la gota para que las células miren hacia el cristal de la cubierta y procede con la imagen.
2. Inmunotinción e imagen en sustratos de ECM a base de silicona
   1. Fija las muestras usando un 4% de formaldehído y tiñelas directamente sobre un plato de fondo de cristal usando un protocolo estándar de inmunofluorescencia. Evita los fijadores a base de alcohol porque agrietarán los sustratos de la ECM.
   2. Muestrea la imagen directamente usando un microscopio de fluorescencia tradicional.

4. Extracción de proteínas y ARN de células placadas sobre sustratos ECM

1. Con pinzas, retira cuidadosamente los geles del recipiente de cultivo y sumérjalos en PBS estéril para enjuagar los residuos de cultivo y el suero.
   NOTA: Manipula las cubiertas con cuidado, ya que son extremadamente frágiles y pueden romperse fácilmente.
2. Aplica suavemente el borde del hidrogel con toallitas de baja pelusa para eliminar el exceso de PBS.
3. Añadir un volumen adecuado de amortiguador de extracción de ARN a la tapa de un plato de cultivo de tejidos.
   NOTA: Los reactivos basados en fenol-guanidina son compatibles con la extracción de ARN de geles PA. Se pueden utilizar tampones de lisis de proteínas según los requisitos experimentales. Visualiza las muestras al microscopio tras la incubación del tampón de lisis para asegurar la completa alteración celular.
4. Coloca el coverslip (con el gel hacia abajo) sobre la solución de lisis. Levanta y baja cuidadosamente el hidrogel varias veces para asegurar una lisis uniforme de todas las células.
5. Raspa suavemente la superficie del gel para liberar el lisado.
   NOTA: No utilices raspadores comerciales de celdas de plástico, ya que el plástico rígido puede dañar los hidrogeles blandos y contaminar el lisato con trozos de gel. El plástico blando utilizado para fabricar separadores (véase el Paso 3.1.1) es adecuado para este propósito y puede reutilizarse para fabricar raspadores personalizados.
6. Almacenar el ARN o los lisados de proteínas a -80 °C hasta su procesamiento adicional utilizando métodos bioquímicos convencionales o emplearlos inmediatamente.

5. Generación de la cultura esferoide de un solo plano

1. Prepara el hidrogel de PA de 75 Pa sobre cubiertas de 18 mm y funcionaliza la superficie con extracto de membrana basal (BME) u otro ligando ECM adecuado para facilitar la unión celular.
2. Semillas de células sobre los hidrogeles o geles de silicona recubiertos de ECM a la densidad deseada.
3. Después de 2 horas, retira suavemente las células soltas y añade una capa de BME diluida en medio basal preenfriado.
   NOTA: El BME se polimeriza al calentarse. Preenfría las puntas antes de pipetear. El porcentaje de BME incorporado está determinado por la integridad mecánica y estabilidad deseadas del andamiaje 3D resultante.
4. Incubar los cultivos a 37 °C en una incubadora de cultivos tisulares durante 1,5 horas para permitir la polimerización de la ECM.
5. Añade suavemente el medio de cultivo celular para cubrir completamente los geles 3D.
6. Mantener los cultivos bajo condiciones estándar. Las células continuarán creciendo y autoensamblándose en esferoides 3D con el tiempo hasta alcanzar el punto experimental deseado.

Resultados

La rigidez del gel de PA generada con las formulaciones de la Tabla 1 fue probada experimentalmente con un reómetro. Se seleccionaron geles con valores nominales de rigidez de 0,4 kPa, 6 kPa y 60 kPa, que abarcan tres órdenes de magnitud. Los valores de rigidez medidos fueron 363 ± 76 Pa para geles de 400 Pa, 6,41 ± 0,50 kPa para geles de 6 kPa y 36 ± 8 kPa para geles de 60 kPa (Figura 4A). Para evaluar la unión uniforme de ECM a los geles de PA, se conj...

Discusión

El protocolo de fabricación ECM descrito proporciona un flujo de trabajo reproducible, escalable y rentable, y puede implementarse fácilmente en la mayoría de los laboratorios. Aunque la cerámica tradicional de vidrio y plástico es conveniente y permite una rápida recogida de datos, los sustratos sintéticos no logran replicar la rigidez tisular fisiológicamente relevante. Sustratos alternativos mecánicamente sintonizables, como el polidimetilsiloxano (PDMS) o la gelatina metacriloiloiloa...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)	919-30-2	-	Thermo Fisher Scientific
1.7 mL microcentrifuge tubes	-	LMCT1.7B	FroggaBio
12-well tissue culture-treated plates	-	83.3921	Sarstedt
15 mL centrifuge tubes (for orange chamber)	-	CLS430790	Corning
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure)	106797-53-9	-	Thermo Fisher Scientific
2% Bisacrylamide solution	110-26-9	-	Bio-Rad
3-(3-Dimethylaminopropyl)-1-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)	25952-53-8	-	Chem Impex International
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	28718-90-3	-	Sigma
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	-	D1306	Invitrogen
40% Acrylamide solution	01/06/1979	-	Bio-Rad
50% Glutaraldehyde	111-30-8	-	Thermo Fisher Scientific
6 cm tissue culture-treated dishes	-	83.3901	Sarstedt
A549 cells	-	CCL-185	ATCC
Acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester	38862-24-7	-	Thermo Fisher Scientific
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit antibody	-	A11008	Invitrogen
Alexa Fluor 594 NHS ester (tris(triethylammonium salt))	-	A37572	Invitrogen
Ammonium persulfate	7727-54-0	-	Bio-Rad
Clear impact-resistant polycarbonate film (0.005 in.; spacer)	-	85585K72	McMaster-Carr
CY 52-276 silicone gel, Components A and B	2624028	-	Dow
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	-	11995-065	Thermo Fisher Scientific
Ethanol, anhydrous	64-17-5	-	Greenfield Canada
Fast SYBR Green Master Mix	-	4385612	Thermo Fisher Scientific
Fetal bovine serum	-	A52567-01	Thermo Fisher Scientific
Fibronectin	-	356008	Corning
Formaldehyde (16%)	-	28908	Thermo Fisher Scientific
HEPES	7365-45-9	-	BioShop
High-temperature silicone rubber sheet (0.020 in.; gasket)	-	86435K452	McMaster-Carr
Hydrochloric acid	7647-01-0	-	BioShop
Large hollow hole punch tool set	-	66000	Mayhew Pro
Matrigel	-	356234	Corning
Media storage borosilicate glass bottle, 250 mL	-	CLS1395250	Corning
Media storage borosilicate glass bottle, 500 mL	-	CLS1395500	Corning
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate	-	4346906	Thermo Fisher Scientific
Microscope slide coverslips, 18 mm diameter	-	72222-01	Electron Microscopy Sciences
Microscope slide coverslips, 50 mm diameter	-	1.84E+16	eBay
PBS (1×)	-	14190144	Thermo Fisher Scientific
PBS (10×)	-	70011044	Thermo Fisher Scientific
Phalloidin	17466-45-4	-	Biotium
Phospho-FAK (Tyr397) antibody	-	85567	Cell Signaling Technology
Phospho-MLC (Ser19) antibody	-	3671	Cell Signaling Technology
Plasma cleaner	-	PDC-32G	Harrick Plasma
qPCR primers (forward and reverse)	-	N/A	Integrated DNA Technologies
qScript cDNA Synthesis Kit	-	95047	QuantaBio
Rain-X	-	-	Rain-X
Screw-cap tubes, conical base, 15 mL	-	62.554.101	Sarstedt
Screw-cap tubes, conical base, 50 mL	-	62.547.205	Sarstedt
Serological pipette, 10 mL	-	170356N	Thermo Fisher Scientific
Serological pipette, 25 mL	-	170357N	Thermo Fisher Scientific
Serological pipette, 5 mL	-	170355N	Thermo Fisher Scientific
Serological pipette, 50 mL	-	170358N	Thermo Fisher Scientific
Sodium hydroxide	1310-73-2	-	BioShop
SYPRO Ruby protein gel stain	-	S12000	Invitrogen
TEMED	110-18-9	-	Bio-Rad
TRIzol reagent	-	15596026	Thermo Fisher Scientific
UV chamber	-	165-5031	Bio-Rad