Caracterización de la estructura y función de la membrana lipído-proteína usando bicapas de interfaz de gotas

Summary

Se presenta un protocolo experimental para ensamblar, estimular eléctricamente y analizar bicapas de interfaz de gotas dopadas con gramicidina A. Las relaciones estructura-función lipídio-proteína se cuantifican midiendo cambios en el área de membrana, el flujo iónico y la conductancia de canal único, y relacionando estas respuestas con cambios similares a la plasticidad en la conducción iónica en un modelo de membrana inspirado en sinapsis eléctricas.

Abstract

Las bicapas de interfaz de gotas (DIBs) ofrecen una plataforma sintonizable para sondear las propiedades electromecánicas de las membranas lipídicas y peptídicas bajo estimulación eléctrica controlada. Los DIB permiten mediciones de conductancia iónica tanto de canal único como de conjunto sobre áreas de membrana órdenes de magnitud mayores que las accesibles con técnicas tradicionales de pinza de parche, permitiendo así análisis a nivel de membrana de la deformación electromecánica y su influencia en péptidos conductores de iones. Al ajustar sistemáticamente la estructura de la membrana a través de la fase petrolífera hidrocarburo a granel (por ejemplo, hexadecano [C16] frente a dodecano/hexadecano [C12/C16] [25%/75%, v/v]), esta plataforma ascendente permite una variación sistemática de la composición de la membrana y el entorno aceitoso, lo que influye en la viscoelasticidad y reorganización estructural de la membrana, y por tanto la conducción de iones peptídicos. Se proporcionan procedimientos detallados para el ensamblaje de membranas dopadas con gramicidina A-dopada 1,2-difitanoil-sn-3-fosfocolina (DPhPC) utilizando diferentes composiciones de aceites hidrocarburos y para la aplicación de protocolos de pulso de voltaje que impulsan las membranas a estados electromecánicos metaestables. Se caracteriza por la conducción iónica adaptativa por membrana, incluyendo respuestas similares a la plasticidad a corto plazo (similares a STP) y a ampliación y depresión a largo plazo (similares a LTP/similares a LTD) en un sistema modelo de membrana. De forma más amplia, este protocolo proporciona un enfoque robusto y reproducible para investigar sistemáticamente las contribuciones electromecánicas a nivel de membrana dependientes de la composición al comportamiento conductor similar a sinápticos y para comprender cómo los entornos de membrana lipídica modulan la función de los canales iónicos.

Introduction

Las membranas biológicas son estructuras supramoleculares críticas que pueden regular la conducción iónica y permitir la comunicación entre neuronas a través de sinapsis eléctricas y ^químicas 1,2,3,4.Este tipo de comunicación está además controlado por la plasticidad sináptica, donde los cambios estructurales en las sinapsis modulan su fuerza y persistencia a lo largo de un rango de escalas^{temporales 5,6}, comúnmente descritas en términos de plasticidad a corto plazo (STP) y potenciación o depresión a largo plazo (LTP o LTD). Estos fenómenos, que implican cambios dinámicos en la conductancia de membrana en respuesta a la actividad neuronal, suelen estar acoplados a la neuroplasticidad⁷, que subyace al aprendizaje y^{la memoria 8}. Los modelos tradicionales de plasticidad suelen enfatizar la regulación bioquímica de los canales iónicos mediante la síntesis de proteínas, el tráfico o^{la fosforilación 9}. Sin embargo, el papel de las membranas plasmáticas neuronales en los modelos de plasticidad ha sido, en su mayoría, pasado por alto^10,11.

Los métodos de abrazadera parcheada se han utilizado durante más de medio siglo para estudiar la electrofisiología de un solo canal iónico. Sin embargo, solo pueden examinar áreas de membrana mucho más pequeñas que las sinapsis intactas o los modelos sintéticos a gran escala. Por ello, suponen una limitación técnica para estudiar la reorganización y deformación de membranas a mesoescala. La mesoescala es cada vez más reconocida como una escala de longitud crítica para comprender muchos aspectos de la biofísica de^{membranas 12,13}.

Se presenta una metodología para utilizar 1,2-difitaniilo-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) bicapas de interfaz de gotas (DIBs^)14,15 dopadas con el ionóforo catiónico peptídico monovalente, gramicidina-A (gA), para modelar la conducción iónica, similar a lo que ocurre en una sinapsis eléctrica. Este sistema ofrece varias ventajas clave: (i) los DIB proporcionan una plataforma sintonizable de lípidos y aceite que permite una reorganización sistemática de^{membranas 16}; (ii) los DIB permiten el estudio de eventos de canal único y de conjunto en una gama de escalas de longitud^17,18; y (iii) los DIB permiten la interrogación de parches de membrana de tamaño^{submilimétrico 2} que capturan la reestructuración colectiva de membrana inducida electromecánicamente, preservando la capacidad de resolver eventos de conducción iónica de un solo^{canal 19,20}. Este método es más adecuado para estudios que requieren una interrogación eléctrica y óptica simultánea de la electromecánica de membrana sobre áreas de membrana mayores que las accesibles con el patch clamp convencional, manteniendo al mismo tiempo la capacidad de resolver eventos discretos de canal. Es especialmente útil cuando el objetivo experimental es examinar cómo la composición de la membrana, el ambiente del aceite y las formas de onda de tensión impuesta influyen en la reestructuración colectiva de membranas y la conducción peptídica. El método es menos adecuado para experimentos que requieren arquitectura celular nativa o lecturas moleculares directas de cambios conformacionales de proteínas en membranas biológicas^intactas 19,20,21.

Al aplicar una estimulación eléctrica fisiológicamente relevante, los DIB se llevan a estados estacionarios fuera del equilibrio en los que la reestructuración electromecánica dinámica altera la conducción del canal iónico peptídico. Estos cambios emergentes en la conducción iónica son descriptivamente análogos a los fenómenos neurológicos STP, LTP y LTD discutidos en^neurociencia 22,23,24. En el presente estudio, estos comportamientos se interpretan principalmente como respuestas físicas a nivel de membrana a la estimulación eléctrica asociadas a propiedades mecánicas intrínsecas de membrana, como la viscoelasticidad y la compresibilidad en un sistema modelo^{de membranas 25}. Cabe destacar que el estudio descrito aquí se basa en evidencia previa de que las bicapas lipídicas pueden exhibir memoria eléctrica fundamental mediante desplazamientos persistentes de conductancia y almacenamiento de carga capacitiva tras la^{estimulación} 14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33^{, 34}, que ofrece nuevas perspectivas sobre los mecanismos mediante los cuales las bicapas lipídicas pueden apoyar una funcionalidad adaptativa, similar a la sináptica, en ausencia de maquinaria celular compleja. Finalmente, esta metodología también permite examinar directamente las relaciones estructura-función y cómo el comportamiento macroscale emergente surge de una simple reorganización^estructural 21,25,27.

Protocol

Limpia a fondo toda la cristalería y el equipo preparatorio con los detergentes de laboratorio adecuados y enjuaga con agua destilada antes de preparar la muestra. Lleva gafas de seguridad en todo momento y guantes de nitrilo o látex para evitar contaminaciones. Eliminar todos los residuos químicos conforme a las directrices de seguridad institucional. Asegúrese de que los disolventes volátiles se almacenen correctamente conforme a las directrices de seguridad institucionales. Asegurarse de que el espacio y el hardware del laboratorio de experimentación (Figura 1A), el recipiente de experimentación (Figura 1B) y las conexiones eléctricas y ópticas (Figura 1C) permanezcan sin obstáculos y sin obstáculos.

1. Preparación de una solución tampón acuosa

1. Pesa la cantidad adecuada de ácido propanesulfónico 3-(N-morfolino) (MOPS) y cloruro de potasio (KCl) para obtener las concentraciones finales deseadas (por ejemplo, 10 mM MOPS, 0,1 M KCl en 500 mL).
2. Añade el MOPS y el KCl a ~450 mL de agua destilada en un matraz volumétrico de 500 mL o un cilindro graduado y remueve con una barra magnética hasta que estén completamente disueltos.
3. Mide el pH con un medidor calibrado. Ajusta el pH a 7,4 añadiendo 1 M de hidróxido de potasio (KOH) o ácido clorhídrico (HCl) en incrementos de 0,25 mL mientras se remueve continuamente.
4. Lleva el volumen total a 500 mL con agua destilada y mezcla bien. Transfiere el buffer a una botella limpia y etiquetada, sella y guárdalo a 4 °C.
   NOTA: Usa el buffer hasta ~2 meses. Verifica y reajusta el pH a 7,4 antes de cada uso.

2. Preparación de la solución de gramigidina

1. En una campana extractora química, añade 5 mg de gramicidina A (gA) a un frasco de cristal limpio de 20 mL. Añade 10 mL de metanol usando una jeringuilla hermética de vidrio o gas y haz un vórtice hasta que el péptido esté completamente disuelto. Etiqueta el vial como "gA stock" y guárdalo a -80 °C.
   NOTA: Los experimentos de conjunto utilizan proporciones molares de lípidos y péptidos de ~1:^10-4. Los experimentos de canal único utilizan péptidos ~10–100 veces menor (1:^10-5–^10-6) para resolver eventos individuales en tiempos de grabación cortos (<1 min). Preparar un fondo diluido mejora la precisión del pipeteo a proporciones molares bajas (< ~ 1:^10-4).
2. Purga dos viales de vidrio limpios adicionales de 20 mL con gas argón durante ~5 s cada uno para eliminar el polvo.
3. Utilizando una jeringuilla limpia hermética a gases, dispensa 9,9 mL de metanol en cada frasco purgado.
4. Pipetear 100 μL de la solución de gA con una jeringuilla estanca a gas en un vial para obtener un volumen total de 10,0 mL. Etiqueta este frasco como "A". Concentración = 2,66 μM gA en metanol.
5. Pipetear 100 μL de la solución "A" en el segundo vial de vidrio para obtener un volumen total de 10,0 mL. Etiqueta este vial como solución "B". Concentración = 26,6 nM gA en metanol.
6. Sella los frascos con tapones y envuelve con parafilm.
7. Guarda todas las soluciones de gA a -80 °C hasta su uso.

3. Preparación de vesículas lipídicas peptídicas

1. Purga un vial de vidrio limpio de 20 mL con gas argón durante ~5 s.
2. Añadir 4 mg de lípido 1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) al vial.
3. En una campana extractora, añade 1 mL de metanol usando una pipeta de cristal. Gira suavemente o haz un vórtice hasta que todos los lípidos se disuelvan.
4. Utilizando una jeringuilla hermética al gas de 500 μL, añadir 178 μL de solución "A" (para experimentos STP a nivel de conjunto; Relación molar DPhPC:gA = 1:^10-4) o 890 μL de solución "B" (para experimentos de canal único; Relación molar DPhPC:gA = 1:5×^10-6) en la solución de metanol DPhPC. Suavemente en vórtice para mezclar.
5. Bajo un suave chorro de argón en la campana extractora, se evapora el metanol hasta que se forme una fina y uniforme película lipídica en el fondo del vial.
6. Coloca el vial abierto en un horno de vacío a 40 °C y tira un vacío completo durante 10–12 horas o toda la noche para eliminar el disolvente residual.
7. Retirar el vial del horno al vacío y añadir 2 mL del tampón de 0,1 M de KCl preparado en la Sección 1 para experimentos STP, resultando en una concentración final de lípidos y gramicidina en suspensión de 2,36 mM y 236 nM, respectivamente. Para experimentos de canal único, añadir 2 mL de un buffer KCl de 1 M como se prepara en la Sección 1. Vórtice para rehidratar la película lipídica y obtener una suspensión lipídica de 2 mg/mL, resultando en una concentración final de lípidos y gramicidina en suspensión de 2,36 mM y 11,8 nM, respectivamente.
8. Congela el vial a -80 °C durante al menos 6 minutos y luego déjalo descongelar en una placa caliente o baño maria a 40 °C durante 6 minutos. Vórtice para mezclar brevemente. Repite este ciclo de congelación-deshielo seis veces para promover la formación de vesículas multilamelares.
9. Montar un extrusor de vesícula lipídica con una membrana grabada por pista de 0,1 μm de diámetro en los poros siguiendo las instrucciones del fabricante. Pasa 500 μL de buffer por el extrusor 3 veces para hidratar la membrana, verifica que no hay fugas y descarta el buffer.
10. Carga 1 mL de la suspensión de lípidos descongelados en el extrusor y realiza 31 pasadas a través de la membrana de 0,1 μm para obtener vesículas unilamelares de ~100 nm de diámetro y asegurar la homogeneidad de tamaño.
11. Transfiere las vesículas extruidas (Vesículas unilamelares grandes, LUV) a un tubo de PCR de 1 mL, etiquete y guarda a 4 °C. Úsalo dentro de las 2 semanas siguientes a la preparación.
12. Sellar cualquier suspensión de proteínas lipídicas no extruidas restantes en el vial original, envolver con parafilm y almacenarlo a -80 °C para su uso posterior.
13. Si se utilizan muestras previamente congeladas y no extruidas, fundir a 40 °C usando una placa caliente o dejar que la muestra se caliente hasta la temperatura ambiente, y luego extruir la muestra.

4. Preparación del gel de agarosa

1. Coloca un vaso de precipitados de cristal limpio de 50 mL sobre una placa caliente. Añadir una pastilla de agarosa a 50 mL del mismo tampón utilizado para hidratar la película lipídica (por ejemplo, 10 mM MOPS, 0,1 M KCl, pH 7,4) para formar una solución de gel de agarosa al 1%.
2. Añade una barra limpia de teflón y remueve vigorosamente hasta que la pastilla se disperse.
3. Cubre el vaso con papel de aluminio y perfora un pequeño orificio de ventilación con una espátula metálica. Ajusta la temperatura de la placa eléctrica entre 220 y 230 °C. La solución se aclarará y alcanzará un punto de ebullición progresiva, indicando la disolución completa de la agarosa.
4. Apaga el fuego y retira cuidadosamente el papel de aluminio. Haz una lectura rápida de cualquier película de superficie con una espátula metálica limpia. Utiliza la solución de agarosa caliente inmediatamente para el recubrimiento de electrodos o déjala enfriar y solidificar en el vaso para usarla después.
5. Tras el recubrimiento de agarosa con electrodos, cubrir la agarosa solidificada con lámina, sellar con parafilm, etiquetar y almacenar a 4 °C. Cuando sea necesario, recalienta hasta que hierva y remueve hasta que esté completamente fundido.

5. Preparación de electrodos

1. Corta un hilo de plata de 0,125 mm de diámetro en longitudes de ~70 mm para electrodos de cabecera y longitudes de ~130 mm para electrodos de tierra.
2. Utilizando una llama abierta (por ejemplo, un mechero de mano o un mechero Bunsen), mantenga un extremo de cada alambre plateado horizontalmente en el cono central más caliente de la llama hasta que la punta se derrita y forme una bola esférica de ~0,2 mm de diámetro (Figura 2A).
3. Coloca los cables sobre una superficie limpia y verifica bajo el microscopio que las bolas sean esféricas y de tamaño similar. Si una bola es oblonga o irregular, corta la punta y repite la fusión (Paso 5.2).
4. Coloca los extremos de ambos cables plateados en un recipiente de cristal con lejía doméstica fresca (hipoclorito de sodio, NaClO). Asegúrate de que las bolas estén completamente sumergidas e incubadas durante al menos 1 hora para clorar la superficie y formar Ag/AgCl. Un aspecto marrón grisáceo apagado confirma la cloración exitosa (Figura 2B).
5. Retira los alambres de la lejía cuando los extremos de la bola estén de color gris opaco, enjuágalos bien con agua destilada y colócalos sobre una superficie limpia y sin pelusas para que se sequen.
6. Obtén un portapipetas de cabeza y un soporte para electrodos de tierra. Corta un capilar de vidrio borosilicato de 100 mm (1,0 mm de diámetro exterior, 0,58 mm diámetro interior) por la mitad usando un cortador de vidrio.
7. Inserta un semi-capilar en el soporte de la pipeta de cabecera y aprieta el soporte para asegurarlo. Monta un capilar completo de 100 mm en el soporte de electrodos de tierra y fijalo.
8. Inserta el extremo no esférico del alambre de plata de 130 mm en el capilar del electrodo de tierra hasta que sobresalga ~20 mm del extremo de bola. Pega el extremo opuesto del cable al soporte, dejando ~5 mm expuestos para la conexión a tierra.
9. Repite el siguiente paso con un cable de 70 mm para el electrodo de la etapa principal, asegurando un contacto firme entre el cable y el conector de la etapa principal (pieza de color dorado). Recorta cualquier cable sobrante del extremo del conector de la cabeza.
10. Sumerge cada bola de plata clorada en la agarosa, justo por encima de la unión bola-eje, para formar un recubrimiento fino y uniforme. Entra y sale al menos 10 veces.
11. Retira el electrodo y deja que la agarosa se gelifice a temperatura ambiente. Repite el sumergido si es necesario para obtener una cáscara lisa y uniforme de agarosa de decenas de micrómetros de grosor. Evita recubrir demasiado arriba o demasiado bajo el alambre (Figura 2C).
12. Monta los electrodos de cabecera y de tierra en micromanipuladores. Conecta el cable de tierra expuesto (~5 mm) a la toma de tierra del amplificador usando una pinza de cocodrilo.
13. Con pinzas, dobla suavemente cada electrodo a mitad de camino entre el extremo esférico y el capilar para que el extremo esférico quede perpendicular a la etapa del microscopio. Evitar curvas superiores a 90° para minimizar la distorsión óptica en las vistas visuales y de vídeo del microscopio.
14. Ajusta la orientación de los electrodos en sus soportes para que los extremos de la bola recubiertos de agarosa queden perpendiculares al plano de imagen del microscopio (Figura 3A).

6. Formación de bicapas de interfaz de gotas (DIBs)

1. Coloca una placa de Petri limpia y transparente sobre el escenario de un microscopio invertido. Llena el plato con aceite de alcano (por ejemplo, 100% hexadecano, o 25%/75% v/v dodecano/hexadecano) hasta una profundidad de ~ 5 mm (Figura 1B).
2. Usando los controles del micromanipulador, baja ambos extremos de la bola recubierta de agarosa al aceite hasta una profundidad de ~2,5 mm por debajo de la superficie del aceite. Evita movimientos rápidos con el micromanipulador para evitar colisiones entre la bola y la cabeza de la bola del electrodo con la placa de Petri.
3. Ajusta el enfoque del microscopio hasta que ambos extremos de la bola y sus recubrimientos de agarosa estén en un enfoque nítido. Coloca los electrodos cerca del borde del campo de visión para que ambos puedan observarse simultáneamente.
4. Utilizando una pipeta calibrada de 2 μL, aspira la suspensión extruida de vesícula de lípidos y péptidos. Dispensa lentamente 250 nL de la suspensión directamente sobre cada extremo de bola recubierto de agarosa usando una punta de pipeta separada para cada uno, sin tocar la carcasa de agarosa con la punta de la pipeta.
   NOTA: Para minimizar las vibraciones de las manos y aumentar la estabilidad, ancla ambos codos al saliente antivibratorio de la mesa. Estabiliza la muñeca pipeteadora con la mano que no pipetea, sumerge lentamente la pipeta en el aceite y acércate al electrodo de forma gradual. Una breve retención de la respiración durante la carga de gotas puede reducir aún más los movimientos no intencionados.
5. Permite que las gotas se dispersen y cubran la concha de agarosa y se desprendan del electrodo bajo la gravedad. Observa el hundimiento desde un lado a través de la pared de la placa de Petri si está despejado (Figura 3B).
   NOTA: El tiempo requerido para el hundimiento de las gotas depende de la distribución del tamaño de la vesícula, la temperatura y la topografía de la agarosa. Para los DIB de DPhPC, espera al menos 5 minutos después de la deposición de^{gotas 15}.
6. Empuja suavemente la mesa antivibratoria para evaluar la preparación de las gotas. Confirma que las gotas caídas se mueven con un ligero retraso respecto al movimiento del electrodo, indicando la formación de gotas monocapa lipídicas completamente recubiertas.
   NOTA: El movimiento retardado ocurre porque la formación de una monocapa lipídica alrededor de la gota acuosa reduce significativamente la tensión superficial, retrasando así la respuesta física al mover el electrodo en el aceite.
7. Si no se observa este comportamiento, espera 2–3 minutos más y repite el proceso.

7. Instalación eléctrica y monitorización de dos capas (visual y eléctrica)

1. Asegúrese de que el microscopio, la mesa antivibración, la jaula de Faraday y todos los componentes eléctricos, incluyendo el amplificador, digitalizador, generador de funciones y ordenador, estén conectados a una tierra común (Figura 1).
2. Organiza las conexiones del instrumento según la guía de configuración del fabricante. Utiliza la Figura 1C como referencia esquemática para la configuración eléctrica y óptica esencial. Consulte las instrucciones detalladas sobre la puesta a tierra³⁵, configuración hardware/software y ajuste del desplazamiento de la pipeta para experimentos DIB.
   NOTA: Siga las instrucciones específicas de configuración para todo el software y hardware listados en la Tabla de Materiales.
3. Conecta los electrodos de cabeza y tierra al amplificador patch-clamp.
4. Configura un generador de funciones externo (o el canal de salida del software de adquisición) para generar una forma de onda de voltaje triangular de 10 Hz y 10 mV. Confirma la amplitud y frecuencia en un osciloscopio conectado y dentro del software de adquisición.
5. Después de que las gotas se hayan caído durante ~ 10 minutos, usa los micromanipuladores para que ambas gotas estén en contacto suave. Ajusta la posición de los electrodos para que el área de contacto de las gotas no supere inicialmente ~ 1/^{4 de su} diámetro.
6. Activa la forma de onda triangular de 10 Hz y 10 mV y monitoriza la respuesta capacitiva de corriente con el amplificador y el software de adquisición.
7. Esperar la formación espontánea de la bicapa, indicada eléctricamente por una respuesta de corriente capacitiva creciente de pico a pico y ópticamente por una reflexión interna creciente (apariencia ovalada) del contacto de la doble capa (Figura 4). Confirmar que las bicapas lipídicas puras muestran mesetas rectangulares de corriente al estímulo de voltaje triangular, mientras que las bicapas dopadas por gA a ~1:^10-4 lípidos: el péptido exhiben mesetas inclinadas que reflejan la conducción iónica en conjunto.
8. Ajusta el área de contacto de las gotas moviendo ligeramente los electrodos hasta que la respuesta de corriente capacitiva pico a pico a la forma de onda triangular de 10 Hz y 10 mV esté entre ~100–200 pA para ~250 nL DIBs en aceites C16 o C12/C16, lo que corresponde a un rango de capacitancia de ~250–500 pF³³.
   NOTA: Los pulsos de alta frecuencia o tensiones de mantenimiento de corriente continua distintas de cero pueden inducir electrohumectación y expansión excesiva de la bicapa, lo que conduce a la coalescencia de gotas y la ruptura de la bicapa. El rango de 100–200 pA proporciona un equilibrio entre la estabilidad de la doble capa y la relación señal-ruido, permitiendo una expansión suficiente del área durante la estimulación.
9. Si el DIB se fusiona, saca los electrodos del aceite. Enjuaga bien las cabezas de los electrodos con el mismo tampón acuoso que se usa para las muestras de lípidos y la agarosa.
10. Elimina cualquier gota acuosa de la placa de Petri con una jeringuilla estéril. Rellena con aceite nuevo si es necesario, vuelve a sumergir los electrodos. Recarga la solución de LUV sobre los electrodos según se describe en la Sección 6 y repite el proceso.
11. Una vez confirmadas respuestas capacitivas o conductoras estables, apague la forma de onda triangular y permita que el DIB se equilibre durante al menos 15 minutos antes de aplicar protocolos de estimulación.

8. Protocolos de estimulación eléctrica

1. Experimentos de pulsos (respuestas tipo STP en conjunto y similares a LTP / LTD)
   1. Configurar el generador de funciones o el software de adquisición para entregar pulsos de voltaje de la amplitud, duración e intervalo entre pulsos deseados (por ejemplo, patrones PPF [facilitación de pulsos emparejados] y PPD [depresión de pulsos emparejados]).
   2. Abre el software de captura de vídeo. Selecciona la cámara y la configuración del objetivo adecuadas. Configura la tasa de fotogramas en al menos 20 fotogramas/s y confirma que se mantiene estable durante la grabación.
   3. En el software de adquisición de datos, establece la frecuencia de muestreo a al menos 5 kHz para la señal actual.
   4. Haz clic en Adquirir > Nuevo Protocolo para crear uno nuevo, o Adquirir > Editar Protocolo para modificar uno existente. En la pestaña de Modo de Adquisición , selecciona Estimulación Episódica. Pon Runs/Trial en 1 y Sweeps/Run en 1.
   5. Establece la duración del barrido a 4 s más larga que la duración total experimental. Para un protocolo STP de 120 s (60 s PPF + 60 s PPD), establezca la duración del barrido a 124 s para permitir 2 s de línea base antes y después del estímulo.
   6. En la pestaña de Entradas , asigna el canal de grabación a la entrada actual. En la pestaña Salidas , asigna el canal de estimulación a la salida de voltaje que controla los electrodos.
   7. Abre la pestaña de Forma de Onda . En la Columna A, se ajusta Tipo a Escalón, Primer Nivel a 0 mV y Primera Duración a 2000 ms para definir una línea base previa a la estimulación.
   8. En la Columna B (PPF), establece Tipo a Paso. Especifica la amplitud de tensión deseada (por ejemplo, +100 mV), la duración del pulso (por ejemplo, 100 ms) y la Tasa de Tren para establecer el intervalo entre pulsos correspondiente al ciclo de trabajo objetivo (por ejemplo, 90,9%).
   9. En la Columna C (PPD), se ajusta de forma similar Tipo a Paso con la misma amplitud y duración de pulso, pero aumentando la Tasa de Tren o el intervalo interpulso para lograr el ciclo de trabajo más bajo deseado (por ejemplo, 28,6%).
   10. En la Columna D, configura una línea base post-estimulación idéntica a la Columna A (0 mV, 2000 ms).
       NOTA: Si la duración total de todas las épocas en la pestaña de Forma de Onda supera la duración del barrido en la pestaña Modo/Tasa , aumenta ligeramente la duración del barrido hasta que el error se resuelva.
   11. Guarda el protocolo con un nombre descriptivo (por ejemplo, "STP_120s").
   12. Inicia la grabación de vídeo y luego inicia inmediatamente la adquisición/estimulación eléctrica haciendo clic en el botón círculo rojo "Grabar" para registrar datos. Alternativamente, configura un disparador digital para que el inicio de la estimulación active simultáneamente la grabación de vídeo y la adquisición eléctrica.
   13. Durante los primeros 60 s de estimulación (PPF), la respuesta de corriente medida generalmente aumenta desde el primer pulso y puede alcanzar un estancamiento visible por t = 60 s, mientras que en los últimos 60 s de estimulación (PPD), la respuesta a la corriente medida generalmente disminuye (Figura 5). Al final del protocolo, detener la adquisición eléctrica y la grabación de vídeo simultáneamente.
2. Experimentos de canal único
   1. En el panel frontal del amplificador de patch clamp, configura el interruptor de entrada de comando externo en OFF. Ajusta el voltaje de mantenimiento a +200 mV. Configura el filtro pasa bajos incorporado del amplificador a 1 kHz. En el software de adquisición, se ajusta la frecuencia de muestreo a 10–50 kHz y selecciona un modo de grabación continuo "sin huecos".
      NOTA: Altas tasas de muestreo pueden reducir la relación señal-ruido de los datos adquiridos. Es importante utilizar tasas de muestreo más altas al resolver transiciones rápidas de gating o estados de parpadeo de corta duración. Las vidas medias abiertas de la gramicidina A suelen estar en el rango de 0,1 s a 10 s, mientras que los estados parpadeantes pueden ocurrir en escalas temporales sub-ms y μs; por lo tanto, pueden ser necesarias tasas de muestreo de ~50 kHz para capturar tales^{eventos 36}. El análisis posterior de idealización de un solo canal con JSMURF permite una detección robusta de eventos en grabaciones con proporciones señal-ruido variables³⁷.
   2. Sin ningún comando externo aplicado, comienza a registrar la señal de corriente base. En el amplificador, cambia el comando de tensión de OFF a "+" para aplicar una tensión de +200 mV DC a través del DIB.
   3. Récord de ~15 s para capturar eventos de un solo canal mientras se limita la deriva base. A la concentración molar de lípido:gA de 1:5×^10-6_, la corriente registrada parece escalonada debido a la formación y eliminación de eventos de conductancia de canal.
   4. Antes de detener la grabación, cambia el comando de voltaje de "+" a APAGADO. Detener la adquisición de datos y guardar la grabación con un nombre descriptivo (por ejemplo, "DIB_C16_postPPF_200mV.abf").
      NOTA: Las grabaciones de un solo canal de duración definida también pueden realizarse mediante una Estimulación Episódica programada, con amplitud y duraciones fijas como se describe en la Sección 8 para PPF/PPD. Para experimentos de canal único "post-PPF", la estimulación episódica con una tensión DC de +200 mV se incorpora inmediatamente después de los 60 s de PPF.

9. Área de membrana y extrapolación de flujos

1. Al final de cada experimento en conjunto (STP, LTP/LTD), se mueve lentamente un electrodo lateralmente con los micromanipuladores para desprender el DIB.
2. Afloja el soporte del electrodo del micromanipulador y gira el electrodo en su soporte ~45° para que el hilo de plata de 125 μm quede en el plano de imagen.
3. Ajusta la altura del electrodo hasta que el alambre esté enfocado con precisión bajo el microscopio. Captura una imagen fija o captura de pantalla del cable plateado enfocado usando el software de la cámara. Guarda la imagen a escala para calibrar más adelante el tamaño del píxel a milímetros.
4. Procesar las trazas de corriente registradas según los procedimientos descritos en la ref. 28 para obtener datos continuos y libres de artefactos sobre corriente frente a tiempo (Figura 6A).
5. Determina el mapeo fotograma a tiempo dividiendo índices de fotogramas por la tasa de fotogramas medida y emparejando con las marcas de tiempo de adquisición.
6. Importa la imagen de calibración de la escala y los fotogramas de experimento en el software de análisis de imágenes.
7. Utiliza el diámetro conocido del alambre (125 μm) de la imagen de calibración de la escala para establecer la escala espacial usando la función de calibración por software (Analizar > Ajustar la escala).
8. Para cálculos de flujo para cada experimento, elige N puntos de tiempo que abarcan el periodo total de estimulación (por ejemplo, 30 puntos de tiempo sobre el experimento de 120 s). Asegúrate de que el primer punto de tiempo corresponda al primer pulso de estímulo.
9. En cada punto temporal, mide el diámetro del DIB dibujando una línea a través de la intersección del borde de la bicapa y registrando su longitud en unidades calibradas.
10. Convierta cada diámetro medido en área de membrana (A), asumiendo geometría circular o utilizando el factor geométrico de escala de la elipse apropiado para la configuración específica de lípido-aceite. Utilizar las áreas resultantes para evaluar la evolución del área de membrana a lo largo del tiempo para diferentes condiciones experimentales (Figura 6B).
11. Para cada punto temporal, divide el valor actual correspondiente por el área para obtener el flujo (I/A). Divide todos los N puntos de datos de flujo por el primer valor de flujo para obtener el flujo normalizado al primer pulso, (I/A) / (I₀/A_0), cuando se desea un análisis de flujo normalizado (Figura 6C).
12. Diagrama el flujo o flujo normalizado frente al tiempo o número de pulsos frente al tiempo. Análisis de flujo repetido para todos los experimentos de conjunto (STP, LTP/LTD) (Figura 6D).
13. Interpreta las elevaciones persistentes de flujo o flujo normalizado respecto al primer pulso durante la DPP o más allá de 2 minutos como conducción mejorada, mientras que los retornos a la línea base o disminuciones por debajo del valor del primer pulso indican conducción deprimida. Utiliza las escalas de tiempo resultantes para clasificar las respuestas como comportamientos similares a la plasticidad a corto plazo (<2 min) o comportamientos a largo plazo similares a la potenciación / depresión (> ~5 min).

10. Análisis de canal único

1. Importa grabaciones en bruto de un solo canal a un entorno de análisis preferido o a la interfaz clampSeg y consulta^{el 37} para descripciones completas y explicaciones de funciones de software.
2. Aplica un filtro digital pasa-bajos que coincida con el filtro de adquisición experimental (por ejemplo, Bessel de 1 kHz).
3. Configuración de parámetros.
   1. Establece alfa (α) = 0,05, definiendo el nivel de confianza estadística tal que cada paso detectado tiene <5% de probabilidad de ser una fluctuación aleatoria del ruido.
   2. Especificar 5.000-10.000 iteraciones de Monte Carlo por segmento de 1 s para estimar la distribución del ruido y mejorar la robustez estadística de la detección de eventos.
      NOTA: Utiliza procesamiento computacional paralelo por "chunks" de 1 s si está disponible para reducir el tiempo de análisis.
   3. Ejecuta el algoritmo JSMURF en la traza de corriente filtrada.
4. Validación del modelo.
   1. Superpone la traza idealizada de conductancia (onda cuadrada) sobre la traza de corriente filtrada y confirma visualmente que las transiciones escalonadas coinciden con cambios abruptos en la señal experimental.
   2. Utiliza las características conocidas del filtro pasa-bajos para generar una reconstrucción convolucionada de la traza idealizada y superponerla sobre la traza^{bruto 37}. Confirma que la señal reconstruida coincide estrechamente con el envolvente de temporización y amplitud de la corriente registrada.
5. Cuantificación de la conductancia y la duración de la vida.
   1. Defina la meseta estable más baja en la traza idealizada como el estado base cerrado. Identificar la primera amplitud de meseta distinta de cero como la conductancia primaria en estado abierto (nivel de canal único).
   2. Clasificar los múltiplos enteros superiores de esta amplitud como estados abiertos multicanal (2+, 3+, etc.). Identificar mesetas intermedias que sean estables pero inferiores a los niveles abiertos completos como estados de subconductancia.
   3. Extrae la amplitud y duración de cada evento de la traza idealizada y binízalas para generar histogramas de amplitud de conductancia y histogramas de por vida.
6. Histogramas de amplitud y distribuciones de vida útil
   1. Compare los histogramas idealizados de conductancia-amplitud con los histogramas de amplitud generados directamente a partir de los datos filtrados. Confirmar que los histogramas idealizados muestran picos más nítidos y mejor separados correspondientes a los estados de conductancia^{discreta 37}.
   2. Para cada condición experimental, se calcula la función de supervivencia N(t)/N(0), donde N(0) es el número total de eventos abiertos (pleno y subconductancia) y N(t) es el número de eventos con duraciones mayores que t. Excluye los intervalos de estado cerrado de este análisis.
   3. Grafica N(t)/N(0) frente al tiempo y ajusta funciones de decaimiento exponencial usando una rutina de mínimos cuadrados no lineales en un software preferido.
   4. Interpretar los desplazamientos a la derecha en los picos de distribución de conductancia en histogramas de amplitud como un aumento de la conductancia, constantes de tiempo de decaimiento más largas en N(t)/N(0) frente a gráficos de tiempo como mayor estabilidad en estado abierto, y distribuciones desplazadas a la izquierda como vidas útiles de canal más cortas.
      NOTA: Minimizar las perturbaciones ambientales como corrientes de aire, vibraciones y objetos en movimiento cercanos. Evita apoyarte en la mesa óptica y mantén las conversaciones alejadas del montaje experimental. Mantén los teléfonos móviles, tabletas, portátiles y otros dispositivos electrónicos personales al menos a 1,5 m de distancia de la jaula de Faraday para reducir las interferencias electromagnéticas. Utiliza un depósito de aceite ópticamente transparente y optimiza la iluminación y el contraste del microscopio para afilar los bordes de las gotas y las bicapas. Adquiere y/o exporta vídeos en escala de grises si mejora el contraste de los límites y simplifica las mediciones manuales del diámetro del DIB. Para experimentos que no investiguen efectos de la temperatura, asegúrate de que el entorno del laboratorio, el soporte del microscopio y el aceite se mantengan a 21–22 °C.

Results

Montaje experimental DIB
El sistema de grabación está alojado dentro de una jaula de Faraday sobre una mesa antivibración, con datos eléctricos y de vídeo adquiridos por dos ordenadores separados (Figura 1A), aunque se puede utilizar un solo ordenador con capacidad de pantalla dividida. El entorno de muestra DIB consiste en dos electrodos recubiertos de agarosa sumergidos en un volumen definido de aceite de alcano (Figura 1B). Figura 1C muestra un esquema de las conexiones eléctricas y ópticas esenciales para la configuración experimental descrita en este manuscrito.

Figura 1: Montaje experimental. (A) Mesa antivibración y caja de jaula de Faraday con componentes principales indicados, incluyendo amplificador, digitalizador, filtro de ruido, generadores de funciones e interfaz de doble ordenador para adquisición eléctrica y de vídeo. (B) Vista frontal superior del entorno de la muestra DIB y los electrodos. (C) Esquema de las conexiones eléctricas y ópticas asociadas con el montaje experimental descrito en este manuscrito. Todos los componentes individuales comparten un terreno común en el edificio del laboratorio. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (21–22 °C). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Preparación y control de calidad de electrodos Ag/AgCl
Fundiendo la punta de alambre de plata se forma una bola esférica (Figura 2A); los fundidos de mala calidad parecen alargados o irregulares. La cloración en lejía produce una superficie opaca de Ag/AgCl marrón gris (Figura 2B). Una capa fina y uniforme de agarosa, del orden de decenas de micrómetros de grosor en la bola, es esencial para un soporte estable de gotas y un acoplamiento electroquímico de baja impedancia, mientras que un recubrimiento desigual provoca una mala fijación de gotas (Figura 2C).

Figura 2: Preparación de electrodos. (A) Imágenes microscopicas de electrodos fundidos de buena y mala calidad. (B) Comparación de cabezas de electrodos no clorados y clorados. (C) Ejemplos de recubrimientos de agarosa de buena y baja calidad. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Montaje de electrodos. (A) Vista superior de la alineación del ángulo de electrodos montada. (B) Vista lateral de comparar gotas no caídas inmediatamente después de la carga de LUV con gotas caídas tras la formación de una monocapa. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Posicionamiento de los electrodos y comportamiento de caída de gotas
Las vistas cenitales muestran la posición angular adecuada de los electrodos para minimizar la distorsión óptica (Figura 3A). Las vistas laterales comparan gotas no caídas (inmediatamente después de la carga de la solución de LUV) y gotas recubiertas de lípidos (tras 5 minutos) (Figura 3B). Las gotas caídas utilizadas para formar un DIB presentan una respuesta física retrasada al movimiento debido a una disminución significativa de la tensión superficial de las monocapas lipídicas, lo que confirma visualmente la formación de una gota acuosa suspendida completamente recubierta por una monocapa lipídica. Una vez establecido el slack, se utiliza la estimulación de ondas triangulares para proporcionar confirmación eléctrica de la formación de la bicapa y la estabilidad³⁵.

Figura 4: Formación de bicapas de interfaz de gotas. (A) Secuencia de lapso de tiempo que muestra la formación y expansión de la bicapa tras el contacto de las gotas. (B) Reflexión interna de membrana utilizada para estimar el diámetro y el área de la bicapa. La imagen DIB se realiza desde debajo del montaje mediante un microscopio invertido. Barra de escala = 50 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Formación de DIB y medición de área
Las imágenes secuenciales capturan el "zipping" espontáneo de las dos capas y la expansión del área cuando dos gotas caídas entran en contacto (Figura 4A). Las brillantes reflexiones ovaladas internas en el contacto de las gotas se utilizan para estimar el diámetro de la bicapa y, por extensión, el área de la membrana a lo largo del tiempo (Figura 4B).

Figura 5: Protocolo STP: estimulación y respuesta. Se muestran respuestas representativas de corriente durante la facilitación de pulsos emparejados (PPF, 0–60 s, rojo) y la depresión de pulsos emparejados (PPD, 60–120 s, azul) (arriba), junto con el protocolo de estimulación correspondiente (abajo). Los pulsos PPF y PPD duran 100 ms con tiempos de OFF de 10 ms y 250 ms, respectivamente, lo que da ciclos de trabajo del 90,9% y 28,6%. La facilitación corresponde a aumentos netos de la corriente iónica; La depresión corresponde a disminuciones netas. Las respuestas actuales solo se registran durante los periodos de ON; Para la visualización, los datos entre pulsos se interpolan para resaltar las tendencias generales en la corriente. Los esquemáticos, duraciones y el número de pulsos dentro de las fases PPF y PPD no se dibujan a escala y se ilustran con fines de visualización. Datos representativos de respuesta corriente reproducidos de Podar PT et al.,²⁵ bajo CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 El(los) autor(es). Publicado por PNAS. Esquema de estimulación modificado para el presente manuscrito. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Protocolo de estimulación eléctrica para inducir comportamientos similares a la plasticidad a corto plazo (similares a STP)
Los patrones de estimulación aquí denotados representan la facilitación del pulso pareado (PPF) y la depresión (PPD) por analogía con la terminología neurocientífica, similar a Koner y Najem^28,29. La facilitación de pulsos emparejados (PPF; 0–60 s) y la depresión de pulsos emparejados (PPD; 60–120 s) se realizan mediante pulsos de 100 ms con tiempos de apagado de 10 ms y 250 ms, respectivamente, correspondientes a ciclos de trabajo del 90,9% para PPF y 28,6% para PPD. El panel superior muestra respuestas representativas de corriente durante los periodos de ON, mientras que el panel inferior muestra el patrón de estimulación.

Corriente, área y flujo iónico durante la STP y la posterior estimulación a largo plazo
La corriente normalizada (I/_{I 0}) para las bicapas DPhPC dopadas con gA en aceites C16 y C12/C16 se muestra durante PPF y PPD (Figura 6A). El área normalizada de la membrana (A/_{A 0}) medida en 30 puntos temporales revela una evolución similar del área en ambas condiciones de aceite a pesar de las corrientes diferentes (Figura 6B). Los datos para corriente y área normalizados se representan como media ± nubes y barras de S.D., respectivamente, a lo largo de 28 DIBs independientes por condición de petróleo. El flujo normalizado, J/_{J 0} = (I/_{I 0})/(A/_{A 0}), separa los cambios de conductancia independientes del área y es consistente con cambios en la conducción de membrana más allá de la simple expansión de área (Figura 6C). Sin embargo, estos cambios pueden reflejar contribuciones tanto de la conductancia de un solo canal como del número de canales conductores activos. La estimulación prolongada de la DPP durante hasta 30 minutos produce un comportamiento prolongado similar a la depresión (LTD) en las membranas C16, pero mantiene un flujo elevado, consistente con un comportamiento similar al LTP en las membranas C12/C16 (Figura 6D). En conjunto, estos datos muestran que la composición de la membrana modula tanto los cambios de plasticidad a corto como a largo plazo, similares a los del flujo iónico.

Figura 6: Corriente, área y flujo iónico calculado de DIBs durante STP y transición a LTP/LTD. (A) Corriente normalizada (I/I₀) durante PPF (0–60 s, fondo blanco) y PPD (60–120 s, fondo gris) para membranas DPhPC dopadas con gA en aceites C16 (naranja) y C12/C16 (azul), con cada condición comprendiendo n = 28 DIBs formados de forma independiente. (B) Áreas de membrana normalizadas (A/A₀), medidas en 30 puntos temporales, mostrando trayectorias de área comparables a pesar de las diferentes respuestas de la corriente; los datos se muestran como media ± S.D. en el mismo n = 28 DIBs independientes por condición de aceite. (C) El flujo normalizado, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)), se calcula a partir de las correspondientes mediciones de corriente y área, destacando cambios en la conductancia más allá de los efectos de área. (D) Comportamiento a largo plazo bajo estimulación prolongada de DPP: tras los 120 s iniciales de STP (sombreado en gris), los DIB se sometieron a 30 minutos de PPD con pulsos ON = 100 ms y OFF = 250 ms (rojo/verde sólido) o 30 s (naranja/gris). El flujo decae hasta o por debajo del nivel basal en las membranas C16, lo que indica un comportamiento similar al LTD, pero permanece elevado en las membranas C12/C16, lo que indica un comportamiento persistente similar al LTP. Las regiones sombreadas representan el error propagado de I/I₀ y A/A₀. Se obtuvieron conjuntos de datos de PPD extendida en (D) a partir de n = 6 DIBs independientes por condición de aceite para el protocolo 120 s, seguidos de 3 DIBs por condición PPD extendida. Todos los puntos de datos están conectados solo con fines de visualización. Las viñetas A, B y D se reproducieron bajo CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 El(los) autor(es). Publicado por PNAS. El Panel C fue generado de nuevo para el presente manuscrito a partir de datos reportados en Podar PT et al.,²⁵. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Traza representativa de corriente de canal único de 15 s de un DIB dopado con gA formada en aceite C16 tras estimulación con PPF
La traza incluye la señal cruda capturada a 50 kHz con un filtro pasa-bajos de 1 kHz, una traza de 8 polos filtrada por Bessel a 250 Hz y el ajuste idealizado de JSMURF. El nivel estable más bajo define el estado cerrado, y los niveles superiores corresponden a eventos de canal único, multicanal y subconductancia. Estas trazas proporcionan la base para el análisis de amplitud y vida útil de conductancia. El ejemplo de tiempo de permanencia en estado de conductancia indicado representa la duración de un nivel específico de conductancia, cuya amplitud y duración reflejan la contribución combinada de múltiples eventos simultáneos de pleno y/o subconductancia.

Distribuciones de amplitud y vida útil de la conductancia
Los histogramas de amplitud de conductancia para membranas C16 y C12/C16 (Figuras 7A–B) comparan las condiciones pre-PPF y post-PPF en una proporción molar DPhPC:gA de 1:5×^10-6. Las aproximaciones gaussianas a continuación de los datos indican desplazamientos en los picos medios de conductancia tras la PPF y resuelven picos separados correspondientes a estados de subconductancia y multicanal. Se realizaron comparaciones estadísticas de distribuciones de conductancia sobre datos agrupados a nivel de evento utilizando la prueba t de Welch y la prueba U de Mann-Whitney (α = 0,05), con cada condición comprendiendo 3 registros DIB independientes y N para un estado de conductancia dado que denotaba el número total de eventos detectados agrupados en esos registros. Las distribuciones de probabilidad a lo largo de la vida, N(t)/N(0), antes y después (Figura 7C–D) muestran que las membranas C12/C16 desarrollan distribuciones de conductancia con cola más larga y tiempos de vida alterados en relación con C16, lo que indica cambios en la estabilidad del canal. Los datos del histograma representan la traza filtrada de 15 s (traza roja) adquirida para cada condición. Las distribuciones de vida útil del estado de conductancia se generaron a partir de 3 registros DIB independientes por condición; Las curvas punteadas denotan réplicas individuales, y las curvas sólidas denotan ajustes exponenciales globales a N(t) / N(0) frente a t.

Figura 7: Histogramas de amplitud de conductancia y distribuciones de tiempo de permanencia en estado de conductancia. Los histogramas de amplitud de conductancia para la actividad de gA en las membranas (A) C16 y (B) C12/C16 comparan condiciones pre-PPF (gris) y post-PPF (naranja / azul) a una proporción molar de 5 × 10-6 gA:lipídicos. Las aproximaciones gaussianas bajo los histogramas indican desplazamientos en picos de conductancia media y desviaciones estándar para estados de canal único y múltiple. Los desplazamientos en la conductancia media después de la PPF se indican con líneas discontinuas (negro = antes de la FPP; azul/naranja = después de la FPP) y flechas. Cada condición representa 3 grabaciones DIB independientes. Se realizaron comparaciones estadísticas de distribuciones de conductancia sobre datos agrupados a nivel de evento utilizando la prueba t de Welch y la prueba U de Mann-Whitney (α = 0,05), donde N para un estado de conductancia dado denota el número total de eventos detectados sumados en esos tres registros. También se incluyeron eventos de subconductancia en el análisis, con distribuciones representativas de subconductancia indicadas a la izquierda del primer pico en estado abierto para cada condición de membrana. Las distribuciones de probabilidad a lo largo de la vida de los eventos en estado de conductancia en las membranas C16 (C) y C12/C16 (D) antes (naranja / azul) y después de la estimulación PPF (naranja oscuro / azul oscuro) a 5×10-6 M gA:lípidos corresponden a los análisis de conductancia mostrados en la Figura 7A–B. Aquí, N(t) representa el número acumulado de eventos completos y de subconductancia con duraciones mayores que el tiempo t. Las líneas punteadas denotan distribuciones de vida útil de réplicas individuales (n = 3 DIBs independientes por condición), y los insertos sólidos muestran ajustes exponenciales globales realizados mediante software de ajuste de curvas no lineales. Los paneles A–D reproducidos de Podar PT et al.,²⁵ y compilados para el presente manuscrito bajo CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 El(los) autor(es). Publicado por PNAS. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8: Exploración del comportamiento de un solo canal—traza de respuesta actual para DIBs en C16 tras la estimulación PPF. (A) Ejemplo 15 s traza de corriente mostrando datos en bruto (azul), filtrado con un filtro pasa-bajos Bessel de 8 polos de 250 Hz (rojo), y la traza idealizada (verde) usada para identificar estados de conductancia. El nivel estable más bajo define el estado "cerrado" de referencia. (B) Niveles representativos de subconductancia detectados entre el^{segundo y el} tercer nivel^{de conductancia} completa, corroborados por picos intermedios distintos en el histograma de amplitud (véase la Figura 7A, naranja). Los tiempos de permanencia de conductancia se extraen de la duración de cada nivel de conductancia identificado (excluyendo el estado cerrado) para generar distribuciones de N(t)/N(0) durante la vida útil. Reproducido de Podar PT et al.,²⁵ bajo CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 El(los) autor(es). Publicado por PNAS. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tras la PPF, las membranas C12/C16 muestran un marcado desplazamiento hacia la derecha en las distribuciones de amplitud de conductancia, lo que indica una conductancia mejorada en un solo canal, acompañado de un desplazamiento hacia la izquierda en las distribuciones de vida útil del estado de conductancia, consistente con tiempos de apertura de canal más cortos. Estos cambios son consistentes con el adelgazamiento electromecánico de la bicapa C12/C16 durante la PPF, como respaldan mediciones mecánicas y de espesor directas reportadas en la ref. 25, que reducen la barrera energética para el transporte iónico a través de gA y aumentan el rendimiento iónico por apertura mientras reducen la estabilidad del canal. En contraste, las membranas de C16 muestran cambios mínimos en ambas distribuciones, lo que pone de manifiesto su limitada adaptabilidad estructural. En conjunto, estos resultados demuestran que la plataforma DIB captura tanto correlatos de conjunto como de canal único de la adaptación electromecánica de membrana, incluyendo cambios similares a STP y similares a LTP/LTD derivados de dinámicas dependientes de la composición de la membrana (Figura 8).

Discussion

En términos prácticos, este método proporciona tres capacidades experimentales clave: variación controlable de la composición de bicapas a través de la composición lipídica y la fase aceitosa, monitorización óptica y eléctrica simultánea de la reestructuración de membranas, y acceso a un régimen de área de membrana que conecta la electrofisiología de un solo canal y la mecánica de membranas^{a mesoescala} 14,15,20,21,25 . Estas características hacen que el método sea especialmente útil para estudios estructura-función en sistemas de membranas simplificados, donde la electromecánica de membranas, más que la complejidad celular completa, es la perspectiva experimental de^interés 14,15,20,21,25,39.

Este protocolo describe el ensamblaje y análisis de DIBs dopados con gramicidina A en aceites de alcanos para investigar la capacidad de las membranas lipídicas para reestructurarse bajo estimulación eléctrica fisiológicamente^relevante 14,15,25,35,38. En comparación con las técnicas de pinza de parches²¹, la plataforma DIB interroga parches de membrana que son órdenes de magnitud más grandes manteniendo una resolución suficiente para capturar eventos discretos de canales^iónicos 14,15,19,20,21,28,38 . Esta capacidad es especialmente valiosa para resolver remodelaciones electromecánicas a mesoescala (por ejemplo, electrohumectación y electrocompresión) y vincularlas con el comportamiento de canales microscópicos que, en conjunto, dan lugar a fenotipos de conductancia de membrana similares a STP, LTP y LTD bajo estimulación fisiológicamente^inspirada 13,25,27,38 . El sistema DIB actual no está destinado a replicar la complejidad molecular de las sinapsis^biológicas 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . En consecuencia, términos como STP, LTP, LTD, PPF y PPD se utilizan en un sentido descriptivo y basado en analogías para denotar aumentos y disminuciones en escalas de tiempo cortas y largas en la conducción iónica de membrana bajo protocolos de estimulación definidos. Por tanto, los hallazgos principales de este trabajo se interpretan de forma más directa en términos de electromecánica de membranas, adaptación de conductancia y reestructuración fuera del equilibrio dependiente de la composición en DIBs, lo que puede ofrecer analogías conceptuales útiles y perspectivas físicas sobre la plasticidad sináptica sin implicar equivalencia mecanicista con circuitos neuronales o regulación sináptica^bioquímica 10,11,25,38.

Varios pasos técnicos son fundamentales para obtener resultados reproducibles. Una preparación cuidadosa del electrodo Ag/AgCl, que incluye la fusión uniforme de la punta esférica de plata, una cloración exhaustiva y una capa fina y uniforme de agarosa, asegura una fijación estable de gotas y un acoplamiento electroquímico de baja^{impedancia 20,35}. La confirmación visual del hundimiento de las gotas y la correcta orientación del electrodo minimizan la distorsión óptica durante la grabación de vídeo y mejoran la precisión de las mediciones del área de membrana. La calibración a escala posterior a la adquisición utilizando el diámetro conocido del alambre de plata proporciona una conversión robusta de píxel a milímetro, esencial para un cálculo fiable del área de membrana y el flujo de iones. En este trabajo, la conductancia de membrana (flujo) se define como corriente por unidad de área (I/A), y dado que el área DIB cambia durante el electrohumectado, la cuantificación precisa del flujo requiere mediciones de corriente y área de bicapa adaptadas^{en el tiempo 13,25,27,35}.

Este enfoque también soporta lecturas complementarias a nivel de conjunto y de canal único dentro de la misma plataforma 14,15,20,25,35,38. A nivel de conjunto, las grabaciones sincronizadas de vídeo y eléctricas cuantifican los cambios dinámicos en área (electrowetting) y corriente, de los cuales se deriva el flujo iónico (corriente/área). Bajo estimulación eléctrica, las membranas se llevan a estados estacionarios fuera del equilibrio (NESS), donde la reestructuración de membranas dependiente de la composición genera respuestas similares a la plasticidad en escala temporal corta que pueden evolucionar hacia comportamientos similares a la potenciación o depresión a escalas temporales más largas durante períodos prolongados (min^{)25,26,28,29,30,31,32,33,38}. A nivel de canal único, el análisis consiste en idealizar las trazas de corriente en niveles de conductancia escalonados (cerrado, de canal único, multicanal y estados de subconductancia). Las herramientas tradicionales de idealización de ondas cuadradas suelen resolver solo un número limitado de niveles discretos; para datos más complejos o ruidosos, se prefieren métodos de idealización sin modelo como^{JSMURF 37}. Los breves potenciales de retención DC analizados con JSMURF proporcionan una detección estadísticamente rigurosa de eventos bajo ruido heterogéneo, produciendo histogramas de conductancia-amplitud (niveles enteros y subconductancia) y distribuciones de N(t)/N(0) durante la vida útil. Superponer histogramas de amplitud idealizados y filtrados permite la validación cruzada visual y cuantitativa de asignaciones de estado de conductancia, mientras que las reconstrucciones convolucionadas (trazas idealizadas pasando por el filtro pasa-bajos conocido) confirman la elección de parámetros y la fidelidad de eventos³⁷.

La composición de membranas, ajustada aquí a través de la fase aceitosa circundante (por ejemplo, C16 frente a C12/C16), se espera que module la viscoelasticidad y la capacidad de reestructuración de las dos capas bajo estimulación eléctrica, coherente con mediciones directas reportadas en trabajos^previos 22,25,39. Se espera que las membranas más flexibles muestren un mayor adelgazamiento impulsado por la CE y una mejora de la compatibilidad hidrofóbica con gA durante^PPF 22,23,25, lo que lleva a un aumento de la conductancia y facilitación de un solo canal que puede estabilizarse como comportamiento similar al ^{LTP 25,38}. Por el contrario, las membranas más rígidas muestran una respuesta estructural limitada, cambios menores en la conductancia durante la PPF y la DPP, y una tendencia a la LTD bajo pulsaciones prolongadas. Estos resultados dependientes de la composición destacan cómo las propiedades materiales predisponen a las membranas hacia regímenes distintos y funcionalmente relevantes a largo plazo 22,23,25,39.

La plataforma DIB también tiene limitaciones^{importantes 21}. La interpretación mecanicista que se presenta aquí es que las diferencias en la composición del aceite alteran las propiedades de los materiales en bicapa y la susceptibilidad a la reestructuración electromecánica, lo que a su vez modula la conducción A^{de la gramicidina} 22,23,25. Esta interpretación está respaldada por el estudio previo, que midió directamente la viscoelasticidad de la membrana, la tensión interfacial, así como los cambios dinámicos en el grosor de la membrana bajo estas condiciones y la^{estimulación 22}. Sin embargo, en el presente trabajo, estas propiedades materiales no se midieron simultáneamente en cada experimento y, por tanto, se utilizan aquí para apoyar las diferentes respuestas estructurales y mecánicas a la estimulación eléctrica de membranas en entornos C16 y C12/C16, en lugar de establecer de forma independiente la interpretación mecanicista de los datos. Además, la corriente y el flujo de conjunto pueden reflejar tanto cambios en la conductancia de un solo canal como cambios en el número de canales conductores, que pueden variar con el área de membrana, la difusión peptídica y la dimerización bajo condiciones fuera del^equilibrio 17,18,22,23. La fase aceitosa circundante también puede infiltrarse o retroceder dinámicamente del núcleo de la bicapa durante la estimulación, contribuyendo a la deriva base en registros de canal único y a cambios graduales en la composición de la membrana a lo largo del^tiempo 13,21,25. En conjunto, estos factores limitan el uso de grabaciones de voltaje constante de larga duración para definir propiedades estáticas de membrana y enfatizan que los DIB se comportan como sistemas abiertos y dinámicos en lugar de membranas de equilibrio cerrado 13,21,25. Así, aunque el protocolo actual captura cambios en la conducción dependientes de la estimulación y similares a la plasticidad durante las escalas de tiempo experimentales^{previstas 25,38}, serán necesarios futuros estudios que combinen mediciones mecánicas directas con registros eléctricos y ópticos simultáneos, potencialmente junto con imágenes de molécula única basadas en fluorescencia, para resolver más plenamente las respectivas contribuciones de la reestructuración de membranas, la conductancia de canales y la población de canales^21,25.

Los modos de fallo comunes incluyen la fijación inestable de las gotas, el hundimiento incompleto de las gotas, la coalescencia prematura de las gotas durante la formación de la bicapa y la mala definición óptica del borde de la bicapa durante el análisis de área. La fijación inestable de gotas suele ser causada por una geometría irregular de bola de plata o un recubrimiento desigual de agarosa y puede reducirse verificando la simetría de la bola y manteniendo una cáscara lisa de agarosa. La carga de electrodos también requiere la deposición manual de gotas acuosas del tamaño de nanolitros sobre una cabeza de electrodo submilimétrico, lo que exige una considerable coordinación mano-ojo y percepción de profundidad a través de medios con diferentes índices de refracción (aire frente a aceite). Como resultado, la punta de la pipeta puede contactar accidentalmente con la carcasa de agarosa o fallar la cabeza del electrodo durante la dispensación. Técnicas para mejorar la estabilidad, como el uso de férulas de muñeca, el avance lento de la pipeta en aceite y la retención de la respiración, junto con la práctica repetida, pueden mejorar la destreza en la carga. Además, el aplombamiento incompleto o la formación tardía de monocapas pueden deberse a la heterogeneidad de la vesícula, variación de temperatura o topografía de agarosa, y pueden mejorarse aumentando el tiempo de espera tras la deposición de^gotas 15,20,35. La coalescencia durante la formación de la doble capa se asocia frecuentemente con un área de contacto excesiva o una estimulación eléctrica excesivamente agresiva (> ± 200 mV) y puede mitigarse utilizando áreas de contacto inicial de gotas más pequeñas, permitiendo tiempo adicional para la estabilización de la monocapa y verificando la respuesta de capacitancia triangular de baja amplitud antes de pulsar 25,35,38.

A pesar de estas limitaciones, la plataforma DIB es altamente ajustable, escalable y^reproducible 14,15,20,21,25,35,38,40, y complementa la electrofisiología centrada en proteínas aislando la contribución de la mecánica lipídica a la conducción 22,23,25. Al unificar mediciones de conjunto y de canal único en un solo sistema, este protocolo proporciona una vía práctica para analizar cómo el trabajo eléctrico y la viscoelasticidad de membrana se combinan para producir un comportamiento conductor similar a sináptico (similares a STP, LTP y LTD) en un modelo controlable y de abajo^{hacia arriba 25,29,30,31,32,33,38}. Por ello, la metodología ofrece una base para la exploración sistemática de reglas de aprendizaje dependientes de la composición en membranas y para cuantificar cómo las fuerzas mecánicas y eléctricas acoplan las proteínas de membrana a su bicapa huésped a lo largo de las escalas temporal y^espacial 21,22,23,25 . En conjunto, estas capacidades sitúan a los DIB como un marco poderoso para deconstruir comportamientos neurobiológicos complejos en mecanismos biofísicos manejables y^comprobables 10,11,25,38.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-difitanoio-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC)	Lípidos polares Avanti	850356P/850356C	Comprado en polvo liofilizado (P) o en cloroformo (C)
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Agarosa (tabletas de agarosa de 0,5g)	Índice de referencia	A2501	Puedes usar la forma en polvo o las tabletas
Generador de formas de onda Agilent Technologies 33522A	Keysight	–	Puedes usar cualquier generador de formas de onda con salidas de cable BNC
Gas argón (Ar)	Airgas	AR UHP300; 72-402221259-1	Argón comprimido; Ultra Alta Pureza
Balance analítico y nbsp;	Mettler Toledo	Modelo: MS304S/03	Cualquier balance analítica de laboratorio con precisión de 0,0001 g
Amplificador Axopatch 200B	Dispositivos moleculares	–
BK Precision 4017B 10 MHz generador de barrido/función de DDs	Digi-Key	BK4017B-ND
Capilares de vidrio borosilicato	Instrumentos de Precisión Mundial	1B100F-4
Clampex pCLAMP 11 Software Suite	Dispositivos moleculares	–
Sistema DigiData 1550B	Dispositivos moleculares	–	Esto incluye un mini-extrusor, 2 jeringuillas, 100 membranas PC, 100 soportes de filtro y 1 soporte/bloque calefactor
Dodecano, 99%	Sigma-Aldrich	112-40-3
Set de extrusores con soporte/bloque calefactor y nbsp;	Lípidos polares Avanti	610000
Software de Fiyi	ImageJ	–
Congelador (-80 ºC; C)	Fisher Scientific	Isotemp; Modelo: 8964; N.P.: 828278-21
Cristalería	VWR Internacional	–
Gramicidina-A	Millipore Sigma	368020
Hexadecano, 99%	Sigma-Aldrich	544-76-3
Eliminador de ruido de insectos (60Hz)	Sistemas A-M	726300
Sistema de microscopio invertido (Nikon Ti2-A)	Nikon	–	Se puede utilizar cualquier microscopio invertido o vertical
Alcohol isopropílico	VWR Internacional	BDH1133-4LP
Soporte de microelectrodos y nbsp;	Instrumentos de Precisión Mundial	MEH1S
Micromanipuladores	Instrumento Sutter	MP-285	Se pueden usar manipuladores manuales
Cámara de microscopio	Olimpo	DP74
Microsoft Excel	Microsoft	–
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Software de cámara para microscopio NIS-Elements	Nikon	–	Se puede utilizar software de captura de cámara con capacidad de visualización en directo y/o vídeo. La visualización en directo y la grabación simultánea de pantalla pueden usarse para sustituir la captura de vídeo.
Película de laboratorio multiusos Parafilm M	Parafilm	PM999
Placa de Petri	-	-	El plato debe ser transparente en la parte inferior y, idealmente, también en la pared lateral
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Guantes de examen de nitrilo blando sin polvo y nbsp;	VWR Internacional	CA89-38-272
Refrigerador (4 y grados; C)	Fisher Scientific	CATA Nº: 97-938-1; Modelo NO: 3556FS
Alambre de plata	GoodFellow	147-346-94
Placa de calentamiento para agitar	Thermo Scientific y nbsp;	SP131325